闽浙马尾杉菌根真菌及其产石杉碱甲的方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及微生物【技术领域】，具体涉及闽浙马尾杉菌根真菌及其产石杉碱甲的方法和应用。本发明提供一种闽浙马尾杉菌根真菌，命名为裂褶菌（Schizophyllum?commune）MT39，其保藏单位和保藏号为:中国典型培养物保藏中心，CCTCC?M2013642。本发明的另一技术方案为提供一种闽浙马尾杉菌根真菌，命名为(Chaunopycnis?alba)MT78，其保藏单位和保藏号为:中国典型培养物保藏中心，CCTCC?M2013643。本发明解决了土壤中细菌含量较多分离纯化内生菌根真菌难度较大的问题，从根际土壤中分离产石杉碱甲的菌根真菌。
【专利说明】闽浙马尾杉菌根真菌及其产石杉碱甲的方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物【技术领域】，具体涉及闽浙马尾杉菌根真菌及其产石杉碱甲的方法和应用。
【背景技术】
[0002]老年痴呆症是一种严重的、退行性脑疾患，由于其发病率高，致残率高，给社会和家庭造成了严重的危害和巨大的经济负担，随着社会老龄化，老年痴呆症发病率相对上升，据统计，世界有5000多万老年人患有不同程度的老年性痴呆症，因此治疗老年痴呆症是摆在当前社会的一大难题。
[0003]石杉碱甲[(_)Huperzine A,Hup A]是我国科学家刘嘉森于1986年从蛇足石杉中分离得到的一种新型石松类生物碱有效单体。药理实验表明，它能抑制乙酰胆碱酯酶活性，有效地改善老年人记忆功能，对治疗老年痴呆症有特殊疗效。石杉碱甲主要来源于野生蛇足石杉全草，而该植物对环境要求苛刻，生长缓慢，分布零散，资源更新周期长，而且石杉碱甲在蛇足石杉中的含量甚微，仅为万分之几，造成国际市场上石杉碱甲的价格不断攀升，一度达到每千克50万美元，成为制约石杉碱甲开发的瓶颈。由于石杉碱甲的结构特殊，骨架中的桥环结构难以人工合成，目前所有化学合成方法步骤复杂、合成条件苛刻、产率很低，难以实现工业化生产；植物组织培养无法消除内在的微生物污染，同时由于植物生长条件十分苛刻，因此至今未能走出实验室。
[0004]植物-菌根真菌-内生真菌三重互惠共生体，其建立共生体的内在机制是两种真菌通过营养竞争或通过分泌次生代谢产物来相互抑制与植物建立共生体。目前已有不少关于从蛇足石杉内生真菌代谢产物中分离到石杉碱甲的报道，如专利CNlOl 195804A (黎万奎等，专利申请号:2006 10119149.7，内生枝顶孢霉)、CN101240304A(吴东才等，专利申请号:200710003519.5，枝孢霉菌)、CN101942393A (朱笃等，专利申请号:20091010186852.3，竹黄菌)、专利CN103103134A (吴水生等，专利申请号:201110355882.X，炭疽菌)等；杨晓军(《内生真菌YD-Ol次生代谢产物的研究I》2006，37 (5):479_480，中国药科大学学报)均报道了产石杉碱甲及其类似物的内生真菌。以上均表明利用内生真菌发酵生产石杉碱甲成为一种可能，依据该共生体的内在机制从植物根际土壤中可分离到产石杉碱甲的菌根真菌，但目前关于该机制的研究观点不尽相同且土壤中微生物种类繁多，分离纯化工作量大，因此至今关于从植物根际土壤中分离产石杉碱甲菌根菌的研究仍未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是克服土壤中细菌含量较多，分离纯化内生菌根真菌难度较大的缺陷，提供一种供发酵生产石杉碱甲药物的闽浙马尾杉菌根真菌及其产石杉碱甲的方法和应用。
[0006]为实现上述目的，本发明的技术方案为提供一种闽浙马尾杉菌根真菌，命名为裂褶菌(Schizophyllum commune)MT39，其保藏单位和保藏号为:中国典型培养物保藏中心，CCTCC M2013642。
[0007]上述的闽浙马尾杉菌根真菌一裂褶菌MT39，其显微形态为:菌丝棉花状，有隔，分枝，不产孢子。
[0008]上述的闽浙马尾杉菌根真菌一裂褶菌MT39，其基因组ITS特征碱基序列如SEQ IDNO:1所示。
[0009]上述的闽浙马尾杉菌根真菌一裂褶菌MT39，其菌落培养特征为:PDA培养基28V培养，转速为HOrpm，培养第二天开始出现菌丝球，第五天菌丝球直径变大，发酵液变粘稠，发酵液开始变淡黄色，第九天颜色变深，发酵液变得非常粘稠，其菌落形态为:正面白色，菌丝发达，细腻，背面黄白色。
[0010]本发明的另一技术方案为提供一种闽浙马尾杉菌根真菌,命名为(Chaunopycnisalba)MT78，其保藏单位和保藏号为:中国典型培养物保藏中心，CCTCC M2013643。
[0011]上述的闽浙马尾杉菌根真菌一MT78，其显微形态为:菌丝分枝，无隔，孢子梨形，单胞。
[0012]上述的闽浙马尾杉菌根真菌一MT78，其基因组ITS特征碱基序列为:SEQ ID NO:2。
[0013]上述的闽浙马尾杉菌根真菌一MT78，其固体培养菌落特征为:PDA培养基28°C培养，转速为HOrpm，第三 天明显生长大量菌丝呈颗粒状，第五天发酵液变无色粘稠状液体，第九天菌丝集结成团。其菌落形态为:正面白色，菌丝细小，呈薄膜状，有叶脉状凸起，呈放射状，背面呈脉状放射裂纹，黄白色。
[0014]本发明的又一技术方案为提供一种闽浙马尾杉菌根真菌制备石杉碱甲的方法，包括下列步骤:
[0015](I)取闽浙马尾杉菌根真菌-裂褶菌MT39或MT78，在无菌条件下，用接种针挑取菌丝，接入已灭菌过的固体PDA培养基试管，于28 °C活化48小时；
[0016](2)取活化后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体PDA培养基，于28°C在140rpm摇床培养72小时，得种子液；
[0017](3)将制备好的种子液接入液体PDA培养基中，于28°C下140rpm摇床培养10天；
[0018](4)发酵完后，加入2%酒石酸，静置过夜，超声两次，每次各40min，抽滤收集上清液，用氨水调节至PH值为9.0，加入三倍量的二氯甲烷萃取3次，收集萃取液，60°C回收二氯甲烷，用甲醇溶解残留物得到石杉碱甲初提物。
[0019]本发明的又一技术方案为提供一种上述的闽浙马尾杉菌根真菌-裂褶菌MT39或MT78制备石杉碱甲的应用。
[0020]本发明的有益效果:本发明解决了土壤中细菌含量较多分离纯化内生菌根真菌难度较大的问题，从根际土壤中分离产石杉碱甲的菌根真菌。本发明两株闽浙马尾杉菌根真菌分别通过发酵，经石杉碱甲单克隆抗检测、HPLC、LC-MS分析证实可以产生石杉碱甲化合物，可以作为石杉碱甲新药源，有较大的应用价值。本发明可以利用两株闽浙马尾杉菌根真菌产石杉碱甲的特点以及现代发酵育种技术，达到工业化生产石杉碱甲，以解决石杉碱甲短缺的瓶颈问题，同时可以挽救濒临灭绝的石杉碱甲自然资源。
【专利附图】
【附图说明】[0021]图1为本发明裂褶菌MT39的显微形态图；
[0022]图2为本发明MT78的显微形态图；
[0023]图3为裂褶菌MT39的菌落形态图；
[0024]图4为MT78的菌落形态图；
[0025]图5为Hup A标准品HPLC色谱图；
[0026]图6为裂褶菌MT39发酵提取物色谱图；
[0027]图7为MT78发酵提取物色谱图；
[0028]图8为Hup A标准品质谱图；
[0029]图9为裂褶菌MT39发酵提取物质谱图；
[0030]图10为MT78发酵提取物质谱图。
【具体实施方式】
[0031]为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。
[0032]本发明所述的两株闽浙马尾杉菌根真菌是从闽浙马尾杉(Phlegmariurusphlegmaria)根际土壤采用土壤稀释法分离纯化得到。经分子生物学及形态学鉴定命名为裂裙菌(Schizophyl lum commune)MT39、Chaunopycnis alba MT78,已保藏于中国典型培养物保藏中心，中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2013年12月10号，其中Chaunopycnisalba MT78 保藏号 CCTCC M2013643，裂褶菌(Schizophyllum commune) MT39 保藏号 CCTCCM2013642。
[0033]实施例1
[0034]1、菌株显微形态观察:将本发明两种产石杉碱甲的菌根真菌接点接种于平板中央，再将灭完菌的盖玻片45°斜插人接完菌的平板中(2片/平板)，于28° C真菌培养箱中培养，待菌株长到一定程度(6d)后，取插片(超净台中进行)于显微镜下观察。
[0035]请参阅图1为本发明裂褶菌MT39的显微形态图，所述裂褶菌MT39的显微形态为:菌丝棉花状，有隔，分枝，不产孢子。
[0036]请参阅图2为本发明MT78的显微形态图，所述MT78显微形态为:菌丝分枝，无隔，孢子梨形，单胞。
[0037]2、菌株平板形态观察:将本发明产石杉碱甲的菌根真菌点接到平板中央。于28° C真菌培养箱中培养，每天定时观察记录菌体的生长情况，包括菌落直径、菌落颜色、菌丝变化等菌株形态变化。
[0038]闽浙马尾杉菌根真菌一裂褶菌MT39，其菌落培养特征为:PDA培养基28°C培养，转速为140rpm，培养第二天开始出现菌丝球，第五天菌丝球直径变大，发酵液变粘稠，发酵液开始变淡黄色，第九天颜色变深，发酵液变得非常粘稠，其菌落形态为:正面白色，菌丝发达，细腻，背面黄白色。
[0039]闽浙马尾杉菌根真菌一MT78，其固体培养菌落特征为PDA培养基28°C培养，转速为140rpm，生长迅速，第三天明显生长大量菌丝呈颗粒状，第五天发酵液变无色粘稠状液体，第九天菌丝集结成团。其菌落形态为:正面白色，菌丝细小，呈薄膜状，有叶脉状凸起，呈放射状，背面呈脉状放射裂纹，黄白色，生长较缓慢，10天约8x7cm。[0040]3、本发明闽浙马尾杉菌根真菌分子生物学特征
[0041]菌体收集:将本发明产石杉碱甲菌根真菌接自PDA液体培养基，28°C，140r/min，摇瓶培养，待菌体长到一定量后，8000rpm离心5min，弃上清，将沉淀的菌体转至EP管内，于-80°C冰柜中预冻一晚待用。
[0042]DNA提取:采用CTAB法提取基因组DNA，取适量冻干后的菌体，于研钵中充分研磨，加入预热至65°C的CTAB溶液1ml，取500ul转入2ml离心管，加入20 μ I巯基乙醇，混合，65°C温浴Ih ;温浴结束后加入等体积的1:1的苯酚:氯仿，缓慢震荡，12000rpm，20°C离心lOmin，取上清液至新的离心管，重复以上步骤，至上清液澄清，将上清液转入1.5ml离心管(共提2~4次)。加入7/10体积异丙醇，4°C下沉淀，30min后1000Orpm离心IOmin,弃上清；用75%冷乙醇(500ul)洗涤沉淀，然后10000rpm，4°C离心lOmin，弃上清(重复一次)，自然风干；最后加入20ul超纯水充分溶解,最后放置_20°C冰箱保存备用。
[0043]PCR扩增:采用ITSl和ITS4作为上下游引物，构建20 μ I反应体系(含ddH2012.2μ l、10Xbuffer2 μ 1、dNTPl.6μ 1、Primer ITSl 和 Primer ITS4 各 I μ 1、模板I μ l、Taq 酶 0.2 μ I。)，以 94°C预变性 5min ;94°C变性 30s, 55°C退火 Imin，72°C延伸 Imin，32个循环；72°C延伸10min，4°C保温的条件进行反应扩增。结束后，以该轮的PCR产物作为模板，再次扩增100 μ I。
[0044]凝胶电泳:采用TBE做缓冲液,取lul6 X loading buffer和2ul样品(基因组和扩增产物)混匀上样，经1.0%的琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像系统下观察记录结果。
[0045]产物纯化:采用离心柱式PCR产物纯化试剂盒(EZ-lOSpin Column PCR ProductPurification Kit)纯化PCR产物。纯化后的PCR产物送交生工生物工程上海股份有限公司完成测序。
[0046]本发明所述的两种产石杉碱甲闽浙马尾杉菌根真菌genebank登入号分别为:裂裙菌(Schizophyllum commune)MT39 登入号为 KF973228,Chaunopycnis alba MT78 登入号为KF973229。ITS碱基序列为:
【权利要求】
1.一种闽浙马尾杉菌根真菌，命名为裂裙菌(Schizophyllum commune)MT39,其保藏单位和保藏号为:中国典型培养物保藏中心，CCTCC M2013642。
2.根据权利要求1所述的闽浙马尾杉菌根真菌，其特征在于，它的显微形态为:菌丝棉花状，有隔，分枝，不产孢子。
3.根据权利要求1所述的闽浙马尾杉菌根真菌，其特征在于，它的基因组ITS特征碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求1所述的蛇足石杉菌根真菌，其特征在于，它的菌落培养特征为:PDA培养基28°C培养，转速为140rpm，培养第二天开始出现菌丝球，第五天菌丝球直径变大，发酵液变粘稠，发酵液开始变淡黄色，第九天颜色变深，发酵液变得非常粘稠，其菌落形态为:正面白色，菌丝发达，细腻，背面黄白色。
5.—种闽浙马尾杉菌根真菌,命名为(Chaunopycnis alba)MT78,其保藏单位和保藏号为:中国典型培养物保藏中心，CCTCC M2013643。
6.根据权利要求5所述的闽浙马尾杉菌根真菌，其特征在于，它的显微形态为:菌丝分枝，无隔，孢子梨形，单胞。
7.根据权利要求5所述的闽浙马尾杉菌根真菌，其特征在于，它的基因组ITS特征碱基序列为:SEQ ID NO:2.
8.根据权利要求5所述的闽浙马尾杉菌根真菌，其特征在于，它的固体培养菌落特征为:PDA培养基28°C培养，转速为140rpm，第三天明显生长大量菌丝呈颗粒状，第五天发酵液变无色粘稠状液体，第九天菌丝集结成团。其菌落形态为:正面白色，菌丝细小，呈薄膜状，有叶脉状凸起，呈放射状，背面呈脉状放射裂纹，黄白色。
9.一种闽浙马尾杉菌根真菌制备石杉碱甲的方法，其特征在于，包括下列步骤: (1)取如权利要求1或5任一项所述的闽浙马尾杉菌根真菌，在无菌条件下，用接种针挑取菌丝，接入已灭菌过的固体PDA培养基试管，于28°C活化48小时； (2)取活化后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体PDA培养基，于28°C在140rpm摇床培养72小时，得种子液； (3)将制备好的种子液接入液体PDA培养基中，于28°C下140rpm摇床培养10天； (4)发酵完后，加入2%酒石酸 ，静置过夜，超声两次,每次各40min，抽滤收集上清液，用氨水调节至PH值为9.0，加入三倍量的二氯甲烷萃取3次，收集萃取液，60°C回收二氯甲烷，用甲醇溶解残留物得到石杉碱甲初提物。
10.根据权利要求1或5任一项所述的闽浙马尾杉菌根真菌制备石杉碱甲的应用。
【文档编号】C12P17/12GK103834577SQ201410044946
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年2月7日 优先权日:2014年2月7日
【发明者】吴水生, 刘海元, 张方方, 郑雅媗 申请人:福建中医药大学