一种猪hev总抗体elisa检测试剂盒的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法，该猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法包括以下步骤：制备HEV包被抗原；制备HEV标记抗原；HEV标记抗原-HRP标记物的制备；采用碳酸盐缓冲液以一定比例将S抗原稀释，100μl/孔加入到酶标板，封装于加有干燥剂的铝膜袋中，包被完毕。本发明建立了一种快速高效检测猪HEV总抗体ELISA检测方法，本发明依据双抗原夹心法原理，包被抗原与血清中抗体产生特异性结合，结合抗原抗体复合物与标记抗原再次产生抗原抗体反应，两个抗原结合不同的抗原结合位点，灵敏度高，特异性好，重复性好，为戊型肝炎病毒流行病学大规模调查提供相应技术保障，也为更好的预防和控制猪HEV疫病的流行提供了理论依据。
【专利说明】—种猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于戊型肝炎病毒的检测【技术领域】，尤其涉及一种猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法。
【背景技术】
[0002]戍型肝炎(Hepatitis E)是一种由戍型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的经消化道传播的人畜共患传染病。该病在青少年中容易发展为暴发性肝炎，可以导致孕妇流产，病死率高达21%。HEV分布广泛，危害严重。
[0003]世界各国相继都有猪源HEV相关的报道，与人类HEV序列比对结果发现两者具有极高的同源性，随后又发现提取的RNA病毒可以感染黑猩猩和恒河猴。随后，相继的实验结果表明猪戊型肝炎是一种人畜共患病，猪作为戊型肝炎病毒的主要自然宿主，HEV平均感染率最高可达83.4%，许多携带戊肝病毒的猪群并不表现发病状态(Meng X J et al.，1997)。猪是人类重要的肉食来源，同时作为人类器官移植的主要供体，有效控制戊型肝炎就必须切断猪-人传播途径。这就凸现了猪戊型肝炎病毒的检测诊断的意义。
[0004]由于嗜肝病毒本身的生物学特性，目前还没有成熟的体外细胞培养系统可以大量增殖病毒粒子，加上病毒本身对外界环境抵抗力弱，至今还没有开发出令人满意的猪戊型肝炎诊断试剂盒和疫苗。
[0005]HEV为RNA病毒，对HEVRNA的检测主要为采用PCR方法进行，但是由于各地所用引物不尽相同，检测结果不尽人意；而且由于病毒RNA在血液中存在时间较短，病毒含量低，RNA易于降解等因素，使得检测HEV RNA存在一定的困难。因此，目前对HEV的诊断主要通过检测血清中抗HEV IgG和抗HEV IgM来进行诊断。
[0006]免疫学检测方法特异性高，敏感性强，简便快速等优点，已成为HEV血清学检测最常用的方法，现在随着生物学技术的不断发展，可以采用基因工程方法表达相关蛋白来建立一系列血清学检测方法。本发明采用双抗原夹心法建立猪戊型肝炎病毒总抗体ELISA检测试剂盒，旨在快速准确高效的对猪血清中戊型肝炎病毒总抗体进行检测，从而建立一种灵敏度好、特异性高的免疫学检测方法用于检测和评估猪群的HEV抗体水平，对于猪群戊型肝炎病毒的临床诊断和预防控制具有重要意义。
[0007]目前，市场上戊型肝炎病毒的检测主要采用血清学ELISA检测法，此产品主要应用于人血清抗体的检测，还没有相关产品用于猪HEV抗体的检测，猪作为戊型肝炎病毒的主要自然宿主，由于缺乏相关可行的检测产品，暂时也没有猪群HEV抗体水平的检测报告。猪源HEV与人类HEV序列具有极高的同源性，且其RNA病毒还可以感染黑猩猩和恒河猴等其它动物，为了弥补这一技术空白，开发了猪源HEV总抗体ELISA检测方法，克服了现有试剂盒只能特异性检测人戊型肝炎病毒的不足，该产品为第一个专门用于检测动物戊型肝炎总抗体的免疫产品系列。
【发明内容】
[0008]本发明在于提供一种猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法，旨在解决现有戊型肝炎病毒的试剂盒只能特异性检测人戊型肝炎病毒，而不能检测猪源的戊型肝炎病毒的问题。
[0009]本发明是这样实现的，一种猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法，该猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法包括以下步骤:
[0010]第一步，HEV包被抗原的制备:
[0011]首先PCR扩增猪源SWCH189株HEV 0RF2基因部分的两个片段，上下游引物分别带有BamH I和Not I酶切位点；
[0012]FS为S片段上游引物，带有BamH I酶切位点，RS为片段下游引物，带有Not I酶切位点；FP12为P12片段上游引物，带有BamH I酶切位点，RP12为片段下游引物，带有Not I酶切位点；
[0013]PCR片段扩增后回收，采用BamH I和Not I双酶切，连接到pMD18_T载体，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α，挑取转化子，小提质粒，用BamH I和Not I酶切鉴定，鉴定阳性克隆分别命名为T-S和T-P12 ; [0014]将pET32a ( + )与鉴定的克隆质粒分别以BamH I /Not I进行消化，进行琼脂糖电泳，胶回收目的片段后进行连接，构建可在大肠杆菌中表达的重组质粒，命名PET-S和PET-P12，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α，挑取转化子，小提质粒，用BamH I和Not I限制性内切酶进行酶切鉴定；
[0015]阳性重组质粒pET-S和pET-P12转化Rossetta (DE3)感受态细胞，挑选单克隆菌落于氨苄西林钠LB培养液中培养10h，菌液以1:100的比例加入到IL含100 μ g/ml氨苄西林钠的LB培养基37°C振荡培养至0D600=0.8，加入的终浓度为0.5mmol/L的IPTG，25°C诱导5h，4°C 6000r/min离心15分钟收集菌体，菌体采用20mll%Triton X-100的PBS悬浮，超声波破碎，4°C 12000r/min离心30分钟，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE，分析确定表达产物在大肠杆菌的存在形式，结果发现重组蛋白以包涵体的形式存在。
[0016]目的蛋白进行SDS-PAGE，条带与预期大小相一致，命名为S蛋白，纯化的S蛋白为包被抗原；
[0017]第二步，HEV标记抗原的制备:
[0018]将阳性克隆pET-P12于Amp+LB培养液中培养10h，菌液以1:100的比例加入到IL含100 μ g/ml氨苄西林钠的LB培养基37°C振荡培养至0D600=0.8，加入终浓度为lmmol/L的IPTG，25°C诱导5h，4°C 6000r/min离心15分钟收集菌体，菌体采用20mll%Triton X-100的PBS悬浮，超声波破碎，4°C 12000r/min离心30分钟，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE，确定表达产物以包涵体的形式存在于沉淀，进行蛋白的纯化，纯化得到的蛋白命名为P12蛋白，为标记蛋白；
[0019]第三步，HEV标记抗原-HRP标记物的制备,具体包括:
[0020]步骤一，HEV标记抗原和HRP的偶联采用NaIO4氧化法，首先将纯化蛋白P12于PBS溶液中4°C透析过夜；
[0021]步骤二，紫外分光光度计测定纯化蛋白浓度；
[0022]步骤三，分析天平秤取HRPlOmg溶于2ml超纯水中制备终浓度为5mg/ml的HRP溶液，分析天平秤取NaIO4，溶于超纯水中制备终浓度为20mg/ml的NaIO4溶液备用；[0023]步骤四，缓慢滴加225 μ I NaIO4溶液于2ml HRP溶液中，室温下避光静置20分钟；
[0024]步骤五，加入20 μ I乙二醇于HRP混合溶液中，之后室温下静置30分钟；
[0025]步骤六,取lml2.lmg/ml的标记蛋白P12缓慢逐滴加入到活化好的HRP溶液中；
[0026]步骤七，然后将P12蛋白-HRP结合物分别于50mM CB pH9.6的溶液中4°C避光透析2.5个小时；
[0027]步骤八，分析天平称量NaBH4溶于水中，制备终浓度为4mg/ml的NaBH4溶液；
[0028]步骤九，将透析袋取出，加入162 μ I的NaBH4溶液；
[0029]步骤十，室温下在摇床上轻轻震动2个小时；
[0030]步骤^^一，标记物在PBS溶液中4°C透析过夜；
[0031]步骤十二，透析结束后1:1比例加入甘油，-20度保存，此标记物下文称为HRP-PI2 ；
[0032]第四步，采用碳酸盐缓冲液以一定比例将S抗原稀释，100 μ I/孔加入到酶标板,4 °C 包被过夜，次日采用 PBST (IOmM PB, 150mM NaCl, 0.05%Tween-20, pH7.4)洗涤液洗板三次，最后一次拍干，150 μ I/孔加入含30%新生牛血清，8%蔗糖，5%牛血清白蛋白，150mM NaCl的P H7.4,10mM PB封闭液，4°C封闭12小时，次日甩掉孔内液体，拍干，置室温20-25 °C、湿度20%-25%、有通风设备的干燥房间内风干过夜，封装于加有干燥剂的铝膜袋中，包被完毕。
[0033]进一步,在第一步中的蛋白纯化采用Invitrogene clonetech蛋白纯化柱,具体步骤如下:
[0034]步骤一，准备IL表达菌体细胞，取5ml菌液12000r/min离心2min，弃去上清，加入lmmol/LPH7.4的PBS充分悬浮，4°C 6000r/min离心15min,保留沉淀,如此反复离心3次；
[0035]步骤二，沉淀于_70°C放置5min，之后取出溶化；如此反复冻融循环3~5次，以实现最大的裂解；
[0036]步骤三,加入100 μl 的 1 XFastBreakTM cell Lysis Reagent 溶液于沉淀中，充分悬浮；
[0037]步骤四，加1 μ I的DNase 1 ,室温下200r/min摇震30min ；
[0038]步骤五，加入30μ I的N1-Particles或者加入0.03g的NaCl固体；
[0039]步骤六,采用移液器反复吸吹混合10次后，室温静置孵育30min ；
[0040]步骤七，将EP管放入碳磁力架上30s，看到镍柱被吸附到靠近磁力架的一边，用移液器将剩余的液体吸出来；
[0041]步骤八，加入150 μ I的Bind/Wash Buffer,反复吸吹混合10次，室温静置孵育IOmin,之后放入磁力架30s，将剩余的液体吸出来，采用同样的液体反复洗两遍，最后一次的液体务必吸干净，不要有残留；
[0042]步骤九,加入100 μ I的Elution Buffer,多次混合吹打后于磁力架上作用30s后保留不同菌体蛋白的液体并分别标号，同时将纯化的蛋白和各自的镍柱进行蛋白电泳分析结果。
[0043]进一步，该猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的具体使用方法为:
[0044]酶标板中每孔加入10(^1样品稀释液，样品稀释液为？!17.4?8，1501111 NaCl，5%牛血清白蛋白，0.5%鱼明胶，2%Tween-20，0.l%Triton X-100,0.1%硫柳汞，加入50 μ I待测样品、选择健康猪阴性血清作为阴性参照样品、选择HEV抗体阳性猪血清作为阳性参照样品对照，37°C温育30分钟；用PBST洗涤液洗板五次，最后一次拍干，100 μ I/孔加入含有20%新生牛血清，以一定比例稀释的HRP-P12缓冲液，37°C温育30分钟；用PBST洗涤液洗板五次，拍干;
[0045]每孔加入含0.5%过氧化氢尿素、4.76%三水合乙酸钠、0.9%冰醋酸的显色剂A及含0.32%TMB、5mM柠檬酸、0.5mMEDTA_2Na、5%甲醇、2% 二甲基甲酰胺的显色剂B各50 μ 1，37 °C避光显色15分钟，每孔加50 μ 1，含2Μ硫酸的终止液终止反应，酶标仪450nm波长空白孔校零后读取OD值。
[0046]进一步，临界值COV计算:C0V=阴性对照平均OD值X1.5，阴性对照OD值低于0.065按0.065计算，高于0.065按实际OD值计算，待测样品OD值≥COV为阳性，待测样品OD值〈C0V为阴性。
[0047]进一步，ELISA试剂盒采用双抗原夹心法原理，S抗原采用pH9.6CB稀释至4 μ g/ml进行包板，之后4°C包被过夜；酶标封闭液0.5%BSA, 20mM PB, 150mM NaCl，0.1%稳定剂T，0.01%Proclin300加入150 μ I进行封闭；阳性样本的稀释；P12_HRP标记酶标记过程中，HRP与P12的摩尔比为1:5，之后采用酶稀液0.5%BSA, 20mM PB, 150mM NaCl，5%新生牛血清，0.01%Proclin300稀释2000倍后用于ELISA试剂盒的标记。
[0048]本发明提供的猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法，根据猪源HEV 0RF2蛋白结构信息，将猪源HEV 0RF2进行两个抗原片段原核表达，S结构域蛋白和P12结构域蛋白。ELISA试剂盒中，S蛋白纯化后作为包被抗原，P12蛋白纯化后进行辣根过氧化物标记作为标记抗原；采用猪源swCH189株HEV毒株，根据HEV病毒蛋白结构现有的研究成果，通过采用相关生物学软件分析其衣壳蛋白结构，并成功表达不同的衣壳蛋白片段，经过不同实验方法的研究及探索，筛选出最佳实验方法及抗原组合，建立了一种快速高效检测猪HEV总抗体的ELISA检测方法；本发明的灵敏度高，特异性好，重复性好，为戊型肝炎病毒流行病学大规模调查提供一定的技术保障，也为更好的预防和控制HEV疫病的流行提供技术支撑；采用双抗原夹心法原理，包被抗原与血清中抗体产生特异性结合，结合抗原抗体复合物与标记抗原再次产生抗原抗体反应，两个抗原结合不同的抗原结合位点，特异性好，灵敏度闻。
【专利附图】
【附图说明】
[0049]图1是本发明实施例提供的猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法流程图；
[0050]图2是本发明实施例提供的S基因的PCR扩增示意图；
[0051]图中:M:DL2000marker;1: S 基因扩增片段；
[0052]图3是本发明实施例提供的P12基因的PCR扩增示意图；
[0053]图中:Μ:λ-EcoT14 I digest marker ;1:P12 基因扩增片段;
[0054]图4是本发明实施例提供的S基因的酶切鉴定示意图；
[0055]图中:M:DL2000marker ;1: S基因酶切鉴定片段；
[0056]图5是本发明实施例提供的P12基因的酶切鉴定示意图；
[0057]图中:M:DL2000marker ；1:P12基因酶切鉴定片段；
[0058]图6是本发明实施例提供的His-S蛋白的SDS-PAGE分析示意图；[0059]图7是本发明实施例提供的His-S蛋白纯化示意图；
[0060]图8是本发明实施例提供的His_P12蛋白的SDS-PAGE分析示意图；
[0061]图9是本发明实施例提供的His_P12蛋白纯化示意图。
【具体实施方式】
[0062]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0063]下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0064]如图1所示，本发明实施例的猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法包括以下步骤:
[0065]SlOl:制备HEV包被抗原； [0066]S102:制备HEV标记抗原；
[0067]S103 =HEV标记抗原-HRP标记物的制备；
[0068]S104:采用碳酸盐缓冲液以一定比例将S抗原稀释，100 μ I/孔加入到酶标板，封装于加有干燥剂的铝膜袋中，包被完毕。
[0069]结合本发明的具体实施例对本发明做进一步的说明:
[0070]本发明的实施例包括以下步骤:
[0071]第一步，HEV包被抗原的制备:
[0072]首先PCR扩增猪源SWCH189株HEV 0RF2 (兰州兽医研究所传染病室保存)基因部分的两个片段，上下游引物设计如表1和表2所示，分别带有BamH I和Not I酶切位点；
[0073]表1:SWCH189株S片段设计引物为:
[0074]
【权利要求】
1.一种猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，该猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法包括以下步骤: 第一步，HEV包被抗原的制备: 首先PCR扩增猪源SWCH189株HEV 0RF2基因部分的两个片段，上下游引物分别带有BamH I和Not I酶切位点； FS为S片段上游引物，带有BamH I酶切位点，RS为片段下游引物，带有Not I酶切位点；FP12为P12片段上游引物，带有BamH I酶切位点，RP12为片段下游引物，带有Not I酶切位点； PCR片段扩增后回收，采用BamH I和Not I双酶切，连接到pMD18_T载体，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α，挑取转化子，小提质粒，用BamH I和Not I酶切鉴定，鉴定阳性克隆分别命名为T-S和T-P12; 将pET32a ( + )与鉴定的克隆质粒分别以BamH I /Not I进行消化，进行琼脂糖电泳，胶回收目的片段后进行连接，构建可在大肠杆菌中表达的重组质粒，命名PET-S和PET-P12，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α，挑取转化子，小提质粒，用BamH I和Not I限制性内切酶进行酶切鉴定； 阳性重组质粒PET-S和pET-P12转化Rossetta (DE3)感受态细胞，挑选单克隆菌落于氨节西林钠LB培养液中培养IOh,菌液以1:100的比例加入到IL含100 μ g/ml氨节西林钠的LB培养基37°C振荡培养至0D600=0.8，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，25°C诱导5h，.4°C 6000r/min离心15分钟收集菌体，菌体采用20mll%TritonX-100的PBS悬浮，超声波破碎，4°C 12000r/min离 心30分钟，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE，分析确定表达产物在大肠杆菌的存在形式，结果发现重组蛋白以包涵体的形式存在； 目的蛋白进行SDS-PAGE，条带与预期大小相一致，命名为S蛋白，纯化后的S蛋白为包被抗原； 第二步，HEV标记抗原的制备: 将阳性克隆PET-P12于Amp+LB培养液中培养10h，菌液以1:100的比例加入到IL含.100 μ g/ml氨苄西林钠的LB培养基37°C振荡培养至0D600=0.8，加入终浓度为lmmol/L的IPTG, 25°C诱导5h，4°C 6000r/min离心15分钟收集菌体，菌体采用20mll%Triton X-100的PBS悬浮，超声波破碎，4°C 12000r/min离心30分钟，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE，确定表达产物以包涵体的形式存在于沉淀，进行蛋白的纯化，纯化得到的蛋白命名为P12蛋白，为标记蛋白； 第三步，HEV标记抗原-HRP标记物的制备，具体包括: 步骤一，HEV标记抗原和HRP的偶联采用NaIO4氧化法，首先将纯化蛋白P12于PBS溶液中4°C透析过夜； 步骤二，紫外分光光度计测定纯化蛋白浓度； 步骤三，分析天平秤取HRPlOmg溶于2ml超纯水中制备终浓度为5mg/ml的HRP溶液，分析天平秤取NaIO4，溶于超纯水中制备终浓度为20mg/ml的NaIO4溶液备用； 步骤四，缓慢滴加225 μ I NaIO4溶液于2ml HRP溶液中，室温下避光静置20分钟； 步骤五，加入20 μ I乙二醇于HRP混合溶液中，之后室温下静置30分钟； 步骤六，取lml2.lmg/ml的标记蛋白P12缓慢逐滴加入到活化好的HRP溶液中；步骤七，然后将P12蛋白-HRP结合物分别于50mM CB pH9.6的溶液中4°C避光透析2.5个小时； 步骤八，分析天平称量NaBH4溶于水中，制备终浓度为4mg/ml的NaBH4溶液； 步骤九，将透析袋取出，加入162 μ I的NaBH4溶液； 步骤十，室温下在摇床上轻轻震动2个小时； 步骤十一，标记物在PBS溶液中4°C透析过夜； 步骤十二，透析结束后1:1比例加入甘油，-20度保存，此标记物下文称为HRP-P12 ；第四步，采用碳酸盐缓冲液以一定比例将S抗原稀释，100 μ I/孔加入到酶标板，4°C包被过夜，次日采用PBST(10mM PB, 150mM NaCl,0.05%Tween_20，pH7.4)洗涤液洗板三次，最后一次拍干，150 μ I/孔加入含30%新生牛血清，8%蔗糖，5%牛血清白蛋白，150mM NaCl的P H 7.4，IOmM PB封闭液，4°C封闭12小时，次日甩掉孔内液体，拍干，置室温20-25°C、湿度20%-25%、有通风设备的干燥房间内风干过夜，封装于加有干燥剂的铝膜袋中，包被完毕。
2.如权利要求1所述的猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，在第一步中的蛋白纯化采用Invitrogene clonetech蛋白纯化柱,具体步骤如下: 步骤一，准备IL表达菌体细胞，取5ml菌液12000r/min离心2min，弃去上清，加入lmmol/LPH7.4的PBS充分悬浮，4°C 6000r/min离心15min,保留沉淀,如此反复离心3次；步骤二，沉淀于_70°C放置5min，之后取出溶化；如此反复冻融循环3~5次，以实现最大的裂解； 步骤三,加入100 μ I的I XFastBreakTM cell Lysis Reagent溶液于沉淀中，充分悬浮; 步骤四，加入1μ I的DNase I ,室温下200r/min摇震30min ； 步骤五，加入30μ I的N1-Particles或者加入0.03g的NaCl固体； 步骤六，采用移液器反复吸吹混合10次后，室温静置孵育30min ； 步骤七，将EP管放入碳磁力架上30s，看到镍柱被吸附到靠近磁力架的一边，用移液器将剩余的液体吸出来； 步骤八，加入150 μ I的Bind/Wash Buffer,反复吸吹混合10次，室温静置孵育lOmin，之后放入磁力架30s，将剩余的液体吸出来，采用同样的液体反复洗两遍，最后一次的液体务必吸干净，不要有残留； 步骤九，加入100 μ I的Elution Buffer,多次混合吹打后于磁力架上作用30s后保留不同菌体蛋白的液体并分别标号，同时将纯化的蛋白和各自的镍柱进行蛋白电泳分析结果O
3.如权利要求1所述的猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，该猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的具体使用方法为: 酶标板中每孔加入100 μ I样品稀释液，样品稀释液为PH7.4ΡΒ, 150mM NaCl，5%牛血清白蛋白，0.5%鱼明胶，2%Tween-20，0.l%TritonX-100,0.1%硫柳汞，加入50 μ I待测样品，选择健康猪阴性血清作为阴性参照样品，选择制备的HEV抗体阳性猪血清作为阳性参照样品对照，37°C温育30分钟；用PBST洗涤液洗板五次，最后一次拍干，每孔加入100 μ I含有20%新生牛血清的以一定比例稀释的HRP-P12缓冲液，37°C温育30分钟；用PBST洗涤液洗板五次，拍干；每孔加入含0.5%过氧化氢尿素、4.76%三水合乙酸钠、0.9%冰醋酸的显色剂A及含.0.32%TMB、5mM柠檬酸、0.5m MEDTA_2Na、5%甲醇、2%二甲基甲酰胺的显色剂B各50 μ 1，37°C避光显色15分钟，每孔加50 μ 1，含2Μ硫酸的终止液终止反应，酶标仪450nm波长空白孔校零后读取OD值。
4.如权利要求3所述的猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，临界值(Cut off Value (COV))计算:COV=阴性对照平均OD值X1.5，阴性对照OD值低于0.065按0.065计算，高于0.065按实际OD值计算，待测样品OD值≥COV为阳性，待测样品OD值〈C0V为阴性。
5.如权利要求1所述的猪HEV总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，ELISA试剂盒采用双抗原夹心法原理，S抗原采用pH9.6CB稀释至4 μ g/ml进行包板，之后4°C包被过夜；酶标封闭液 0.5%BSA, 20mM PB, 150mMNaCl,0.1% 稳定剂 Τ，0.01%Proclin300加入150 μ I进行封闭；阳性样本的稀释；P12-HRP标记酶标记过程中，HRP与P12的摩尔比为 1:5，之后采用酶稀液0.5%834，20禮 PB, 150mM NaCl，5% 新生牛血清，0.01%Proclin300稀释2000倍后用于ELISA试剂盒的标记。
【文档编号】C12N15/70GK103837680SQ201410084515
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月7日 优先权日:2014年3月7日
【发明者】兰喜, 杨彬, 常晓依, 柳纪省, 张韵, 殷相平, 李宝玉, 李学瑞, 李志勇, 方玉萍 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所