玉米胚乳特异表达启动子14kD zein启动子及其克隆方法
【专利摘要】本发明涉及玉米胚乳特异表达启动子14kD?zein启动子及其克隆方法。该启动子序列为下列之一：i）SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；ii）SEQIDNO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由i）衍生的核苷酸序列。本发明从克隆玉米胚乳特异表达启动子14kD?zein启动子入手，通过对14kD?zein启动子的功能分析，从实验水平验证了该启动子适用于启动目标基因在玉米胚乳中特异性表达，而在其他组织中低表达或不表达。为植物基因工程表达载体构建提供了合适的调控元件，为实验室其他课题的研究进行提供了新的材料。
【专利说明】玉米胚乳特异表达启动子14kD zein启动子及其克隆方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种玉米胚乳特异表达启动子14kD zein启动子及其克隆方法。
技术背景
[0002]玉米(Zea mays L.)，又名玉蜀黍，是重要的粮食作物、优良的饲料和工业原料。因此，大量研究致力于将外源基因转入玉米以培育出满足人们需求的新品种。现今的转基因技术通常采用组成型强启动子使驱动外源基因高效表达。其缺点在于组成型启动子使外源基因在植株中全方位表达，造成不必要的能源浪费。其次，组成型启动子常引起基因多效性，以及引起食品安全性问题。
[0003]将外源基因在转基因植株中定位表达不仅可以降低植株负担、减轻对作物农艺性状的影响，还可以提高外源基因在特定部位的表达量，同时尽可能地避免食品安全性问题。组织特异性启动子在植物发育过程中能够在时间和空间上有效地调控目的基因的特异性表达，使目的基因表达产物在特定的空间区域积累，进而按照人们的意愿改进代谢途径、提高组织中营养物质含量、调控转基因植物继代繁殖、利用种子便利地获得工业新产品和医药新化合物等。因此，良好的组织特异性启动子已成为转基因研究中最具有发展前景的外源基因启动元件。
[0004]当前的植物基因工程中还常使用一些来自于病毒、细菌等的调控元件，也有引起生物安全性问题的隐患。因此，克隆来源于植物自身的具有组织特异性的启动子不仅为研究植物生长发育的调控机理提供了材料，为植物基因工程研究提供了更多调控元件的选择，同时还在某种程度上 避免了生物安全性问题。本试验中研究的启动子都是来自植物自身的具有组织特异性的启动子。
[0005]玉米胚乳中的蛋白质成分根据能否溶解于70%乙醇溶液可分为两种类型，醇溶蛋白和非醇溶蛋白。19kD、22kD zein是由zei/72基因家族编码的,而14kD zein是由
基因家族中的及i基因编码的。1990年Manuel Reina等人从玉米W64A基因组中克隆到β -zein中的14kD zein基因，序列比对发现与NCBI中的序列有98%的相似度。14kD zein基因编码醇溶蛋白，在胚乳中特异表达。
[0006]目前对于组织特异性启动子的应用主要有以下方面:①改良农作物品质，提高作物的抗冻、抗旱、抗盐能力，防止水果腐烂改良花卉品质、控制观赏花卉的颜色提高植物的抗病性、抗虫性和抗除草剂能力；④开发生物反应器用于生物制药创建雄性不育系和恢复系；⑥用于植物的分化发育研究等。
[0007]谷类、油类作物的种子是植物基因工程改良的重要材料。因此，种子特异性启动子的研究对植物基因工程的发展和人们生产生活水平的提高具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0008]本发明的目的之一在于提供玉米胚乳中特异表达启动子14kD zein的启动子序列。[0009]本发明的目的之二在于提供该启动子序列的克隆方法。
[0010]为了实现本发明目的，本发明的采用如下技术方案:
一种玉米胚乳特异表达启动子14kD zein的启动子序列,其特征在于该启动子序列为下列之一:
i)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；
ii)SEQID N0.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。
[0011]—种载体,其特征在于该载体含有上述的启玉米胚乳特异表达启动子14kD zein的启动子序列。
[0012]一种转基因细胞系，其特征在于该转基因细胞系含有上述的启动子序列。[0013]—种克隆上述的玉米胚乳特异表达启动子14kD zein的启动子序列的方法,其特征在于该方法的具体步骤为:在NCBI数据库中找到玉米胚乳特异表达基因14kD zein的ATG上游序列，截取2031bp的碱基序列，设计引物，以B73基因组为模板，通过PCR扩增技术获得2031bp目的片段后通过TA克隆连接载体；所述的引物序列为:
正向引物从Y端至3'端为:CCCTCAGAACCATACCTT ;
反向引物从5'端至3'端为:GGTGTCGAGTTCTCCAATC。
[0014]本发明首次提出一个新的能够在玉米胚乳中特异表达的14kD zein启动子,该启动子适用于启动目标基因(如GUS基因或GFP基因)在玉米胚乳中的特异性表达。该启动子的特异性很强，因此为植物基因工程表达载体的构建提供了合适的调控元件，也为实验室其他课题的研究进行提供了新的材料。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1 PCR获得玉米胚乳特异表达基因14kD zein的ATG上游2031bp片段电泳图 图 2 PCR 获得 1043bp、588bp、443bp、302bp、202bp、104bp 的序列片段
图3 pBI121载体图谱 图4 pUC18载体图谱
图5 B73玉米授粉后14天的籽粒基因枪轰击GUS染色结果
A:35S (正对照)B:B73 负对照 C:14kDzein_2031bp 片段 D:14kDzein-1043bp 片段 E:14kDzein_588bp 片段 F:14kDzein_443bp 片段 G: 14kDzein_302bp 片段 图中的标尺长度代表1_
图6 PBPA玉米幼胚转化流程图
A:取胚侵染B:共培养C:恢复培养D: 一轮筛选E:三轮筛选F:抗性愈伤 G:暗再生 H:光再生 1:阳性苗入土 图7 PCR检测结果电泳图
A: (bar) 14—1—1，2，3, 4, 5; 14—2—2，3; 14—4—1，2; 14-5-2; 14—6—5，6, 7, 8; 14—8—1，2，3，4，5;14-A-12;14-B-27, 28;14-C-1, 2
B: (GUS) 14-1-1，2，3, 4, 5; 14—2—2，3; 14—4—1，2; 14-5-2; 14—6—5，6, 7, 8; 14—8—1，2，3，4，5;14-A-12;14-B-27, 28;14-C-1, 2
图8部分事件bar探针Southern杂交检测图1-5:14kD 5个转基因事件6 =PBPA负对照 图9植株的叶、根、种皮、胚、胚乳组织的GUS染色结果图 35S-GUS 的
A:叶B:根C:种皮D:胚E:胚乳 HkD-GUS 的
Al:叶 B1-M Cl:种皮 Dl -M El:胚乳 图中的标尺长度代表1_。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆(Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed.)或植物分子生物学一实验手册(Plant Molecular Biology — A Laboratory Manual, Melody S.Clark编’ Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997)中所述条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0017]实施例一:获得启动子片段
在NCBI数据库中找到玉米胚乳特异表达基因14kD zein的ATG上游序列，截取2031bp的碱基序列，具体序列详见SEQ ID N0.1，设计引物，以B73基因组为模板，通过PCR扩增技术获得片段，参见图1。扩增片段的引物序列:
正向引物从Y端至3 '端为:CCCTCAGAACCATACCTT ;
反向引物从5'端至3'端为:GGTGTCGAGTTCTCCAATC ;
结果:获得2031bp目的片段后通过TA克隆连接载体，测序比对，与数据库中提供的序
列一致。
[0018]实施例二:启动子截短片段的获得
根据预测启动子元件的网站(http://www.softberry.com)的预测结果，分别截取1043bp、588bp、443bp、302bp、202bp、104bp大小的碱基序列，PCR获得片段，见图2。扩增片段的引物序列:
1043bp:
正向引物从5'端至3'端为:TCGAGAAATGACGTGGCA ;
反向引物从5'端至3'端为:GGTGTCGAGTTCTCCAATC ;
588bp:
正向引物从5'端至3'端为:ATTCACGGGTAATCTCAG ;
反向引物从5'端至3'端为:GGTGTCGAGTTCTCCAATC ;
443bp:
正向引物从Y端至3'端为:TTAATTGGGTGAGAAACA ;
反向引物从5'端至3'端为:GGTGTCGAGTTCTCCAATC ;
302bp:
正向引物从Y端至3'端为:TAGTTTCGTGAAAAGCAA ;
反向引物从5'端至3'端为:GGTGTCGAGTTCTCCAATC ;202bp:
正向引物从5'端至3'端为:CCAAAAGTGAATGAGATG ;
反向引物从5'端至3'端为:GGTGTCGAGTTCTCCAATC ;
104bp:
正向引物从5'端至3'端为:AAAGCTATAAATAACCGTC ;
反向引物从5'端至3'端为:GGTGTCGAGTTCTCCAATC ;
结果:分别回收不同大小的目的片段后通过TA克隆连接载体，测序比对，与提供的序
列一致。
[0019]实施例三:截短 片段与⑶S基因连接，打基因枪，验证启动子核心元件
用Sma I +EcoR I酶点将gusA_N0S片段从pBI121载体(图谱见图3)上酶切连接到PUC18载体(图谱见图4)中，构建pUC18-Gus-n0s载体。将克隆到的不同长度的片段回收连接测序验证正确后，用酶切,连入pUC18-Gus_nos,构建pUC18_14kD zein-GUS载体。将构好的载体转入大肠杆菌T0P10中，抽提质粒后打基因枪。
[0020]选取B73玉米授粉后14天的籽粒为受体材料，用70%酒精消毒剥去种皮，放到渗透培养基上培养6小时后进行基因枪的瞬时转化。基因枪的轰击参数:压力650，距离3cm，两枪。轰击之后25°C暗培养48小时，⑶S染色(图5)。
[0021]结果:14kDzein-2031bp、1043bp片段、588bp 片段、443bp 片段、302bp 片段均有GUS表达，说明截短到302bp片段时启动子仍有功能。
[0022]实施例四:根据截短片段的功能验证结果，选取1043bp片段构建表达载体，农杆菌转化玉米幼胚
选取PTF102载体作为农杆菌转化玉米幼胚的载体。先用Fsi I酶切PTF102载体去除35S-GUS片段，载体自连。将pUC18-14kD zein-GUS载体中的1043bp启动子片段连接⑶S的区段用油I酶切后，连入自连后的pTF102载体，构建pTF102-14kDzein-GUS载体，电击转化EHAlOl菌株。
[0023]选取PBPA玉米品系授粉8-12天的幼胚，大小约1.5mm左右作为受体材料，进行幼胚转化，具体流程(图6):农杆菌侵染IOmin-共培养20°C 3天-恢复培养28°C 7天-筛选培养(双丙氨磷1.5mg/l)28°C 14天-筛选培养(双丙氨磷3mg/l)28°C 14天3-5轮-获得抗性愈伤组织-暗再生培养280C 14-21天-光再生培养28 V 14_21天-获得阳性苗-移入盆中-PCR检测(图7) -Southern检测(图8)-授粉获得后代。
[0024]结果:选取约2000个幼胚作为受体材料，经过转化筛选后获得10个抗性愈伤，经过再生后获得转基因植株，并收获后代。同时选取部分事件的叶子抽提基因组，通过PCR检测及Southern杂交验证转基因结果。
[0025]实施例五:GUS染色
选取35S-GUS作为正对照，对转基因植株的叶、根、种皮、胚、胚乳分别进行GUS染色，验证启动子的特异性(图9)。
[0026]结果:35S_GUS在玉米植株的叶、根、胚、胚乳均有⑶S基因表达，而14kD_GUS在玉米植株的叶、根、种皮组织均没有⑶S基因表达，胚组织有少量的表达，只有胚乳组织中⑶S基因高效表达，证明14kD启动子的特异性很好。
【权利要求】
1.一种玉米胚乳特异表达启动子14kD zein的启动子序列,其特征在于该启动子序列为下列之一: i)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列； ii)SEQID N0.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。
2.一种载体，其特征在于该载体含有根据权利要求1所述的启玉米胚乳特异表达启动子14kD zein的启动子序列。
3.—种转基因细胞系，其特征在于该转基因细胞系含有根据权利要求1所述的启动子序列。
4.一种克隆根据权利要求1所述的玉米胚乳特异表达启动子14kD zein的启动子序列的方法，其特征在于该方法的具体步骤为:在NCBI数据库中找到玉米胚乳特异表达基因14kD zein的ATG上游序列，截取2031bp的碱基序列，设计引物，以B73基因组为模板，通过PCR扩增技术获得2031bp目的片段后通过TA克隆连接载体；所述的引物序列为: 正向引物从Y端至3'端为:CCCTCAGAACCATACCTT ; 反向引物从5'端至3'端为:GGTGTCGAGTTCTCCAATC。
【文档编号】C12N15/63GK103952408SQ201410147180
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月14日 优先权日:2014年4月14日
【发明者】宋任涛, 邢莹莹, 王明民, 张举善, 马东东, 王珊珊, 祁巍巍, 梅冰, 唐远平 申请人:上海大学