一种嗜热四膜虫的高密度发酵方法
【专利摘要】本发明公开了一种嗜热四膜虫的高密度发酵方法。本发明提供了一种培养四膜虫的方法，包括如下步骤：将四膜虫接种至pH5-9的发酵培养基，使四膜虫的初始密度为3125-50000cells/ml，然后采用50-200rpm转速培养10-96小时。本发明解决了四膜虫高密度发酵中两个迫在眉睫的问题，即培养基贵的问题和没有发酵工艺的问题，与现有技术相比其优点在于：⑴大大节省了成本，适合大批量培养四膜虫，为工业化生产四膜虫奠定了坚实的基础；⑵本发明在国内首次建立了发酵罐培养四膜虫的发酵工艺，并实现了四膜虫的高密度发酵，为四膜虫高密度生产产物奠定了坚实的基础。
【专利说明】一种嗜热四膜虫的高密度发酵方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种嗜热四膜虫的高密度发酵方法。
【背景技术】
[0002]四膜虫(Tetrahymena)是一种单细胞真核生物，分布在全球的淡水水域中，属于原生动物亚界中的纤毛门寡毛纲膜口目膜口科四膜虫属，与一般人所熟知的草履虫(Paramecium)在形态生理上十分相似。四膜虫外观呈椭圆长梨状，体长约50微米,全身布满数百根长约4-6微米长的纤毛，纤毛排列成数十条纵列，是不同种间纤毛虫分类的特征之一。四膜虫身体前端具有口器(oral apparatus)，有三组三列的口部纤毛，早期在光学显微镜下观察时看似有四列膜状构造，因此据以命名。
[0003]在过去的50年中，以四膜虫为实验对象在基础研究中取得了一系列突破性的成果，如上世纪60年代第I个微管动力蛋白的发现；70~80年代端粒和端粒酶的发现及其作用机制的研究(获得2009年诺贝尔生理与医学奖)，大大促进了对细胞老化过程的认识；80年代核酶及RNA自我拼接的发现(获得1989年诺贝尔化学奖)，打破了人们关于“酶都是由蛋白质组成的”的固有观念；90年代组蛋白乙酰化翻译后修饰功能的发现成为当下热点研究表观遗传学的经典文献之一；大核DNA重整中RNAi机制的存在作为共同发现者被评为2002年美国Science杂志十大科学发现之一。
[0004]同时，四膜虫作为第一种实现细胞同步化的真核生物可以进行无菌纯培养，而且生长快(2-2. 5h/代)、培养简单、操作精确度高和可控性强；2005年底美国科学家完成了嗜热四膜虫大核基因组的测序并建立了相应的预测基因数据厍(Tetrahymena GenomeDatabase, http://ciliate.0rg/ index, php/home/we I come),比较基因组学的研究显不嗜热四膜虫较酵母等模式生物和人类具有更高程度的功能保守性；加之四膜虫中已建立了成熟的基因操作技术，使得在嗜热四膜虫中进行基因敲除和插入、基因表达抑制和基因过表达等十分方便快捷；美国科学家又完成了嗜热四膜虫小核基因组的测序并把数据共享在预测基因数据厍(Tetrahymena Genome Database,
[0005]http://ciliate.0rg/ index, php/home/we I come),再加上 Miao Lab 等基于嗜热四膜虫基因芯片、RNA-Seq和基因网络建立的四膜虫功能基因组学数据库(TetrahymenaFunctional Genomics Database, http: //tfgd.1hb.ac.cn/),为四膜虫基因功能的研究提供了很好的平台。因此，四膜虫是在基因组水平开展真核生物重要代谢通路及基因调控网络研究的良好模式生物。
[0006]发酵的定义由使用场合的不同而不同，通常所说的发酵，多是指生物体对于有机物的某种分解过程。发酵按工艺流程分为分批发酵、连续发酵和补料分批发酵。分批发酵，即在一个密闭系统内一次性投入有限数量的营养物进行培养的方法。连续发酵，是在开放系统中进行的，指以一定的速率向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定，使培养物在近似恒定的状态下生长的培养方法。补料分批发酵是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法(即间歇补料分批发酵或恒速补料分批发酵)。
[0007]四膜虫作为良好的模式生物，许多学者正在尝试用四膜虫表达各种产物，如溶酶体酶、磷脂酶和抗菌肽等。所以，对四膜虫进行高密度发酵很有必要，可以为四膜虫高密度生产产物奠定坚实基础。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种嗜热四膜虫的高密度发酵方法。
[0009]本发明提供了一种培养四膜虫的方法，包括如下步骤:将四膜虫接种至PH5-9的发酵培养基，使四膜虫的初始密度为3125cells/ml-50000cells/ml，然后采用50_200rpm转速培养10-96小时。
[0010]所述方法中，四膜虫的初始密度具体可为6250cells/ml。
[0011]所述方法中，所述发酵培养基的pH具体可为pH7.0。
[0012]所述方法中，所述发酵培养基具体可为gspp培养基。gspp培养基的溶剂为双蒸水，溶质及其浓度如下:葡萄糖2g/L、蛋白胨20g/L、酵母浸出物lg/L、柠檬酸铁0.03g/L。
[0013]所述方法中，所述培养具体可采用IOOrpm的转速。
[0014]所述方法中，所述培养采用的温度具体可为30°C。
[0015]所述方法中，所述培养具体可采用20%_55%的发酵培养基装液量。
[0016]所述方法中，所述培养具体可为摇瓶培养，发酵培养基的装液量为20%。
`[0017]所述方法中，所述培养具体可为发酵罐培养，发酵培养基的装液量为50%±5%。
[0018]所述方法中，所述培养为发酵罐培养时，可采用6L/min的空气流速。
[0019]所述方法中，所述培养为发酵罐培养时，可在发酵体系的残糖浓度低于0.8g/L时一次性加入补料培养基，所述发酵培养基与所述补料培养基的体积配比为4L发酵培养基:400ml补料培养基。
[0020]所述方法中，所述培养为发酵罐培养时，可在发酵体系的残糖浓度低于0.8g/L时以100ml/h的速度持续加入补料培养基，所述发酵培养基与所述补料培养基的体积配比为4L发酵培养基:400ml补料培养基。
[0021]所述补料培养基的溶剂为双蒸水，溶质及其浓度如下:葡萄糖20g/L、蛋白胨200g/L、酵母浸出物10g/L、柠檬酸铁0.3g/L。所述补料培养基的pH具体可为7.0。
[0022]所述四膜虫可为嗜热四膜虫，具体可为嗜热四膜虫B2086株系。
[0023]本发明摸索了四膜虫的最佳培养条件。通过单因素实验，对发酵培养基的pH、发酵培养基的装液量、起始接种密度和转速进行优化，最终确定四膜虫发酵的最适条件(发酵培养基的PH为7.0、摇瓶装液量为20%、发酵罐装液量为50%±5%、起始接种密度为6250cells/ml、转速为 lOOrpm)。
[0024]本发明在确定了培养四膜虫的最佳条件后，对四膜虫进行了发酵罐的分批高密度发酵实验，得出MPD为1222416cells/ml、GTP为2.5h，获得干重达到2.15g/L。在此基础上，为了进一步提高细胞密度，发明人尝试了一次性间歇补料高密度发酵实验和恒速补料高密度发酵实验，得出一次性间歇补料高密度发酵实验的MPD为2053241 ce 11 s/ml、GTP为
3.2h、获得干重达到4.4g/L，恒速补料高密度发酵实验的MPD为1849138cells/ml、GTP为2.8h、获得干重达到4.3g/L。综合比较三次用发酵罐高密度发酵四膜虫的实验，可以看出补料能显著提高细胞的密度和细胞干重，其中一次性间歇补料高密度发酵的MPD比分批发酵提高了 67.97%，细胞干重提高了 104.65%，恒速补料高密度发酵的MPD比分批发酵提高了51.27%，细胞干重提高了 100.00%,说明一次性间歇补料比恒速补料密度和干重提高的都更明显。在应用中，一次性间歇补料比恒速补料操作简单且克服了杂菌污染和菌株不稳定的缺点，所以，对于四膜虫而言，一次性间歇补料是最佳的补料方式，最大细胞密度能达到2053241cells/ml，干重达到 4.4g/L。
[0025]本发明解决了四膜虫高密度发酵中两个迫在眉睫的问题，即培养基贵的问题和没有发酵工艺的问题，与现有技术相比其优点在于:⑴本发明使用的gspp培养基价格非常便宜，2.2元 /L，是常用spp培养基的1/33，大大节省了成本，解决了培养基贵的问题，适合大批量培养四膜虫，为工业化生产四膜虫奠定了坚实的基础；⑵本发明在国内首次建立了发酵罐培养四膜虫的发酵工艺，并实现了四膜虫的高密度发酵，最高密度可达
2.05X 106cellS/ml，干重可达4.4g/L，为四膜虫高密度生产产物奠定了坚实的基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为葡萄糖标准曲线。
[0027]图2为实施例1中gspp培养基与spp培养基的效果比较的结果。
[0028]图3为实施例2中的密度生长曲线图。
[0029]图4为实施例2中的MPD和GTP。
[0030]图5为实施例3中的密度生长曲线图。
[0031 ] 图6为实施例3中的MPD和GTP。
[0032]图7为实施例4中的密度生长曲线图。
[0033]图8为实施例4中的MPD和GTP。
[0034]图9为实施例5中的密度生长曲线图。
[0035]图10为实施例5中的MPD和GTP。
[0036]图11为实施例6中的密度生长曲线图和残糖浓度变化图。图12为实施例7中的密度生长曲线图和残糖浓度变化图。
[0037]图13为实施例8中的密度生长曲线图和残糖浓度变化图。
[0038]图14为实施例6 (分批)、实施例7 (间歇)和实施例8 (恒速)的密度生长曲线比较。
【具体实施方式】
[0039]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。葡萄糖:国药公司。proteose peptone:BD公司。yeast extract:0X0ID公司。蛋白胨:双旋公司。酵母浸出物:双旋公司。实施例中的摇瓶实验中采用的摇床的摆振幅度均为 C>26mm。
[0040]DNS法的具体步骤如下:
[0041]①DNS试剂的配制(1L):10g3, 5-二硝基水杨酸，16g氢氧化钠,300g四水合酒石酸钾钠，三种试剂分别用双蒸水溶解后混合在一起，用双蒸水定容至1L，用棕色瓶装好避光放置一周后使用；
[0042]②葡萄糖标准曲线制作方法:将葡萄糖105°C烘干后，称取0.05g溶于双蒸水中，定容 100ml,即 500 μ g/ml 的母液；稀释成 10 种浓度:5 μ g/ml、10 μ g/ml、15 μ g/ml、20 μ g/ml、25 μ g/ml、30 μ g/ml、35 μ g/ml、40 μ g/ml、45 μ g/ml 和 50 μ g/ml (以蒸懼水为空白对照，即葡萄糖浓度为O μ g/ml));取几支干净的试管，分别加入不同浓度的葡萄糖溶液1ml，加入1.5ml DNS试剂，置于100°C水浴lOmin，冷却至室温，在540nm处测吸光度，以吸光度的减少量(各浓度吸光度与空白对照的吸光度之差)为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线，见图1 ;
[0043]③测定:取1.5ml待测液相于1.5ml的EP管中，12000rpm离心5min,取上清Iml,加入1.5ml DNS试剂，混匀沸水浴lOmin，立即取出冷却，在540nm的波长处测吸光值，根据标准曲线计数残糖含量。
[0044]Gompertz的数学方程式:
[0045]Log Nt=A+C X exp {-exp [-B X (t_M) ]}
[0046]其中，A，初始体系中微生物数量以10为底的对数值；B，最大生长速率；C，稳定期体系中微生物数量以10为底的对数值与初始体系中微生物数量以10为底的对数值的差值；M，最大生长速率时所对应的时刻；log(Nt)，在t时刻体系中微生物数量以10为底的对数值。
[0047]根据上述公式用OriginS即可直接得出参数A、C、B和M，进而算出:
【权利要求】
1.一种培养四膜虫的方法，包括如下步骤:将四膜虫接种至PH5-9的发酵培养基，使四膜虫的初始密度为3125cells/ml-50000cells/ml，然后采用50_200rpm转速培养10-96小时。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法中，四膜虫的初始密度为6250cells/ml。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述发酵培养基的pH为pH7.0。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于:所述发酵培养基为gspp培养基；gspp培养基的溶剂为水,溶质及其浓度如下:葡萄糖2g/L、蛋白胨20g/L、酵母浸出物lg/L、柠檬酸铁0.03g/L。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于:所述培养采用的转速为lOOrpm。
6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于:所述培养为摇瓶培养，发酵培养基的装液量为20%。
7.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于:所述培养为发酵罐培养，发酵培养基的装液量为50%±5%。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于:所述培养的过程中，采用6L/min的空气流速。
9.如权利要求7或 8所述的方法，其特征在于:所述培养的过程中，在发酵体系的残糖浓度低于0.8g/L时一次性加入补料培养基,所述发酵培养基与所述补料培养基的体积配比为4L发酵培养基:400ml补料培养基；所述补料培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下:葡萄糖20g/L、蛋白胨200g/L、酵母浸出物10g/L、柠檬酸铁0.3g/L。
10.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于:所述培养的过程中，在发酵体系的残糖浓度低于0.8g/L时以100ml/h的速度持续加入补料培养基，所述发酵培养基与所述补料培养基的体积配比为4L发酵培养基:400ml补料培养基；所述补料培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下:葡萄糖20g/L、蛋白胨200g/L、酵母浸出物10g/L、柠檬酸铁0.3g/L。
【文档编号】C12R1/90GK103756906SQ201410024085
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月20日 优先权日:2014年1月20日
【发明者】缪炜, 钟秋萍, 周志刚, 袁冬霞, 李青 申请人:中国科学院水生生物研究所, 中国农业科学院饲料研究所