构建体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了构建体及其应用，其中该构建体包含SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列。将该构建体转染动物细胞，能够有效实现对动物细胞尤其是哺乳动物细胞线粒体基因的切割，使该细胞的线粒体丧失功能，获得无线粒体功能的ρ0细胞株，且切割效率高、安全高效、重复性好。
【专利说明】构建体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程领域。具体地，本发明涉及构建体及其应用。更具体地，本发明涉及构建体、制备转基因动物细胞的方法、转基因动物细胞或其培养物以及使非人动物线粒体功能缺失的方法。
【背景技术】
[0002]P O细胞是线粒体DNA完全缺失的细胞，真核细胞中，通过人工方法造成线粒体DNA完全缺失获得的细胞系称为P O细胞。PO细胞的建立有多种方法，经典的方法是用低剂量EB (溴化乙锭)长期处理。这种化学试剂能嵌入到DNA双链中通过干扰DNA聚合酶的作用影响线粒体DNA的复制造成了线粒体DNA的缺失。虽然EB更倾向于插入到线粒体双链DNA中，但是不能排除它对核基因组产生的轻微影响，因此EB在诱导P O细胞过程中可能会造成核基因的诱变效应。这种方法经典但并不是万能的，不是所有的细胞系都能EB处理获得P O状态。有些细胞系对EB有抗性，例如Hep3B细胞通过该方法就不能达到P O状态。此外，EB是一种高致癌诱变剂，所以这种方法常被研究人员摒弃。除了 EB以外，其他的化学试剂如双脱氧胞苷(Nelson, 1.，et al.，1997)、地特氯胺等也被用来尝试通过干扰mtDNA的复制建立P O细胞系，但是所有的化学试剂都有他们的缺陷如造成基因突变及多种耐药基因的表达。为此，研究人员不断寻找更有效的方法诱导线粒体DNA缺失获得P O细胞。
[0003]目前使用较多的是与酶相关的方法清除线粒体DNA，这种方法不仅缩短了诱导时间还提高了诱导效率，比药物诱导更特异更安全。DNA聚合酶Y是线粒体DNA复制多种复合物之一。通过稳定表达显性负向线粒体特异的DNA聚合酶Y可以干扰线粒体DNA复制达到清除线粒体DNA的 目的。此外，人和鼠的mtDNA上都有多个ECORl酶切位点，人的线粒体DNA由于种族差异存在3-5个EcoRl酶切位点，小鼠有三个EcoRl酶切位点，大鼠有七个EcoRl酶切位点。Kukat等人根据这个特点找到一种温和、可靠、省时的方法有效清除了线粒体DNA，即通过限制性内切酶EcoRl与线粒体定位的序列结合连接到表达载体上，然后转染细胞经过筛选获得了线粒体DNA缺失的细胞。但是目前用于切割线粒体DNA的方法效率较低。
[0004]因而，现阶段，找到一种酶学上的能够高效切割线粒体DNA，制备P O细胞的方法，
意义重大。
【发明内容】
[0005]本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够高效剪切宿主细胞线粒体DNA、从而制备获得P O细胞的构建体。
[0006]需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的:
[0007]发明人发现人类单纯疱疹病毒UL12基因的有效变体UL12.5，能够编码核酸酶，精确特异地定位于线粒体造成线粒体DNA缺失，并且其对线粒体DNA的剪切效率非常高，能在短时间内达到清除线粒体DNA的效果，而这种特异的核酸酶的方法也轻松解决了药物诱导线粒体功能缺失所产生的负面效应。
[0008]因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。发明人惊奇地发现，将该构建体转染动物细胞，能够有效实现对动物细胞尤其是哺乳动物细胞线粒体基因的切割，使该细胞的线粒体丧失功能，获得无线粒体功能的P O细胞株，且切割效率高、安全高效、重复性好。
[0009]根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种制备转基因动物细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括:使用前面所述的构建体转化宿主细胞；以及分离转基因动物细胞。根据本发明的实施例，利用该方法能够有效地实现对动物细胞尤其是哺乳动物细胞的线粒体基因的剪切修饰，获得无线粒体功能的P O细胞，并且，切割效率高、安全高效、重复性好。
[0010]根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种转基因动物细胞或其培养物，其中所述转基因动物细胞是通过前面所述制备转基因动物细胞的方法获得的。根据本发明的实施例，本发明的转基因动物细胞为无线粒体功能的P O细胞，其因特异位点被剪切而发生突变，从而能够有效作为线粒体疾病模型应用于人类线粒体疾病发病机理以及预防和治疗的研究。
[0011]根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种使非人动物线粒体功能缺失的方法。根据本发明的实施例，该方法为:使用前面所述的构建体转化所述非人动物。发明人发现，利用该方法能够有效地获得线粒体功能缺失的转基因动物，从而该转基因动物能够有效用作人类线粒体疾病发病机理以及预防和治疗研究的动物模型。
[0012]本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实 践了解到。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:
[0014]图1显示了根据本发明一个实施例的pDsRed-Mito质粒图谱；
[0015]图2显示了根据本发明一个实施例的pMXs-Flag质粒图谱；
[0016]图3显示了根据本发明一个实施例的pRLenti质粒图谱；
[0017]图4显示了根据本发明一个实施例，UL12.5-DsRed清除线粒体DNA效果的检测结果图，其中，
[0018]图4A显示了 UL12.5基因与红色荧光蛋白DsRed融合结果示意图，
[0019]图4B显不了 UL12.5-DsRed与线粒体染料Mito-tracker green共定位检测结果(Zesis LSM710，100X)，
[0020]图4C显示了 Q-PCR检测MEF细胞中感染UL12.5基因不同天数后mtDNA的含量的
结果，
[0021]图4D显示了 Q-PCR检测MEF细胞中UL12.5基因对线粒体DNA转录水平的影响的实验结果；
[0022]图5显示了根据本发明一个实施例，转基因细胞的线粒体功能缺失情况检测结果，其中，[0023]图5A显示了用TMRM方法检测正常MEF细胞中的线粒体功能的结果(ZesisLSM710,100X)，
[0024]图5B显示了 BQ-PCR检测MEF细胞中感染UL12.5-GFP基因不同天数后mtRNA的含量的结果，
[0025]图5C显示了用TMRM方法检测UL12.5感染MEF细胞6天后的线粒体功能的结果(Zesis LSM710,100X)； [0026]图6显示了根据本发明一个实施例，慢病毒感染UL12.5阳性iPS克隆筛选结果图，其中，
[0027]图6A显示了慢病毒感染iPS克隆得到的UL12.5-DsRed阳性克隆(Zesis LSM710，10X)，
[0028]图6B显示了 Q-PCR检测挑取的3株高表达UL12.5-DsRed的iPS克隆mtDNA水平的结果。
【具体实施方式】
[0029]下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0030]构建体
[0031]根据本发明的一个方面，本发明提供了一种构建体。根据本发明的实施例,该构建体包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。发明人惊奇地发现，将该构建体转染动物细胞，能够有效实现对动物细胞尤其是哺乳动物细胞线粒体基因的切割，使该细胞的线粒体丧失功能，获得无线粒体功能的P O细胞株，且切割效率高、安全高效、重复性好。
[0032]其中，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列如下:
【权利要求】
1.一种构建体，其特征在于，包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的构建体，其特征在于，所述构建体呈选自质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒以及病毒的至少一种的形式，优选质粒的形式。
3.根据权利要求1所述的构建体，其特征在于，进一步包括启动子，所述启动子与SEQID NO:1所示的核苷酸序列可操纵地连接， 优选所述启动子为CMV启动子。
4.根据权利要求1所述的构建体，其特征在于，进一步包括筛选标记， 任选地，所述筛选标记为荧光蛋白基因，优选GFP，RFP, DsRed, YFP, CFP, BFP和Cherry基因的至少之一， 任选地，所述筛选标记为药物抗性基因，优选新霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因的至少一种， 任选地，所述筛选标记为选自His和Flag标签的至少一种。
5.一种制备转基因动物细胞的方法，其特征在于，包括: 使用权利要求1-4任一项所述的构建体转化宿主细胞；以及 分离转基因动物细胞， 任选地，所述转基因动物细胞来源于哺乳动物，优选小鼠。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，利用选自电转、PEI转、钙转、脂质体转、逆转录病毒和慢病毒感染的至少一种方法进行所述转化。
7.—种转基因动物细胞或其培养物，其中所述转基因动物细胞是通过权利要求5或6所述的方法获得的。
8.一种使非人动物线粒体功能缺失的方法，其特征在于， 使用权利要求1-4任一项所述的构建体转化所述非人动物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: 使用权利要求1-4任一项所述的构建体转化非人动物细胞； 分离转基因动物细胞； 将所述转基因动物细胞引入所述非人动物的怀孕个体的囊胚； 使所述怀孕个体生产，以便获得嵌合体动物；以及 将所述嵌合体动物进行杂交繁育，以便获得转基因动物。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: 使用权利要求1-4任一项所述的构建体转化所述非人动物细胞； 分离转基因动物细胞； 提取所述转基因动物细胞的细胞核； 将所述细胞核引入所述非人动物的无核卵母细胞中，以便获得融合卵母细胞；以及 将所述融合卵母细胞在适宜的条件下进行培养，以便获得非人转基因动物， 任选地,所述非人动物为哺乳动物，优选小鼠， 任选地，所述无核卵母细胞是通过手工克隆方法去除卵子中的遗传物质而获得的。
【文档编号】C12N5/10GK103966246SQ201410166516
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年4月21日 优先权日:2014年4月21日
【发明者】刘兴国, 杨亮, 龙琪, 胡忠国 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院