一种鳞翅目昆虫二氢叶酸还原酶的基因、其干扰基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种鳞翅目昆虫二氢叶酸还原酶(OfDHFR)的基因，其干扰基因及其应用。鳞翅目昆虫二氢叶酸还原酶(OfDHFR)的基因具有SEQ?ID?NO：1所示的序列特征。其干扰基因正义链具有SEQ?ID?NO：4所示的序列，反义链具有SEQ?ID?NO：5所示的序列。本发明还公开了二氢叶酸还原酶(OfDHFR)基因及其干扰RNA序列用于害虫防治的用途。
【专利说明】—种鳞翅目昆虫二氢叶酸还原酶的基因、其干扰基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及鳞翅目昆虫亚洲玉米螟二氢叶酸还原酶(OfDHFR)的基因、其干扰基因及其应用。
【背景技术】
[0002]亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis Guen6e)属于鳞翅目螟蛾科，以玉米、棉花、谷子、高粱等为食，每年造成玉米的减产量可达总产量的10% -30%，而且在我国分布区域跨度大，是我国重要的农业害虫。由于其钻蛀特性，防治困难，目前尚没有特效的化学农药。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是生物体内抑制特定基因表达的一种现象,小干扰RNA被认为是一种快捷、高效的调控体内基因表达的方法。以害虫关键生理功能基因为生物分子靶标，通过干扰其活性达到抑 制生长发育和杀虫目的，具有显著的商业价值和应用前景。
[0003]二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase, DHFR, ECl.5.1.3)是细胞内叶酸代谢的关键酶，它在辅酶NADPH的参与下，催化底物二氢叶酸还原为四氢叶酸(tetrahydrofolate, THF)。THF可以作为一碳单位的传递体。而一碳单位是生物体新陈代谢过程中含有一个碳原子的基团，例如甲基、羟甲基等，其主要生理功能是作为嘌呤和嘧啶的合成原料，是氨基酸和核苷酸联系的纽带。除此之外，THF还可参与到在胸苷酸合酶(TS)的催化下，脱氧尿苷一磷酸(dUMP)转变为脱氧胸苷一磷酸(dTMP)的生物合成中，这是dTMP从头生物合成的唯一路径，dTMP是DNA合成所必须的前体物质，而DNA的合成又与细胞复制密切相关。由于昆虫不能自身合成THF，必须要从外界获得叶酸再转化为DHF，进而由DHFR催化合成THF，所以DHFR对于昆虫生长发育起着极其重要的作用，通过对其功能的干扰和抑制可实现害虫防治的目标。
[0004]经对现有技术的文献检索发现，尚未有将DHFR基因及其干扰RNA用于害虫防治的应用或报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种全新的亚洲玉米螟二氢叶酸还原酶(OfDHFR)的基因核苷酸序列，以及OfDHFR基因的干扰RNA分子在亚洲玉米螟防控中的用途。
[0006]本发明公开了一种亚洲玉米螟二氢叶酸还原酶OfDHFR基因，其核苷酸序列为SEQID NO:1 所示。
[0007]本发明公开了一种亚洲玉米螟二氢叶酸还原酶OfDHFR基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0008]本发明还公开了所述鳞翅目昆虫二氢叶酸还原酶基因干扰RNA序列的模板DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。根据亚洲玉米螟二氢叶酸还原酶OfDHFR基因序列设计合成的dsRNA，其核苷酸序列包括正义链序列为SEQ ID NO:4，反义链为SEQ ID NO:5。可以特异性的沉默亚洲玉米螟二氢叶酸还原酶的基因的mRNA的表达，有效控制玉米螟成虫产卵，减少幼虫数量，从而减轻下代玉米螟危害，有效控制虫害。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1:从亚洲玉米螟幼虫中提取的总RNA的凝胶电泳图
[0010]图2 =PCR产物凝胶电泳图
[0011]图3:3 ’ RACE的PCR产物凝胶电泳图
[0012]图4:5 ’ RACE的PCR产物凝胶电泳图
[0013]图 5:利用 OfDHFR-Fl/OFDHFR-Rl 和 OfDHFR-FI/0FDHFR-R2 引物扩增的 PCR 产物凝胶电泳图
[0014]图6:利用RNA1-DNA-F/RNA1-DNA-R弓丨物扩增的PCR产物凝胶电泳图
[0015]图7: dsRNA的凝胶电泳图
[0016]图8 =RNA干扰后雌虫OfDHFR的表达情况
[0017]图9 =RNA干扰后雌虫的产卵情况【具体实施方式】
[0018]下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0019]亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)由中国科学院植物保护研究所赠与。
[0020]下述实施例中涉及到的使用试剂盒的实验操作，均按照试剂盒说明书进行操作。
[0021]实施例1
[0022]亚洲玉米螟二氢叶酸还原酶(OfDHFR)基因的获得
[0023]一.亚洲玉米螟幼虫的总RNA提取
[0024]使用RNAiso plus (Code N0.D9108A)对亚洲玉米螟(幼虫)进行总RNA提取，获得其总RNA。
[0025]取Iul上述亚洲玉米螟总RNA进行I %琼脂糖凝胶电泳，结果如图1，RNA样品的结果清晰，符合质量要求适合进行下一步实验。
[0026]二.RT-PCR
[0027]以亚洲玉米螟总RNA为模板，进行反转录，合成cDNA。
[0028]1.引物设计和合成
[0029]设计并合成引物:
[0030]OfDHFR-1-F:GCNGCNGCNTGYGAYAAYATGGG(SEQ ID NO:6)
[0031]OfDHFR-1-R:ATRTTNGGRAARAANGTRTCRCA(SEQ ID NO:7)
[0032]0fDHFR-2-F:GTNATHATGGGNMGTCGNACNTGG (SEQ ID NO:8)
[0033]0fDHFR-2-R:GANGAGCCNCCDATNACCCA(SEQ ID NO:9)
[0034]2.反转录
[0035]使用TakaRa PrimeScript ? RT-PCR Kit (Co de N0.DRO14A)进行反转录实验。
[0036]反应体系:
【权利要求】
1.一种鳞翅目昆虫二氢叶酸还原酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.如权利要求1所述鳞翅目昆虫二氢叶酸还原酶基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。
3.如权利要求1所述鳞翅目昆虫二氢叶酸还原酶基因的干扰RNA序列，其正义链具有SEQ ID NO:4所示的序列，反义链具有SEQ ID NO:5所示的序列。
4.如权利要求3所述鳞翅目昆虫二氢叶酸还原酶基因干扰RNA序列的模板DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示。
5.如权利要求1所述鳞翅目昆虫二氢叶酸还原酶基因及权利要求3所述的干扰RNA序列在绿色农药开发和 害虫防治中的应用。
【文档编号】C12N9/06GK103923931SQ201410172992
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月25日 优先权日:2014年4月25日
【发明者】杨君, 夏悦昕, 白敬, 屈明博, 刘田, 姜秀萍, 杨青 申请人:大连理工大学