泡盛曲霉及其微生物菌剂和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于防治黄瓜枯萎病的泡盛曲霉（Aspergillusawamori)2-17，该菌株已于2013年1月11日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.7127；本发明还公开了利用该菌株生产的微生物菌剂及其制备方法。本发明提供的泡盛曲霉（Aspergillusawamori)2-17及其微生物菌剂对黄瓜枯萎病防治效果显著，发病率控制在5%以内，同时不易产生抗药性，对人畜安全，不会污染水和土壤，对农作物无危害，为防治黄瓜枯萎病提供了一种高效的微生物防治新途径。
【专利说明】泡盛曲霉及其微生物菌剂和应用
【技术领域】
[0001]本发明具体涉及一种用于防治黄瓜枯萎病的泡盛曲霉和含有该泡盛曲霉的微生物菌剂，及其在防治黄瓜枯萎病上的应用，属于农业微生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]黄瓜枯萎病是一种世界性的土传真菌病害，由半知菌亚门镰孢属尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxy sporum f.sp.Cucumerinum Owen)侵染引起，可导致维管束和导管受损，最终造成黄瓜枯萎、萎蔫直至甚至死亡。在许多蔬菜基地，黄瓜枯萎病常年发病率10%-30%，重病年份可达80%-90%，一般减产30%-50%，重者绝收，严重影响了黄瓜的产量和品质。
[0003]目前世界各国对黄瓜枯萎病的防治主要还是采用化学方法，虽然化学方法在一定程度上抑制了枯萎病害发生，但化学药剂负面影响严重，对耕地土壤生态环境破坏极大，长期使用容易导致土壤理化性质发生较大变化，土壤中有益微生物数量显著减少，土壤自身修复能力降低，而且化学药剂残留严重，容易污染周边水源，对农产品及周边的居民身心健康有着很大的威胁，因此世界各国已经禁用或逐渐禁用部分剧毒农药如甲基溴等。开发出高效、无毒、绿色的防治方法受到了越来越多的关注。其中，通过采用安全、高效、环境友好型的生物技术手段，利用拮抗微生物来减少黄瓜枯萎病害发生，被认为是一种具有广阔应用前景的黄瓜枯萎病防治生物技术。该技术通过分离筛选黄瓜枯萎病菌拮抗微生物，制备拮抗微生物菌剂后，施入黄瓜种植土壤中，从而达到抑制黄瓜枯萎病菌生长，防控黄瓜枯萎病发生的目的。但目前可供利用的拮抗微生物种类和数量还相对较少，主要包括木霉属真菌、非致病尖孢镰刀菌、淡紫拟青霉、芽孢杆菌等，因此进一步分离筛选黄瓜枯萎病菌拮抗微生物对于黄瓜枯萎病的防治有着重要的意义。
【发明内容】
[0004]本发明第一目的在于提供一种用于防治黄瓜枯萎病的泡盛曲霉及其微生物菌剂。
[0005]本发明第二目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。
[0006]本发明第三目的在于提供上述泡盛曲霉菌株及其微生物菌剂在防治黄瓜枯萎病上的应用。
[0007]上述泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17菌株,于2013年I月11日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号:CGMCC N0.7127。
[0008]菌株生理特征:上述泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17在PDA培养基上，在28°C培养4天长满整个9cm培养皿，平坦，质地粉粒状，表面暗褐色，菌落反面呈橙黄色。分生孢子头幼时多呈辐射形；老时疏松或裂成疏松的圆粒状结构；顶囊球形或近球形，淡褐色；分生孢子球形或近球形。
[0009]菌株的鉴定:通过提取上述泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17菌株的基因组，并用18S通用引物对该菌株进行测定，测定的序列表如SEQ ID N0.1所示，从18S rDNA基因序列测定结果来看上述菌株可以归为泡盛曲霉。
[0010]利用上述泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17所制备的微生物菌剂为固体菌剂，由泡盛曲霉株和固体培养基组成；其活性成分为泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17菌体和它的胞外代谢产物。
[0011]上述微生物菌剂,其内含有的泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17的活菌数大于 1.0X IO8 cfu/g。
[0012]上述微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤:
(1)菌株活化培养:将分离的泡盛曲霉(Aspergillusawamori) 2_17菌株斜面保藏物接种到PDA斜面，置于28°C培养箱中培养4天，然后作为接种物接种PDA平板，接种后将PDA平板置于28°C培养箱中培养4-7天，直至菌丝体上形成孢子；
(2)制备固体培养基:以麸皮为原料，调节含水率为40%-50%，121°C高压灭菌20min，
将冷却后的麸皮作为泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17的固体培养基；
(3)制备固体微生物菌剂:将PDA平板上的泡盛曲霉(Aspergillusawamori) 2-17
孢子及菌丝体用无菌水洗涤 后作为接种液接种到固体培养基上，于28°C培养7天进行充分的发酵产孢，即得微生物菌剂。
[0013]制备上述泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17及其微生物菌剂所使用PDA平板和PDA斜面均为常规操作方法制备。
[0014]上述泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17及其微生物菌剂应用于防治黄瓜枯萎病。
[0015]本发明具有的优点和有益效果:
(I)本发明所提供的泡盛曲霉为防治黄瓜枯萎病提供了一种高效的微生物，开辟了一个有效防治途径。
[0016](2)本发明所提供的泡盛曲霉对黄瓜枯萎病的防治效果显著，发病率控制在5%以内。
[0017](3)本发明所提供的微生物菌剂对人、畜安全，不会污染水和土壤，对其他农作物也没有危害。
[0018](4)利用本发明方法防治黄瓜枯萎病不易产生抗药性。
【具体实施方式】
[0019]下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体说明。
[0020]对所涉材料的说明:
土豆:市场购买普通食用土豆；葡萄糖:生化制剂，国产；NaCl:分析纯，国产；麸皮。
[0021]本发明所述泡盛曲霉菌株的获得途径:2008年从浙江嘉善、丽水、杭州等黄瓜枯萎病发病严重种植基地采集健康植株根系土壤样品15个，利用PDA培养基进行真菌分离，共分离到真菌50多株；然后进行平板拮抗试验，得到对黄瓜枯萎病菌尖孢镰刀菌有较好拮抗效果初筛真菌3株,该泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17为其中一株。菌种的分离和筛选的具体过程如实施例1所示，黄瓜枯萎病菌拮抗真菌的筛选如实施例2所示。
[0022]实施例1菌种的分离筛选:(1-1)配制PDA培养基、
所述PDA培养基:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g, H2O 1000ml, pH自然。先将马铃薯洗净去皮，再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20-30分钟)，用八层纱布过滤，加热，再据实际实验需要加琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，121°C灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面或者到平板，冷却凝固后贮存备用。
[0023]实验过程中所使用PDA平板和PDA斜面均为常规操作方法制备。
[0024]( 1-2) 土壤稀释液的制备
Ca)称取IOg 土壤，加入100mL带有玻璃珠的无菌水500ml三角瓶中，振荡15分钟，即
10-1 ；
(b)吸取土悬液10ml，加入90ml无菌水500ml三角瓶中，即10_2；
(c)从(2)中吸取10ml，加入90ml无菌水500ml三角瓶中，即10_3；
(d)从(3)中吸取5ml，加入45ml无菌水250ml三角瓶中，即10_4；
(e)从(4)中吸取5ml，加入45ml无菌水250ml三角瓶中，即10_5。
[0025](1-3)真菌分离
(f)从(c)(d) (e)中分别吸取0.1ml，加入到PDA培养基平板中进行涂布培养(28-30°C培养2-3天)；
(g)选择20-200菌落数的培养皿进行挑取单菌落进行斜面培养(28-30°C培养2_3天)； (1-4)多个土样
(9)共15个土样，每个土样重复上述(1-1)~(1-2)步骤。
[0026](1-5)结果 分离到真菌50多株。
[0027]实施例2黄瓜枯萎病菌拮抗真菌的筛选:
(2-1)固体培养基:配制PDA培养基:同实施例1中(1-1).(2-2)黄瓜枯萎病致病菌种活化
将低温保藏的黄瓜枯萎病致病菌——尖孢镰刀菌接入PDA斜面培养基中进行活化培养，28°C培养箱培养4天，备用。
[0028]( 2-3 )平板拮抗试验
将培养活化好的黄瓜枯萎病致病菌接种到PDA平板中心，同时将分离的真菌接种到平板的四周，每个平板接种4个分离的真菌，接种后置于28°C真菌培养箱中培养，48h后每隔24h观察实验结果，主要考察抑菌圈有无及大小。根据抑菌圈的大小筛选高效黄瓜枯萎病致病菌拮抗微生物，泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17就是其中一株高效拮抗真菌。
[0029]实施例3微生物菌剂的制备:
(3-1)菌株2-17活化培养:将分离的泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17菌株斜面保藏物接种到PDA斜面，置于28°C培养箱中培养4天，然后作为接种物接种PDA平板，接种后将PDA平板置于28°C培养箱中培养4-7天，直至菌丝体上形成孢子。
[0030](3-2)制备固体培养基:以麸皮为原料，调节含水率为40%-50%，121°C高压灭菌20min，
将冷却后的麸皮作为泡盛曲霉(Aspergillusawamori) 2-17的固体培养基。[0031](3-3)制备固体微生物菌剂:将PDA平板上的泡盛曲霉(Aspergillusawamori) 2-17的孢子及菌丝体用无菌水洗涤后作为接种液接种到固体培养基上，于28°C培养7天进行充分的发酵产孢，即得微生物菌剂。
[0032]实施例4微生物菌剂的防治效果对比试验:
(4-1)黄瓜品种:园丰园。
[0033](4-2)试验地点:试验地点选择嘉兴黄瓜连作枯萎病高发地区，试验小区黄瓜枯萎病平均发病率在25%以上。
[0034](4-3)试验处理及小区面积:试验设I个不接拮抗菌对照处理和I个拮抗菌2-17处理，小区面积12 Hf，处理重复4次。每小区种黄瓜25株。试验地土壤不使用任何土壤处理剂，黄瓜生长期间不使用任何杀菌剂，其他农事操作照常规。小区排列见表1:
表1田间试验小区排列表
【权利要求】
1.一种泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17,其特征在于,于2013年I月11日保 藏在位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号=CGMCC N0.7127。
2.利用权利要求1所述泡盛曲霉(Aspergillusawamori) 2-17制备的微生物菌剂,其 特征在于，所述微生物菌剂为固体菌剂，由泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17和固体培养基组成；其活性成分为泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17菌体和它的胞外代谢产物。
3.如权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，其内含有的泡盛曲霉 awamori) 2-17 的活菌数大于 1.0XlO8 cfu/g。
4.一种权利要求2或3所述微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)菌株活化培养，将分离的泡盛曲霉(Aspergillusawamori) 2-17菌株斜面保藏物接种到PDA斜面，置于28°C培养箱中培养4天，然后作为接种物接种PDA平板，接种后将PDA平板置于28°C培养箱中培养4-7天，直至菌丝体上形成孢子； (2)制备固体培养基，以麸皮为原料，调节含水率为40%-50%，121°C高压灭菌20min，将冷却后的麸皮作为泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17的固体培养基； (3)制备固体微生物菌剂,将PDA平板上的泡盛曲霉(Aspergillusawamori) 2-17的孢子及菌丝体用无菌水洗涤后，作为接种液接种到固体培养基上，于28°C培养7天进行充分的发酵产孢，即得微生物菌剂。
5.一种权利要求1所述的泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17在防治黄瓜枯萎病上的应用。
6.一种权利要求2或3所述的微生物菌剂在防治黄瓜枯萎病上的应用。
【文档编号】C12N1/14GK104017733SQ201410147310
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年4月14日 优先权日:2014年4月14日
【发明者】姚燕来, 朱凤香, 薛智勇, 陈晓旸, 洪春来, 王卫平 申请人:浙江省农业科学院