优化的猪圆环病毒orf2截短基因的制作方法
优化的猪圆环病毒orf2截短基因的制作方法
【专利摘要】本发明公开了优化的猪圆环病毒ORF2截短基因，所述基因的核苷酸序列为SEQIDNO．1。所述基因在枯草芽孢杆菌中表达。所述枯草芽孢杆菌为BS168或WB800。本发明采用以上技术方案，通过将去除NLS片段并根据密码子偏好性优化后的截短基因，能够成功的在枯草芽孢杆菌中得到表达。
【专利说明】优化的猪圆环病毒0RF2截短基因
【技术领域】
[0001]本发明属于属于生物【技术领域】，特别涉及优化的猪圆环病毒0RF2截短基因。
【背景技术】
[0002]猪圆环病毒(PCV)是一种小的、二十面体对称、无囊膜、共价闭合、单股环状DNA病毒，是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原。根据PCV的致病性及全基因组序列，可分为两个血清型:PCV1与PCV2。PCV2含有两个主要开放阅读框ORFl和0RF2。其中0RF2为702bp，编码233个氨基酸，是病毒的主要结构蛋白，具有良好的免疫原性，是构建重组疫苗的首选基因。
[0003]PVC2的0RF2基因编码Cap蛋白，为病毒的外壳蛋白。Cap蛋白是病毒的主要抗原。市场上已经有以Cap蛋白为主要成份的疫苗产品。目前用做疫苗的Cap蛋白主要由昆虫细胞表达系统生产。还未见微生物发酵生产的疫苗产品。[0004]大肠杆菌是得到广泛应用的蛋白生产菌种。0RF2外壳蛋白在大肠杆菌中的表达已经有不少研究报道。比如，孙继国2009，查振林2005，周伦江2008，陈德坤2010，zhangGaiping2012。但所有上述报道均未能表达0RF2的全长基因序列，而是去除信号肽NLS的截短序列。目前认为，其原因是0RF2外壳蛋白在N端的一段NLS序列，含有大肠的稀有密码子。
[0005]在研究人员的努力下，已有少数研究组成功的在大肠杆菌中成功的表达了 0RF2基因。Celer2007报道，成功的在大肠杆菌的特殊菌种BL21-C0D0N-PLUS中表达了 0RF2全长基因序列。其成功在于运用了特殊的菌种，这种菌种被插入了多个野生型大肠杆菌不具备的稀有密码子基因。另一个技术路径是通过改变原0RF2基因的密码子使用方法，得到优化的适于在大肠杆菌中表达的基因。Bumba2009首先报道了一个优化的序列(GenbankEU376523)，使得0RF2蛋白在大肠杆菌BL21中获得了 10mg/L的表达量。Huang2012等人又报道了一个优化的序列(Genbank AY885225)，同样获得了全长蛋白的成功表达。这两个序列是目前已知的两个优化的0RF2-NLS序列。
[0006]枯草芽孢杆菌作为很有吸引力的外源基因表达的宿主，是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白较理想的宿主。国内外在开发和使用枯草芽孢杆菌作为克隆和表达系统方面做了许多研究，但是到目前为止尚未有枯草芽孢杆菌表达PCV2-0RF2基因序列的的报道。
【发明内容】
[0007]为了解决现有技术中的不足，本发明的目的为提供能够在枯草芽孢杆菌中成功得到表达的优化的猪圆环病毒0RF2截短基因。
[0008]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0009]优化的猪圆环病毒0RF2截短基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID N0.1。
[0010]所述基因在枯草芽孢杆菌中表达。[0011]所述枯草芽孢杆菌为BS168或WB800。
[0012]本发明采用以上技术方案，通过将去除NLS片段并根据密码子偏好性优化后的截短基因，能够成功的在枯草芽孢杆菌中得到表达。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]下面将结合【专利附图】
【附图说明】和【具体实施方式】对本发明做进一步详细的说明。
[0014]图1为本发明优化的猪圆环病毒0RF2截短基因的表达载体质粒PHT43-0RF2双酶切后经琼脂糖凝胶电泳的图谱(1.PHT43-0RF2经双酶切的电泳条带；2.PHT43-0RF2未酶切的电泳条带；3.DL2000DNA Ladder Marker)；
[0015]图2为本发明优化的猪圆环病毒0RF2截短基因的表达质粒PHT43-0RF2成功转化枯草芽孢杆菌168后，提取表达菌株中质粒经BamHl和Smal双酶切后经琼脂糖凝胶电泳的图谱(1.BS168/PHT43-0RF2经双酶切的电泳条带；2.BS168/PHT43-0RF2未酶切的电泳条带；3.DL2000DNA Ladder Marker)；
[0016]图3为本发明优化的猪圆环病毒0RF2截短基因的表达质粒PHT43-0RF2成功转化枯草芽孢杆菌WB800后，提取表达菌株中质粒经BamHl和Smal双酶切后经琼脂糖凝胶电泳的图谱(1.WB800/PHT43-0RF2经双酶切的电泳条带；2.WB800/PHT43-0RF2未酶切的电泳条带；3.DL2000DNA Ladder Marker)；
[0017]图4为本发明优化的猪圆环病毒0RF2截短基因的表达菌株诱导表达重组蛋白的ffestern-blot 分析结果(1.BS168/PHT43-0RF2 诱导表达的重组蛋白；2.WB800/PHT43-0RF2诱导表达的重组蛋白；3.B S168/PHT43-0RF2未诱导；4.WB800/PHT43-0RF2未诱导)。
【具体实施方式】
[0018]本发明的优化的猪圆环病毒0RF2截短基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ IDN0.1。
[0019]为便于后续纯化，在本发明的优化的猪圆环病毒0RF2截短基因的3’末端引入6XHis标签后，再在其两端分别引入BamHl和Smal的酶切位点送生物公司合成此序列。
[0020]所述基因在枯草芽孢杆菌中表达。
[0021]所述枯草芽孢杆菌为BS168或WB800。
[0022]为了验证本发明的优化的猪圆环病毒0RF2截短基因能够在枯草芽孢杆菌中得到表达，本发明采用以下试验进行验证。
[0023]胶回收试剂盒、质粒回收试剂盒均购自生工生物工程(上海)有限公司；BamHl、Smal、T4DNA Ligase、DL2000核酸分子量标准物、低分子量蛋白标准物均购自TaKaRa公司。
[0024]主要溶液和试剂的配制:
[0025]I)碱裂解法制备质粒DNA所用溶液:
[0026]溶液1:50mM glucose, 25mM Tris-HCl (pH8.0)，IOmM EDTA (pH8.0)。
[0027]溶液II:0.2M NaOH, 1%SDS (m/v)(现配现用)。
[0028]溶液III:3M KAC60.0mL，冰醋酸 11.5mL, H2O 定容至 100mL。
[0029]2)0.1M CaCl2:1.47g CaCl2 溶于 100ml 纯水中，灭菌，4°C保存备用。
[0030]3)枯草芽胞杆菌感受态细胞制备用培养基[0031]IOX 最低盐溶液=K2HPO4.3Η2091.7g, KH2P0430g, (NH4)2SO4IOg,柠檬酸钠 5g，MgSO4.7H201g，在蒸馏水中依次溶解，定容至500mL。
[0032]GM I 溶液:1X 最低盐溶液 95mL, 50%glucoselmL, 5%Casamino Acid0.4mL,10%Yeast extract ImL, 2mg/mL L_trp 溶液 2.5mL。
[0033]GM II 溶液:I X 最低盐溶液 195mL, 50%glucose2mL, 5%Casamino Acid0.16mL,10%Yeast extract0.08mL,0.5M MgCl2ImL, 0.1M CaCl2ImL, 2mg/mL L_trp 溶液 lmL。
[0034]1.质粒PHT43-0RF2的小量提取
[0035]I)取1.5mL菌液于离心管中，12000rpm离心2min,弃上清。
[0036]2)菌体沉淀重悬于100 μ L溶液I中，室温下放置5-10min。
[0037]3)加入新配制的溶液II 200 μ L，盖紧管口，快速温和颠倒离心管数次，混匀，冰浴5min，使细胞膜裂解。
[0038]4)加入150 μ L预冷的溶液III,见白色絮状沉淀,于冰上放置5min。
[0039]5) 12000rpm离心lOmin，上清液移入干净离心管中，加入等体积(450 μ L)的酚/氯仿，振荡混匀，12000rpm离心5min。
[0040]6)小心移出上清(约400 μ L)于一新微量离心管中，加入2倍体积(800 μ L)预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2_5min, 12000rpm离心lOmin。
[0041]7)弃上清,加入1ιΛ70%乙醇洗沉淀一次，12000rpm离心5min。
[0042]8)吸除上清液，室温干燥，将沉淀质粒PHT43-0RF2溶于20 μ LTE缓冲液中进行保`存。
[0043]2.大肠杆菌感受态TOPlO细胞的制备及转化
[0044]I)挑取TOPlO单菌落于LB培养基中，37°C培养过夜。
[0045]2)第二天，按1:100转接到新的LB培养基中，培养至OD6tltl为0.3-0.5。
[0046]3)取 ImL 菌液，冰浴 lOmin, 12000rpm 离心 lmin。
[0047]4)弃上清，加入ImL0.1M的CaCl2,混匀，冰浴30min。
[0048]5) 12000rpm离心lmin,弃上清,加入100 μ L0.1M的CaCl2,混匀，即为大肠杆菌感受态TOPlO细胞。
[0049]6)适量DNA立即加入100 μ L制备好的大肠杆菌感受态TOPlO细胞中，冰浴30min。
[0050]7) 42°C热击45s，冰浴2min，再加入500 μ L不含抗生素的LB培养基，37°C培养Ih。
[0051]8)菌液涂布在含氨苄抗性的平板上，37°C培养过夜，次日检查和验证大肠杆菌感受态TOP10细胞转化子。
[0052]3.枯草芽孢杆菌spizizen法感受态细胞的制备及转化
[0053]I)芽孢杆菌划线在LB平板上，37°C培养过夜。
[0054]2)用接种针接一单菌落于5mL GM I溶液中，30°C，IOOrpm振荡培养过夜。
[0055]3)次日取0.5mL菌液转接到4.5mL GM I溶液中，37°C，200rpm培养3.5h。
[0056]4)取3mL上一步骤的培养液转接到27mL GM II溶液中，37°C IOOrpm继续培养
1.5h, 5000g离心IOmin收集菌体。
[0057]5)用3mL原培养液上清轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞。
[0058]6)将感受态细胞分装成每管0.5mL，每管菌液中加入适量DNA。于37°C，200rpm振荡培养60min后涂布到氯霉素抗性平板上。[0059]7)待菌液被吸收后，倒置平板，37°C过夜培养过夜，次日检查和验证枯草芽孢杆菌的转化子。
[0060]4.表达载体的构建
[0061]优化的猪圆环病毒0RF2截短基因经BamHl和Smal双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳(条件为:1%琼脂糖凝胶，电压电泳90v，电泳时间为25min)，然后进行切胶，并用胶回收试剂盒回收目的基因0RF2。
[0062]大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体PHT43经BamHl和Smal双酶切，切胶回收约8000bp左右的质粒骨架。[0063]用T4DNA连接酶将0RF2与质粒骨架连接起来，通过转化大肠杆菌T0P10感受态细胞，得到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达质粒PHT43-0RF2。质粒PHT43-0RF2经BamHl和Smal双酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳(条件为:1%琼脂糖凝胶，电压电泳90v，电泳时间为25min)进行验证，由图1中可以看出质粒PHT43-0RF2质粒双酶切后在大约600bp位置有目标条带,说明大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体PHT43已经成功连接上0RF2，送去invitrogen公司测序后,测序结果正确。
[0064]5.表达载体转化枯草芽抱杆菌BS168或WB800
[0065]验证正确的质粒PHT43-0RF2，通过Sp i z i zen化学转化法，转化枯草芽孢杆菌BS168或WB800，构建枯草芽孢杆菌工程菌BS168/PHT43-0RF2或WB800/PHT43-0RF2。分别提取质粒BS168/PHT43-0RF2或质粒WB800/PHT43-0RF2经BamHl和Smal双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳(条件为:1%琼脂糖凝胶，电压电泳90v，电泳时间为25min)进行验证，由图2和图3中可以看出双酶切后在大约600bp位置有目标条带，说明质粒BS168/PHT43-0RF2或质粒WB800/PHT43-0RF2已经成功转化枯草芽孢杆菌BS168或WB800，送去invitrogen公司测序后，测序结果正确。
[0066]6.重组蛋白的表达
[0067]将枯草芽孢杆菌工程菌BS168/PHT43-0RF2或WB800/PHT43-0RF2以1%的接种量转接表达菌株得重组蛋白BS168/PHT43-0RF2或重组蛋白WB800/PHT43-0RF2，当培养OD6tltl至0.6时，进行Western-blot分析，具体步骤如下，分别在重组蛋白BS168/PHT43-0RF2或WB800/PHT43-0RF2中加ImM ITPG诱导6h，将诱导后和作为对照未进行诱导的阳性菌分别离心重悬于ddH20，以2:1加上样处理缓冲液(2%SDS，0.1%溴酚蓝10%甘油)混匀后，沸水煮沸lOmin，离心去菌体，取上清液进行SDS-PAGE，采用120v电压，电泳时间为2h，割胶转印至硝酸纤维素膜后，加入5%脱脂牛奶10mL，于37°C封闭Ih ;加组氨酸标签一抗IOmL (1:2500稀释)，于4°C孵育过夜(12h以上)；加山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶(HRP)抗体IOmL (1:2500稀释)37°C作用lh，在ImL 二氨基联苯胺(DAB)缓冲液中显色。从图4可以看出阳性菌均没有条带，而BS168/PHT43-0RF2或WB800/PHT43-0RF2分别在在23.2kD左右有明显蛋白条带，与预期重组蛋白大小一致，从而说明本发明的猪圆环病毒0RF2截断基因能够成功表达Cap蛋白。
【权利要求】
1.优化的猪圆环病毒0RF2截短基因，其特征在于:所述基因的核苷酸序列为SEQIDN0.1。
2.根据权利要求1所述的优化的猪圆环病毒0RF2截短基因，其特征在于:所述基因在枯草芽孢杆菌中表达。
3.根据权利要求2所述的优化的猪圆环病毒0RF2截短基因，其特征在于:所述枯草芽孢杆菌为BS168或WB800。
【文档编号】C12N15/75GK103834670SQ201410061725
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年2月24日 优先权日:2014年2月24日
【发明者】吕暾, 陈灵艳, 陈晟生, 林拱阳, 乔春晓, 俞建萍, 包松英 申请人:福州大北农生物技术有限公司, 福州大学
【专利摘要】本发明公开了优化的猪圆环病毒ORF2截短基因，所述基因的核苷酸序列为SEQIDNO．1。所述基因在枯草芽孢杆菌中表达。所述枯草芽孢杆菌为BS168或WB800。本发明采用以上技术方案，通过将去除NLS片段并根据密码子偏好性优化后的截短基因，能够成功的在枯草芽孢杆菌中得到表达。
【专利说明】优化的猪圆环病毒0RF2截短基因
【技术领域】
[0001]本发明属于属于生物【技术领域】，特别涉及优化的猪圆环病毒0RF2截短基因。
【背景技术】
[0002]猪圆环病毒(PCV)是一种小的、二十面体对称、无囊膜、共价闭合、单股环状DNA病毒，是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原。根据PCV的致病性及全基因组序列，可分为两个血清型:PCV1与PCV2。PCV2含有两个主要开放阅读框ORFl和0RF2。其中0RF2为702bp，编码233个氨基酸，是病毒的主要结构蛋白，具有良好的免疫原性，是构建重组疫苗的首选基因。
[0003]PVC2的0RF2基因编码Cap蛋白，为病毒的外壳蛋白。Cap蛋白是病毒的主要抗原。市场上已经有以Cap蛋白为主要成份的疫苗产品。目前用做疫苗的Cap蛋白主要由昆虫细胞表达系统生产。还未见微生物发酵生产的疫苗产品。[0004]大肠杆菌是得到广泛应用的蛋白生产菌种。0RF2外壳蛋白在大肠杆菌中的表达已经有不少研究报道。比如，孙继国2009，查振林2005，周伦江2008，陈德坤2010，zhangGaiping2012。但所有上述报道均未能表达0RF2的全长基因序列，而是去除信号肽NLS的截短序列。目前认为，其原因是0RF2外壳蛋白在N端的一段NLS序列，含有大肠的稀有密码子。
[0005]在研究人员的努力下，已有少数研究组成功的在大肠杆菌中成功的表达了 0RF2基因。Celer2007报道，成功的在大肠杆菌的特殊菌种BL21-C0D0N-PLUS中表达了 0RF2全长基因序列。其成功在于运用了特殊的菌种，这种菌种被插入了多个野生型大肠杆菌不具备的稀有密码子基因。另一个技术路径是通过改变原0RF2基因的密码子使用方法，得到优化的适于在大肠杆菌中表达的基因。Bumba2009首先报道了一个优化的序列(GenbankEU376523)，使得0RF2蛋白在大肠杆菌BL21中获得了 10mg/L的表达量。Huang2012等人又报道了一个优化的序列(Genbank AY885225)，同样获得了全长蛋白的成功表达。这两个序列是目前已知的两个优化的0RF2-NLS序列。
[0006]枯草芽孢杆菌作为很有吸引力的外源基因表达的宿主，是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白较理想的宿主。国内外在开发和使用枯草芽孢杆菌作为克隆和表达系统方面做了许多研究，但是到目前为止尚未有枯草芽孢杆菌表达PCV2-0RF2基因序列的的报道。
【发明内容】
[0007]为了解决现有技术中的不足，本发明的目的为提供能够在枯草芽孢杆菌中成功得到表达的优化的猪圆环病毒0RF2截短基因。
[0008]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0009]优化的猪圆环病毒0RF2截短基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID N0.1。
[0010]所述基因在枯草芽孢杆菌中表达。[0011]所述枯草芽孢杆菌为BS168或WB800。
[0012]本发明采用以上技术方案，通过将去除NLS片段并根据密码子偏好性优化后的截短基因，能够成功的在枯草芽孢杆菌中得到表达。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]下面将结合【专利附图】
【附图说明】和【具体实施方式】对本发明做进一步详细的说明。
[0014]图1为本发明优化的猪圆环病毒0RF2截短基因的表达载体质粒PHT43-0RF2双酶切后经琼脂糖凝胶电泳的图谱(1.PHT43-0RF2经双酶切的电泳条带；2.PHT43-0RF2未酶切的电泳条带；3.DL2000DNA Ladder Marker)；
[0015]图2为本发明优化的猪圆环病毒0RF2截短基因的表达质粒PHT43-0RF2成功转化枯草芽孢杆菌168后，提取表达菌株中质粒经BamHl和Smal双酶切后经琼脂糖凝胶电泳的图谱(1.BS168/PHT43-0RF2经双酶切的电泳条带；2.BS168/PHT43-0RF2未酶切的电泳条带；3.DL2000DNA Ladder Marker)；
[0016]图3为本发明优化的猪圆环病毒0RF2截短基因的表达质粒PHT43-0RF2成功转化枯草芽孢杆菌WB800后，提取表达菌株中质粒经BamHl和Smal双酶切后经琼脂糖凝胶电泳的图谱(1.WB800/PHT43-0RF2经双酶切的电泳条带；2.WB800/PHT43-0RF2未酶切的电泳条带；3.DL2000DNA Ladder Marker)；
[0017]图4为本发明优化的猪圆环病毒0RF2截短基因的表达菌株诱导表达重组蛋白的ffestern-blot 分析结果(1.BS168/PHT43-0RF2 诱导表达的重组蛋白；2.WB800/PHT43-0RF2诱导表达的重组蛋白；3.B S168/PHT43-0RF2未诱导；4.WB800/PHT43-0RF2未诱导)。
【具体实施方式】
[0018]本发明的优化的猪圆环病毒0RF2截短基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ IDN0.1。
[0019]为便于后续纯化，在本发明的优化的猪圆环病毒0RF2截短基因的3’末端引入6XHis标签后，再在其两端分别引入BamHl和Smal的酶切位点送生物公司合成此序列。
[0020]所述基因在枯草芽孢杆菌中表达。
[0021]所述枯草芽孢杆菌为BS168或WB800。
[0022]为了验证本发明的优化的猪圆环病毒0RF2截短基因能够在枯草芽孢杆菌中得到表达，本发明采用以下试验进行验证。
[0023]胶回收试剂盒、质粒回收试剂盒均购自生工生物工程(上海)有限公司；BamHl、Smal、T4DNA Ligase、DL2000核酸分子量标准物、低分子量蛋白标准物均购自TaKaRa公司。
[0024]主要溶液和试剂的配制:
[0025]I)碱裂解法制备质粒DNA所用溶液:
[0026]溶液1:50mM glucose, 25mM Tris-HCl (pH8.0)，IOmM EDTA (pH8.0)。
[0027]溶液II:0.2M NaOH, 1%SDS (m/v)(现配现用)。
[0028]溶液III:3M KAC60.0mL，冰醋酸 11.5mL, H2O 定容至 100mL。
[0029]2)0.1M CaCl2:1.47g CaCl2 溶于 100ml 纯水中，灭菌，4°C保存备用。
[0030]3)枯草芽胞杆菌感受态细胞制备用培养基[0031]IOX 最低盐溶液=K2HPO4.3Η2091.7g, KH2P0430g, (NH4)2SO4IOg,柠檬酸钠 5g，MgSO4.7H201g，在蒸馏水中依次溶解，定容至500mL。
[0032]GM I 溶液:1X 最低盐溶液 95mL, 50%glucoselmL, 5%Casamino Acid0.4mL,10%Yeast extract ImL, 2mg/mL L_trp 溶液 2.5mL。
[0033]GM II 溶液:I X 最低盐溶液 195mL, 50%glucose2mL, 5%Casamino Acid0.16mL,10%Yeast extract0.08mL,0.5M MgCl2ImL, 0.1M CaCl2ImL, 2mg/mL L_trp 溶液 lmL。
[0034]1.质粒PHT43-0RF2的小量提取
[0035]I)取1.5mL菌液于离心管中，12000rpm离心2min,弃上清。
[0036]2)菌体沉淀重悬于100 μ L溶液I中，室温下放置5-10min。
[0037]3)加入新配制的溶液II 200 μ L，盖紧管口，快速温和颠倒离心管数次，混匀，冰浴5min，使细胞膜裂解。
[0038]4)加入150 μ L预冷的溶液III,见白色絮状沉淀,于冰上放置5min。
[0039]5) 12000rpm离心lOmin，上清液移入干净离心管中，加入等体积(450 μ L)的酚/氯仿，振荡混匀，12000rpm离心5min。
[0040]6)小心移出上清(约400 μ L)于一新微量离心管中，加入2倍体积(800 μ L)预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2_5min, 12000rpm离心lOmin。
[0041]7)弃上清,加入1ιΛ70%乙醇洗沉淀一次，12000rpm离心5min。
[0042]8)吸除上清液，室温干燥，将沉淀质粒PHT43-0RF2溶于20 μ LTE缓冲液中进行保`存。
[0043]2.大肠杆菌感受态TOPlO细胞的制备及转化
[0044]I)挑取TOPlO单菌落于LB培养基中，37°C培养过夜。
[0045]2)第二天，按1:100转接到新的LB培养基中，培养至OD6tltl为0.3-0.5。
[0046]3)取 ImL 菌液，冰浴 lOmin, 12000rpm 离心 lmin。
[0047]4)弃上清，加入ImL0.1M的CaCl2,混匀，冰浴30min。
[0048]5) 12000rpm离心lmin,弃上清,加入100 μ L0.1M的CaCl2,混匀，即为大肠杆菌感受态TOPlO细胞。
[0049]6)适量DNA立即加入100 μ L制备好的大肠杆菌感受态TOPlO细胞中，冰浴30min。
[0050]7) 42°C热击45s，冰浴2min，再加入500 μ L不含抗生素的LB培养基，37°C培养Ih。
[0051]8)菌液涂布在含氨苄抗性的平板上，37°C培养过夜，次日检查和验证大肠杆菌感受态TOP10细胞转化子。
[0052]3.枯草芽孢杆菌spizizen法感受态细胞的制备及转化
[0053]I)芽孢杆菌划线在LB平板上，37°C培养过夜。
[0054]2)用接种针接一单菌落于5mL GM I溶液中，30°C，IOOrpm振荡培养过夜。
[0055]3)次日取0.5mL菌液转接到4.5mL GM I溶液中，37°C，200rpm培养3.5h。
[0056]4)取3mL上一步骤的培养液转接到27mL GM II溶液中，37°C IOOrpm继续培养
1.5h, 5000g离心IOmin收集菌体。
[0057]5)用3mL原培养液上清轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞。
[0058]6)将感受态细胞分装成每管0.5mL，每管菌液中加入适量DNA。于37°C，200rpm振荡培养60min后涂布到氯霉素抗性平板上。[0059]7)待菌液被吸收后，倒置平板，37°C过夜培养过夜，次日检查和验证枯草芽孢杆菌的转化子。
[0060]4.表达载体的构建
[0061]优化的猪圆环病毒0RF2截短基因经BamHl和Smal双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳(条件为:1%琼脂糖凝胶，电压电泳90v，电泳时间为25min)，然后进行切胶，并用胶回收试剂盒回收目的基因0RF2。
[0062]大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体PHT43经BamHl和Smal双酶切，切胶回收约8000bp左右的质粒骨架。[0063]用T4DNA连接酶将0RF2与质粒骨架连接起来，通过转化大肠杆菌T0P10感受态细胞，得到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达质粒PHT43-0RF2。质粒PHT43-0RF2经BamHl和Smal双酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳(条件为:1%琼脂糖凝胶，电压电泳90v，电泳时间为25min)进行验证，由图1中可以看出质粒PHT43-0RF2质粒双酶切后在大约600bp位置有目标条带,说明大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体PHT43已经成功连接上0RF2，送去invitrogen公司测序后,测序结果正确。
[0064]5.表达载体转化枯草芽抱杆菌BS168或WB800
[0065]验证正确的质粒PHT43-0RF2，通过Sp i z i zen化学转化法，转化枯草芽孢杆菌BS168或WB800，构建枯草芽孢杆菌工程菌BS168/PHT43-0RF2或WB800/PHT43-0RF2。分别提取质粒BS168/PHT43-0RF2或质粒WB800/PHT43-0RF2经BamHl和Smal双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳(条件为:1%琼脂糖凝胶，电压电泳90v，电泳时间为25min)进行验证，由图2和图3中可以看出双酶切后在大约600bp位置有目标条带，说明质粒BS168/PHT43-0RF2或质粒WB800/PHT43-0RF2已经成功转化枯草芽孢杆菌BS168或WB800，送去invitrogen公司测序后，测序结果正确。
[0066]6.重组蛋白的表达
[0067]将枯草芽孢杆菌工程菌BS168/PHT43-0RF2或WB800/PHT43-0RF2以1%的接种量转接表达菌株得重组蛋白BS168/PHT43-0RF2或重组蛋白WB800/PHT43-0RF2，当培养OD6tltl至0.6时，进行Western-blot分析，具体步骤如下，分别在重组蛋白BS168/PHT43-0RF2或WB800/PHT43-0RF2中加ImM ITPG诱导6h，将诱导后和作为对照未进行诱导的阳性菌分别离心重悬于ddH20，以2:1加上样处理缓冲液(2%SDS，0.1%溴酚蓝10%甘油)混匀后，沸水煮沸lOmin，离心去菌体，取上清液进行SDS-PAGE，采用120v电压，电泳时间为2h，割胶转印至硝酸纤维素膜后，加入5%脱脂牛奶10mL，于37°C封闭Ih ;加组氨酸标签一抗IOmL (1:2500稀释)，于4°C孵育过夜(12h以上)；加山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶(HRP)抗体IOmL (1:2500稀释)37°C作用lh，在ImL 二氨基联苯胺(DAB)缓冲液中显色。从图4可以看出阳性菌均没有条带，而BS168/PHT43-0RF2或WB800/PHT43-0RF2分别在在23.2kD左右有明显蛋白条带，与预期重组蛋白大小一致，从而说明本发明的猪圆环病毒0RF2截断基因能够成功表达Cap蛋白。
【权利要求】
1.优化的猪圆环病毒0RF2截短基因，其特征在于:所述基因的核苷酸序列为SEQIDN0.1。
2.根据权利要求1所述的优化的猪圆环病毒0RF2截短基因，其特征在于:所述基因在枯草芽孢杆菌中表达。
3.根据权利要求2所述的优化的猪圆环病毒0RF2截短基因，其特征在于:所述枯草芽孢杆菌为BS168或WB800。
【文档编号】C12N15/75GK103834670SQ201410061725
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年2月24日 优先权日:2014年2月24日
【发明者】吕暾, 陈灵艳, 陈晟生, 林拱阳, 乔春晓, 俞建萍, 包松英 申请人:福州大北农生物技术有限公司, 福州大学
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