一种木质纤维素类物质联产生物乙醇和普鲁兰糖的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用木质纤维素类物质联产生物乙醇和普鲁兰糖的方法。纤维素类物质经碱法预处理、木聚糖酶酶解，固液分离后分别得到半纤维素水解液（木糖液）和固相残渣。固相残渣再经木质素提取后得纤维素残渣。木糖液直接用于普鲁兰糖发酵生产（得率≥0.29g普鲁兰糖/g木糖），纤维素残渣进行同步糖化发酵生产乙醇。含普鲁兰糖发酵液使用纤维残渣发酵蒸馏所得乙醇进行醇沉，提取精制得普鲁兰糖产品，纯化过程中产生的含乙醇废液与纤维素残渣乙醇发酵液合并，经蒸馏实现乙醇的回收利用。本发明可实现半纤维素和纤维素的充分利用和高值转化，并且能够节约利用资源，达到保护环境和提升经济效益的目的。
【专利说明】一种木质纤维素类物质联产生物乙醇和普鲁兰糖的方法
【技术领域】:
[0001]本发明属于纤维物质生物转化【技术领域】，具体涉及一种利用木质纤维素类物质联产生物乙醇和普鲁兰糖的方法。
【背景技术】:
[0002]木质纤维素类物质由纤维素、半纤维素、木质素等三部分构成，它是地球上储存量最大、分布最为广泛的可再生资源。近年来，随着矿物质燃料的日益枯竭，木质纤维素类物质的利用受到人们的普遍重视。我国是一个传统农业大国，纤维素类物质的含量相当丰富。但是长久以来，这些资源未被合理利用，秸杆、甘蔗渣、玉米芯、稻草等富含纤维素类物质的农业废料一般直接焚烧或丢弃处理，这种原始的处理方式不仅造成了巨大的资源浪费，而且会给环境带来极大的污染。采用微生物转化的方式能够提高木质纤维素类物质的利用率。
[0003]生物乙醇生产是国际上最普遍的木质纤维素生物炼制方式。传统的生物乙醇生产技术不能将木质纤维素类物质中的半纤维素和纤维素有效分离，得到的水解液是五碳糖和六碳糖的混合液，受葡萄糖阻遏效应，木糖乙醇发酵效率低等因素的影响，水解液中的木糖部分通常不能被有效利用。将木质纤维素类物质中的半纤维素和纤维素先分离，然后分别进行发酵生产已经成为一个发展方向。已有分别利用木质纤维素组分中的纤维素和半纤维素发酵生产乙醇和2，3-丁二醇的报道。但是，这两种产物的附加值均不高，且2，3-丁二醇的分离纯化工艺较为复杂，纯化过程需要消耗大量能量。
[0004]出芽短梗霉，一种类酵母菌，能够利用木糖生产价值很高的普鲁兰糖。普鲁兰糖是一种呈白色粉末状的胞外同聚多糖。普鲁兰糖是由α- (1，4)和α- (1，6)糖苷键构成的麦芽三糖不断聚合而成的。规整的化学结构赋予普鲁兰糖特殊的性质，它在化工、食品、医药等行业都有着广泛的应用。出芽短梗霉可利用碳源较广，除了木糖以外，葡萄糖、乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等都能被它利用。因而，将出芽短梗霉用于半纤维素水解液的生物转化具有天然的优势，能够最大限度的将半纤维素水解液中的糖类物质加以转化。普鲁兰糖的纯化工艺也相对简便，但是在纯化过程中需要消耗大量的乙醇，这就使得普鲁兰糖的生产成本过于闻昂。
【发明内容】
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[0005]本发明的目的是解决现行纤维素类物质生物转化过程中木糖无法有效利用，普鲁兰糖生产成本过高等问题，提供了一种木质纤维素类物质联产生物乙醇和普鲁兰糖的方法。
[0006]本发明技术方 案包括如下步骤:纤维素类物质经碱法预处理、木聚糖酶酶解，固液分离后分别得到低毒的半纤维素水解液(木糖液)和纤维素残渣。半纤维素水解液直接用于普鲁兰糖发酵生产，纤维素残渣进行同步糖化发酵生产燃料乙醇。含普鲁兰糖发酵液使用纤维残渣发酵蒸馏所得乙醇进行醇沉，提取精制得普鲁兰糖产品，纯化过程中产生的含乙醇废液与纤维素残渣乙醇发酵液合并，经蒸馏实现乙醇的回收利用。
[0007]具体步骤如下:
[0008]第一、半纤维素水解液制备:
[0009]纤维物质原料除杂、粉碎至20-30目后，按固液比为1:12-1:15 (g/mL)的量加入0.5-0.8%的NaOH溶液，40 °C条件下预处理l_3h。将预处理后的纤维素类物质洗至中性，按固液比1:15-1:18 (g/mL)将原料投入pH4.5-5.5的酶解缓冲水溶液中，按100-200IU/g原料加入市售木聚糖酶，同时添加表面活性剂RH (鼠李糖脂)0.005-0.01%、Tween-800.15-0.35%、PEG60000.2-0.35%、Triton X-100 (曲拉通 X-100) 0.1-0.30%、并于38-40°C条件下酶解36-72h，将酶解体系进行固液分离，得半纤维素水解液和固相残渣。 [0010]纤维物质为甘蔗渣、玉米芯、玉米秸杆、稻草、麦杆中至少一种。
[0011]第二、木质素的提取与纤维素残渣制备:
[0012]将第一步所得固相残渣按照固液比为1:12-1:18 (g/mL)的比例加入木质素提取混合液，混合液的组分为甲酸:乙醇为9:l(v/v)，温度为80-90°C，反应时间为2-4h。木质素提取之后的残渣即为纤维素残渣。
[0013]第三、半纤维素水解液普鲁兰糖发酵:
[0014]将第一步得到的半纤维素水解液蒸发浓缩，调整初始糖浓度，补充硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、酵母浸粉后，将出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans) CGMCCN0.7154种子液体按5-10%接种量接入到发酵罐中，培养温度26-28°C，转速200-400r/min，通气量1.0-2.5vvm，pH控制在5.0-5.5，罐压0.02-0.03Mpa，培养24h后加入二硫苏糖醇至浓度为1.0-2.0mM。发酵过程通过流加混合氮源控制溶氧，所述流加混合氮源中酵母粉和硫酸铵的浓度均为10g/L，当溶氧水平上升到60-70%以上时，向发酵罐中添加适量的混合氮源，使得溶氧水平降至40-45%以下，在整个补料过程中，酵母粉和硫酸铵按1:1的比例流加，培养7d结束发酵。发酵液经5000r/min离心后，固液分离。上清液加入2倍体积的无水乙醇将普鲁兰糖粗品沉淀出来，再通过5000r/min离心后，固液分离。
[0015]第四、纤维素残渣同步糖化发酵生产乙醇:向纤维素残渣中补充营养物质KH2P04、硫酸铵、酵母浸粉添加市售纤维素酶,2-5%酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC2.0119种子液和0.5_1%CGMCC N0.7377种子液，于30_35°C发酵15-20-小时，随后提高温度到38-41°C，继续发酵30-40小时结束发酵。所得发酵液经蒸馏后得到乙醇。
[0016]第五、将第三步所得的含有乙醇的废液和第四步所得的含有乙醇的发酵液混合，通过蒸馏的方法实现乙醇的回收利用。
[0017]有益效果:
[0018]本发明与现有技术相比，有益效果是:第一，通过将木质纤维素类物质中的半纤维素和纤维素分离，并分别转化为普鲁兰糖和乙醇，实现了纤维素类物质的的高值转化。第二，普鲁兰糖的纯化过程需要大量乙醇，将普鲁兰糖的生产同乙醇的生产过程偶联起来，能够有效降低普鲁兰糖生产成本，并且乙醇也可以重复利用，这样就能够节约资源，实现纤维素类物质清洁、高效的生物转化。
[0019]普鲁兰糖发酵过程添加二硫苏糖醇可有效促进普鲁兰糖合成。添加二硫苏糖醇后，出芽短梗霉的菌体形态更多的呈现酵母样细胞，酵母样细胞的增加对普鲁兰糖的合成起到促进作用，另外二硫苏糖醇还可能通过刺激脂载体合成和保护葡萄糖基转移酶活性而促进普鲁兰糖的生物合成。
[0020]普鲁兰糖发酵过程通过流加混合氮源，有效控制了溶氧水平反弹，使得普鲁兰糖合成主要发生在发酵前期及中期，从而大幅度提高了普鲁兰糖发酵水平，普鲁兰糖产量较未流加混合氮源时提高了 20%以上。
[0021]纤维素残渣采用两阶段变温混合酵母发酵，低温阶段有利于常规酵母乙醇发酵，同时利于耐高温酵母菌体增殖、积累生物量，为高温发酵做准备，高温阶段可充分发挥耐高温酵母的优势，同常规酵母发酵相比，乙醇含量提高约10%，发酵时间缩短了 60h。
【专利附图】
【附图说明】:
[0022]图1为本发明工艺流程图。
【具体实施方式】:
[0023]下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
[0024]本发明提供的酿酒酵母菌株是具有耐高温性能的酿酒酵母菌株，具体为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SY-5-lIL0该菌已于2013年3月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮编100101)， 保藏编号为CGMCC N0.7377。
[0025]所述酿酒酵母菌株在其它发酵性能不受影响的情况下，在高温40°C发酵条件下乙醇产量为12.2% (v/v)，较出发菌株乙醇产量相比提高了 34.1%。
[0026]所述酿酒酵母菌株的选育方法，具体可以通过人工诱变出发菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC2.0119 (中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，公众可以通过该保藏管理委员会获得出发菌株2.0119)，筛选出若干耐高温酿酒酵母突变株作为正向突变株文库，将该文库通过三轮高效生孢杂交实现三轮基因组重排来获得。
[0027]上述诱变和基因组重排方法可以用常规的方法获得，这些方法已有许多文献报道，如 Lihua Hou, Novel methods of genome shuffling in Saccharomyces cerevisiae [J].Biotechnology Letters, 2009, 31 (5): 671-677。与改造耐受性相关基因的分子育种方法相t匕，这种通过传统诱变育种和新型基因组重排集合相结合的方法，效率和效果均有明显优势；且菌株比基因组定向改造得到的突变株稳定性更高，更有利于工业化应用。
[0028]本发明所提供的构建上述酿酒酵母菌株的方法是，先将出发菌株经传统紫外诱变，获得基因型多样的突变株群体；以38°C高温培养为初筛条件，筛得的菌株以TTC (氯化三苯基四氮唑)法进行复筛，经复筛后得到的突变株再进行高温发酵实验测试产乙醇能力，最终从中筛选出一定数量的相对于亲本高温发酵性能有所提升的突变株，建立用于基因组重排的原始正向突变株文库。对酿酒酵母的高效生孢、杂交等基因组重排条件进行优化。在该条件下，对原始正向突变株文库进行三轮基因组重排，每轮重排后，选出高温下产乙醇能力有提高的重排株作为下一轮基因组重排的正向突变株文库。每轮重排之后在高温发酵条件下筛选获得乙醇产量最高的基因组重排最优菌，最终三轮基因组重排后获得高温发酵条件下乙醇产量最高的酿酒酵母菌株。
[0029]耐高温酿酒酵母菌株的选育
[0030]( I)传统诱变育种建立突变株文库
[0031]挑取一环酵母菌斜面培养物接种于5mL的YPD液体培养基中，30°C、IOOrpm培养至对数生长中后期，离心收集菌体并用无菌生理盐水洗涤两次，重悬细胞将浓度调至IO6个/mL。取4mL菌悬液于Φ70πιπι培养皿中，用15W紫外灯，距培养皿内菌液高度30cm进行照射，紫外照射后的菌液置于YPD液体中于30°C、IOOrpm培养4h后，取适当稀释后涂于YPD培养基平板上。对菌液照射不同的时间(Os，5s，10s, 20s, 30s, 40s, 50s, 60s, 70s, 80s),分别稀释涂板培养两天，待菌落长出来，对平板上的菌落计数，并计算致死率，绘制基于不同照射时间的致死率曲线(如图1所示)。故选定40s作为最终诱变时间。按照以上诱变方法对细胞进行人工紫外诱变，将诱变之后的菌液经30°C、IOOrpm培养4h后涂布到YPD平板进行初筛。
[0032]将诱变后得到的菌液稀释后涂布YPD平板，于高温培养条件进行初筛后，挑出其中较大的菌落于TTC平板进行复筛，将筛得的突变株接种于玉米粉水解液中于40°C温度下静置发酵三天，检测发酵液酒精度。选取23株产酒度高于出发菌株的突变株，建立突变株文库。
[0033]所述玉米粉水解液的制备 方法如下:将1500g玉米粉加入4500mL65~70V的自来水，放置20min，使玉米粉颗粒充分吸水膨胀。加入液化酶(a-淀粉酶)0.9mL，在85~90°C下液化1.5h。液化完成后，降温至60°C，加入糖化酶3mL。在55_60°C下糖化20h。将糖化液用滤布过滤，得到澄清滤液，即为玉米水解液，煮沸10分钟冷却待用。
[0034](2)基因组重排
[0035]将突变株文库的细胞群体都接种到YPD液体培养基中，在30°C，180rpm下培养至对数期，离心收集细胞。用无菌水将菌体洗净，随后将菌泥接入到预产孢培养基(10g/LKAc,10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨)中，28°C，200rpm培养12h，离心收集菌体。用无菌水将菌体洗三次后将所得菌泥接种到高效液体生孢培养基(lOg/LKAc，lg/L酵母提取物，0.5g/L葡萄糖,50mg/L腺嘌呤，100mg/L组氨酸,50mg/L尿嘧唳，100mg/L色氨酸，100mg/L亮氨酸)中，28°C，200rpm下培养5d。将完成高效生孢过程的菌液离心收集细胞，用2%的蜗牛酶液(加入2.5%的β -巯基乙醇)将细胞重悬，于30°C，180rpm处理12h，离心收集菌体，用等量的
0.5% (V/V)的Triton X-100重悬，用超声波震荡该体系，使子囊壁充分破裂并释放出孢子，期间不断观察破壁效率，待视野中无二倍体细胞时，终止超声破碎，用无菌水将菌体洗三次，重悬于0.5% (V/V)的Triton X-100。将一定的孢子菌悬液涂布到YB)培养基中，置于30°C、100rpm培养24h以上，使细胞充分杂交，由此完成第一轮基因组重排。收集细胞，并将其涂布在YI3D平板上，40°C培养箱内培养24h，从平板上挑取较大的菌落，继续用TTC法进行复筛，将复筛之后得到的突变株接种于玉米粉水解液中于40°C温度下静置发酵三天，检测发酵液酒精度，选取若干株产酒度进一步提高的菌株，用于构建第二轮基因组重排的突变株文库。
[0036]按照上述步骤，将新一轮构建的突变株文库的细胞群体进行产孢、孢子纯化、杂交，进行第二、三轮基因组重排，并在第三轮基因组重排后，筛选出在高温发酵条件下产酒度最闻的基因组重排株。
[0037]出芽短梗霉AY82，能以木糖为碳源发酵生产普鲁兰糖，摇瓶发酵产量达到
16.61g/L，5L发酵罐发酵产量达到16.23g/L。
[0038]出芽短梗霉AY82利用木糖生产普鲁兰糖的方法，包括如下步骤:
[0039]种子液的制备:
[0040]斜面菌种经转接培养获得种子液；
[0041]发酵培养:将种子液接入发酵培养基中发酵培养；发酵培养在摇瓶或发酵罐中进行；所述发酵培养基以木糖为主要碳源，添加其他氮源和微量元素组成。
[0042]所述发酵培养基组成为:木糖40-80g/L、(NH4) 2S040.8-1.2g/L、K2HP044_6g/L、MgSO4.7H200.2-0.4g/L、NaC12-4g/L、酵母浸粉 0.6-1.0g/L, 121 °C 高压蒸汽灭菌 20min。
[0043]所述摇瓶发酵还可以用木糖母液培养基，组成为:以木糖母液替换发酵培养基中的木糖，所述木糖母液组成成份如下:木糖35-40%，阿拉伯糖8-16%，半乳糖9-15%，葡萄糖8-11%，其余为水；稀释至木糖母液培养基中的总糖含量为50g/L。
[0044]所述摇瓶发酵还可以用半纤维素水解液培养基，组成为:以半纤维素水解液替换发酵培养基中的木糖，所述半纤维素水解液组成成份如下:木糖70%，葡萄糖12%，阿拉伯糖7%,其余为水;浓缩至半纤维素水解液培养基中的总糖含量为50g/L。
[0045]摇瓶发酵条件为:发酵培养基装量20%，接种量6-10%，摇床转速180-240r/min，温度 26-30°C，初始 ρΗ6.0-6.5，发酵时间为 144_168h。
[0046]发酵罐发酵条件为:接种量6-8%，发酵培养基装量60-70%，培养温度26_28°C，转速 200-300r/min，通气量 1.0-1.5vvm, pH 控制在 5.5±0.1，罐压 0.03Mpa，培养 7d 结束发酵。
[0047]本发明所述利用木糖生产普鲁兰糖的出芽短梗霉AY82 (AureobasidiumPullulanAY82),已于2013年I月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC N0.7154，保藏地址:中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮编:100101o
[0048]以出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan)CGMCC3.00837为出发菌株，选择致死率为82.4%的紫外诱变剂量(照射5min)对出芽短梗霉进行诱变，将诱变后的菌液稀释后均匀涂布于高浓度木糖平板(木糖浓度100g/L)上，30°C避光培养4-5d后挑取突变株。将突变株进行摇瓶发酵实验复筛，发酵168h后测定普鲁兰糖生成量，与出发株做对照，得到一株利用木糖高产普鲁兰糖的突变菌株AY82，普鲁兰糖产量较出发菌株有大幅提升，发酵结果见表1。 [0049]表1突变菌株AY82与出发菌株普鲁兰糖生成量比较
[0050]
【权利要求】
1.一种木质纤维素类物质联产生物乙醇和普鲁兰糖的方法，包括如下步骤: 第一、半纤维素水解液制备:纤维类物质原料除杂、粉碎至20~30目后，按固液比为1:12~1:15的量加入0.5~0.8%的NaOH溶液，40°C条件下预处理I~3h ;将预处理后的纤维素类物质洗至中性，按固液比1:15~1:18将原料投入pH4.5~5.5的酶解缓冲水溶液中，按100~200IU/g原料加入市售木聚糖酶，同时添加表面活性剂RH0.005~0.01%、Tween-800.15 ~0.35%、PEG60000.2 ~0.35%、Triton X-100 (曲拉通 Χ_100)0.I ~0.30%、并于38~40°C条件下酶解36~72h，将酶解体系进行固液分离，得半纤维素水解液和固相残渣； 第二、木质素的提取与纤维素残渣制备:将第一步所得固相残渣按照固液比为1:12~1:18的比例加入木质素提取混合液,温度为80~90°C,反应时间为2~4h ;木质素提取之后的残渣即为纤维素残渣； 第三、半纤维素水解液普鲁兰糖发酵:将第一步得到的半纤维素水解液蒸发浓缩，调整初始糖浓度，补充硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、酵母浸粉后，将出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans) CGMCC N0.7154种子液体按5-10%接种量接入到发酵罐中，培养温度26~28°C，转速200~400r/min，通气量1.0~2.5vvm, pH控制在5.0~5.5，罐压0.02~0.03Mpa,培养24h后加入二硫苏糖醇至浓度为1.0~2.0mM ;发酵过程通过流加混合氮源控制溶氧，当溶氧水平上升到60~70%以上时，向发酵罐中添加适量的混合氮源，使得溶氧水平降至40~45%以下，培养7d结束发酵；发酵液分离醇沉再分离获得普鲁兰糖粗品； 第四、纤维素残渣 同步糖化发酵生产乙醇:向纤维素残渣中补充营养物质KH2P04、硫酸铵、酵母浸粉添加市售纤维素酶，2~5%酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC2.0119种子液和0.5_1%CGMCC N0.7377种子液，于30_35°C发酵15-20-小时，随后提高温度到38-41°C，继续发酵30-40小时结束发酵；所得发酵液经蒸馏后得到乙醇； 第五、将第三步所得的含有乙醇的废液和第四步所得的含有乙醇的发酵液混合，蒸馏法回收利用乙醇。
2.根据权利要求1所述木质纤维素类物质联产生物乙醇和普鲁兰糖的方法，其特征在于，所述半纤维素水解液制备中添加表面活性剂RH0.005%,Tween-800.25%、PEG60000.25%、Triton X-100 (曲拉通 X-100) 0.15%。
3.根据权利要求1所述木质纤维素类物质联产生物乙醇和普鲁兰糖的方法，所述木质素提取混合液组成比例为甲酸:乙醇为9:1。
4.根据权利要求1所述木质纤维素类物质联产生物乙醇和普鲁兰糖的方法，所述发酵罐水平甘蔗渣半纤维素水解液普鲁兰糖发酵中，发酵培养基组成为:半纤维素水解液浓缩至木糖浓度为 50g/L、(NH4) 2S041.2g/L、K2HP046g/L、MgSO4.7H200.4g/L、NaC12g/L、酵母浸粉1.0g/L。121°C高压蒸汽灭菌20min。
5.根据权利要求1所述木质纤维素类物质联产生物乙醇和普鲁兰糖的方法，半纤维素水解液普鲁兰糖发酵:培养24h后加入二硫苏糖醇至浓度为1.0mM。
6.根据权利要求1或5所述木质纤维素类物质联产生物乙醇和普鲁兰糖的方法，半纤维素水解液普鲁兰糖发酵:流加的氮源为混合氮源，酵母粉和硫酸铵的含量按照1:1的比例配制，浓度均为10g/L。
7.根据权利要求1或5所述木质纤维素类物质联产生物乙醇和普鲁兰糖的方法，在纤维素残渣同步糖化发酵生产乙醇步骤中:采用双阶段控制温度、混菌发酵，接入5%的常规酵母CGMCC2.0119和1%的耐高温酵母CGMCC N0.7377，发酵前16h温度控制在30°C，随后提高至40°C。
8.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其特征在于所述的纤维物质为甘蔗渣、玉米芯、玉米稻杆、稻草、麦杆中至少一种。
9.一种利用纤维素残渣同步糖化发酵生产乙醇的方法:向纤维素残渣中补充营养物质KH2P04、硫酸铵、酵母浸粉添加市售纤维素酶,2~5%酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) CGMCC2.0119 种子液和 0.5_1%CGMCC N0.7377 种子液，于 30-35 °C 发酵15-20-小时，提高温度到38-41°C，继续发酵30-40小时结束发酵；所得发酵液经蒸馏后得到乙醇。
【文档编号】C12P7/08GK103993042SQ201410008525
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年1月7日 优先权日:2014年1月7日
【发明者】陈叶福, 肖冬光, 郭建, 董健, 李月强, 郭学武 申请人:天津科技大学