纤维酶体基因的改建方法及获得的新型纤维素酶的制作方法

纤维酶体基因的改建方法及获得的新型纤维素酶的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种纤维酶体基因的改建方法及通过基因改建获得的新酶，具体涉及一种以热纤梭菌的纤维酶体和它的单体酶为基础的基因改建方法，及基因改建产生的新型木质纤维水解酶，属于基因工程和酶工程领域。本发明是通过基因重组技术，切除纤维酶体的单体酶肽链中的锚定域以减少冗余部件、用1个短链将支架蛋白上的CBD嫁接到单体酶的分子上，获得具有不同分子结构、能够独立结合底物、比单体酶活性高的新型独立酶；本发明还建立了这种新酶的超量表达技术。本发明成功获得了不依赖于纤维酶体结构的新型纤维素酶NcelD；并且该新型酶NcelD水解CMC的活性、酶的稳定性比自然单体酶CelD有明显的提高；基因改建获得的NcelD编码基因在pHsh系统中得到可溶性超量表达。
【专利说明】纤维酶体基因的改建方法及获得的新型纤维素酶
[0001]所属【技术领域】:
本发明涉及一种纤维酶体基因的改建方法及通过基因改建获得的新酶，具体涉及一种以热纤梭菌的纤维酶体和它的单体酶为基础的基因改建方法，及基因改建产生的新型木质纤维水解酶，属于基因工程和酶工程领域。
[0002]【背景技术】:
木质纤维是地球植物的支撑组织，主要成分是通过光合作用碳水化合物，是非常丰富的自然资源。同时，自然界很多微生物和植食性动物能够产生一系列酶对木质纤维进行水解，从而构成自然界碳素循环的重要环节。水解木质纤维中纤维素成分的主要酶类包括纤维素酶、纤维素外切酶、纤维二糖酶和b-葡萄糖苷酶等。纤维素酶是b-1，4葡聚糖内切酶的简称；纤维素酶的催化反应是纤维素水解中的限速步骤。[0003]纤维素酶在纤维素利用与加工中具有广泛的用途。在造纸工业，纤维素酶在废纸的脱墨处理中是重要的生物催化剂，同时在机械制浆前以纤维素酶预处理可以增加纸浆的强度性能，显著降低机械磨浆时的能量消耗；在纺织工业，利用纤维素酶对棉织物及其混纺织物进行打磨刨光处理，可使织物的硬度适当下降，织物的悬垂度、回弹性及柔软度获得改善；作为饲料添加剂，纤维素酶能够提高青贮饲料的品质，加强机体对营养物质的吸收，改善瘤胃的发酵功能，从而增加动物体的日增质量，改善产奶量和奶品质，提高经济效益。另外纤维素酶在食品加工和中草药加工等领域也有广泛的用途。但是，植物产生的纤维素结构致密，对纤维素酶的攻击具有很强的抵抗能力；迄今发现的所有天然纤维素酶都只能以有限的速度，缓慢地水解自然的结晶态纤维素。
[0004]热纤梭菌是I种嗜热厌氧细菌；它能够在细胞表面产生一种水解纤维素和半纤维素酶的多酶聚合体，即纤维酶体(cellulosome)。由于来源于嗜热细菌并且有多种酶的协同作用，纤维酶体的稳定性较好、降解纤维素的表观活性很高。因此几十年来，纤维酶体吸引了大批学者对其进行研究。纤维酶体的结构已经得到充分解析:纤维酶体的中心有I个支架蛋白，它的肽链中有个纤维素结合域(CBD)和多个粘连域(cohesin);纤维酶体的支架上吸附了多种酶的单体，其中包括纤维素酶、木聚糖酶等；各单体酶的肽链中都具有一段保守的序列，称为锚定域(dockerin)，单体酶被分别合成并分泌到细胞表面后以锚定域与支架上的粘连域相结合，从而形成多种酶的聚合体。纤维酶体通过CBD附着到纤维素微丝上对其进行消解。纤维酶体中的多种单体酶附着于同I个支架并共用同I个纤维素结合域(CBD)，这种结构不利于通过基因超量表达生产。
[0005]在分子生物技术高度发展的今天，我们发现纤维酶体的生产有其致命的弱点:
(1)纤维酶体产生菌是嗜热厌氧细菌，培养条件苛刻，细胞密度低，发酵产酶的效率非常低；
(2)纤维酶体由多个基因编码，总分子质量超过2000kDa，难以进行体外重组表达；(3)纤维酶体含有近20种不同的单体酶，其中许多单体并不是纤维素水解所必需的，还有些单体酶的活性不及其他来源的同类酶，因而，生产这些单体酶是生物能量的浪费；(4)纤维酶体中各种单体酶的活性有赖于支架上的CBD，离开支架后单体酶的催化活性下降。
[0006]
【发明内容】
本发明的目的:
纤维酶体中的各个单体都由独立的基因编码，这些基因都可以通过基因异源高效表达重组进行生产。但是没有支架蛋白的纤维素结合域(CBD)的作用，重组酶的活性不能充分发挥，而此时亚基上锚定域也成为多余。要解决的技术问题是建立一种对纤维酶体中的单体酶进行分子改建的方法，将纤维酶体中依赖于支架蛋白的单体酶构建成独立酶，获得生物活性明显提高的新型木质纤维水解酶，并使新酶得到异源可溶性高效表达，形成高产技术。
[0007]技术方案:
本发明采用的技术方案是通过基因重组技术，切除纤维酶体的单体酶肽链中的锚定域以减少冗余部件、用I个短链将支架蛋白上的CBD嫁接到单体酶的分子上，获得具有不同分子结构、能够独立结合底物、比单体酶活性高的新型独立酶。本技术方案在本发明中应用于、但是不限于纤维酶体中CelD的分子改建。
[0008]纤维酶体中的单体酶CelD (纤维素酶D)是最知名的活性最高的纤维素酶，由基因celD编码。运用本发明的技术方案对celD基因进行改建后产生新型纤维素酶NcelD。NcelD肽链的分子结构特征:不带有与纤维酶体支架蛋白上的粘连域相吸附的锚定域、带有I段链接短肽、有嫁接的CBD ;功能特征:是能够结合纤维素的独立酶，不需要也不结合支架蛋白，水解纤维素的活性比自然单体酶CelD提高了 66% ;生产技术:运用自主发明的基因高效表达载体(美国发明专利US 7，807，460 B2)，NcelD的编码基因在大肠杆菌(万.col O中实现可溶性高效表达。
[0009]本发明所需的实验材料及来源:
热纤梭菌(ATCC 27405)购自美国菌种管理保藏中心，并根据ATCC指南进行细胞培养。细菌DNA的提取、基因的PCR扩增和克隆等根据《分子克隆手册》第三版上的标准方法进行(Sambrook and Russell, 2001, CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York)。本实验中所用克隆宿主菌为疋coli DH10B，表达宿主菌为疋coli BL21。从NCBI数据库中获取纤维酶体上支架蛋白基因序列(GenBank accession N0.L08665.1)和单体酶基因序列(GenBank accession N0.X04584.1 ；L06942.1 )，并在线分析这些基因的信号妝、锚定域、CBD等序列结构。所采用的表达载体pHsh参见美国发明专利US 7，807，460 B2相关文献，其基因序列参见基因库资料(GenBank accession N0.FJ571619);其中目标基因的表达受sigma 32类型启动子调控。
[0010]具体操作步骤如下:
(O目标基因克隆:根据NCBI数据库中热纤梭菌纤维素酶(CelD)基因序列(GenBankaccession N0.X04584.1,SEQ ID N0.1)设计并合成引物，在上、下游引物中分别引入限制性内切酶识别位点I和通ol ;以热纤梭菌基因组DNA为模板，通过PCR的方法扩增得到目标基因单体酶^7久经I和通ο I双酶切并纯化后，连接到经过同样酶切的表达载体pHsh中；将连接产物通过电击转化到疋coli细胞中，涂布于含有氨苄青霉素的LB培养基平板，培养出带有目标基因的转化子；从转化子中提取质粒DNA，通过基因序列测定确认目标基因celD克隆成功，CdS的克隆用同样的方法，CelDXelS等酶的表达质粒被命名为 pHsh-celD, pHsh-celS 等等。
[0011](2)单体酶中锚定域的删除:根据步骤(1)所得表达质粒pHsh-celD或pHsh-celS的具体测序序列，设计引物以删除单体酶基因或编码尾部锚定域的核苷酸序列。用产生平末端的高保真性DNA聚合酶如W (TaKaRa，大连)进行反向PCR，扩增出包含去除锚定域以外的剩余部分(SEQ ID N0.2)的质粒片段，为线状DNA，用T4 DNA连接酶对线状DNA进行首尾连接，转化疋coli后得到删去锚定域的单体酶表达质粒。
[0012](3)CBD的嫁接:设计I对引物，以热纤梭菌基因组DNA为模板，用产生平末端的高保真性DNA聚合酶如W扩增支架蛋白A中编码CBD的DNA片段SEQ ID N0.3)，并且在基因片段Mi/上游融合人工设计的链接片段(编码10-60个氨基酸，在酶的主体与纤维素结合域之间起链接作用)后，即得到片段(SEQ ID N0.5)，将其插入到步骤(2)所得的删除了锚定域的表达质粒pHsh-celD中，形成新酶基因celDHbd,我们重新命名为ncelD (SEQ ID N0.6)，转化万.co7i后通过筛选和序列测定鉴定出序列正确的表达质粒，命名为pHsh-NcelD。采用同样的方法，我们得到新构建的质粒pHsh-NcelS。
[0013]单体酶基因celD或celS获得CBD基因后不再附属于原来的纤维酶体，而是独立的新型酶。
[0014]新型酶基因的高效表达:
新型酶的表达质粒pHsh-NcelD和pHsh-NcelS转化疋coli后在30°C进行通气培养3-6小时后，将培养温度提升到40°C _42°C对基因进行诱导表达，继续培养3-6小时后离心收集细胞，以超声波或均质机破碎细胞后获得新酶的粗酶液，进行SDS-PAGE分析。
[0015]有益效果:
(1)本发明的基因改建方法可取得以下有益效果:
纤梭菌产生的纤维酶体上附着有多个单体酶，具有较高的活性和稳定性。单体酶都由独立的基因编码，可以通过基因工程高效表达，但是这些单体酶需要附着于纤维酶体的支架蛋白、借助支架蛋白上的纤维素结合域(CBD)才能充分发挥它们的活性。本发明的方法是切除单体酶上的冗余序列，并且将CBD嫁接到单体酶上，获得不依赖于纤维酶体的新型独立酶，其有益效果是:既具有高活性，又方便基因工程生产。
[0016](2)通过本发明的方法对纤维素酶D进行基因改建取得以下有益效果:
纤维素酶D (CelD)是纤维酶体中活性最高的单体酶。运用本发明的方法对纤维素酶D进行基因改建后产生新型酶NcelD，其水解可溶性纤维素的活性提高了 75%。
[0017](3)用pHsh系统表达新酶取得的有益效果:
基因高效表达系统PHsh的表达载体是本实验室独家产品，获得美国发明专利(US7，807，460 B2)。新酶NcelD在pHsh载体中得到可溶性超量表达，为酶的工业化生产奠定基础。
[0018]【专利附图】

【附图说明】
图1新基因的设计和表达质粒结构图。
[0019]图2技术方案示意图。
[0020]图3基因表达产生的重组纤维素酶的SDS-PAGE分析图谱。泳道标记:M，蛋白质分子量标准；1，含PHsh载体的菌体细胞中可溶性蛋白图谱；2，含质粒pHsh-CelD菌体细胞中可溶性蛋白图谱；3，含质粒pHsh-NcelD菌体细胞中可溶性蛋白图谱。箭头所指的条带是
重组纤维素酶。
[0021]图4新酶NcelD与原始单体酶CelD的催化活性的比较。[0022]图5新酶NcelD与原始单体酶CelD的温度稳定性的比较。
[0023]【具体实施方式】
下面结合具体实施例对本发明的方法和产品作进一步说明，但不以任何形式限制本发明。
[0024]实施例1:从热纤梭菌基因组DNA扩增目标基因
引物设计:根据NCBI中报道的热纤梭菌(ATCC 27405)纤维素酶(CelD)基因序列见SEQID N0.1，去掉该基因的信号肽序列，设计并合成两条引物序列(5’端分别含有I和ZA0I酶切位点):
celD-Ι:5，AAAACTGCAGGCAAAAATAACGGAGAATTATC 3’
celD-2:5’ CCGCTCGAGTTATATTGGTAATTTCTCGATTAC 3’
基因组PCR扩增条件:培养热纤梭菌细胞，提取基因组DNA作模板。在50 μ L PCR反应体系中加入 2 μ L (20 ng)模板、2 μ L 10 μ M 引物、4 μ L 2.5 μ I^AdNTPUO yL 的5XPrime STAR HS DNA 聚合酶缓冲液、3L 5 μ L 的超纯水和(λ 5 μ L 的 Prime STAR HSDNA聚合酶。按温度周期(98°C变性10s，60°C退火15s，72°C延伸2.5min)扩增30个循环，在72°C延伸10分钟。琼脂糖电泳进行检测，发现在1.8 kb附近出现预期特异性扩增带，说明PCR条件合适，产物单一。
[0025]实施例2:热纤梭菌纤维酶体中单体酶基因的表达质粒的构建
将上述PCR产物割胶回收，进行I和通ο I双酶切，克隆到原核表达载体pHsh质粒上。转化到疋co7i DHlOB中，并在含有氨苄青霉素(100 μ g/mL)的LB培养基中培养转化子。从转化子提取质粒，以I进行酶切，验证插入基因并进行序列测定。结果表明插入基因长度为1827bp，编码含有609个氨基酸残基，序列与数据库中的序列一致。表达质粒命名为pHsh-CelD。
[0026]实施例3:基因的分子改建
引物设计:根据NCBI网站数据库中CelD蛋白肽链中的锚定域信息，设计并合成两条反向PCR引物以pHsh-CelD为模板，PCR扩增以得到包含有去除锚定域编码序列ce7i?-d(SEQID N0.2)的质粒片段，自连环化后形成新的质粒pHsh-celD-d ;根据NCBI资料中热纤梭菌支架蛋白CipA所含CBD的编码基因SEQ ID N0.3)，同时，设计引物将与di/连在一起得到基因序列ce7i?-d+cM(SEQ ID N0.4)，最后设计并合成I对PCR引物扩增带有I个链接片段的LcM(SEQ ID N0.5)，将celD-?与LcM连接后形成新酶基因celD-d+Lcbd,我们重新命名为招(SEQ ID N0.6)。
[0027]dockerin-up: TAACTCGAGCACCACCACC
dockerin-dn: TTGAGGAGAATTATAGTTGACA
cbd-1: AACGTTGGCAATGCAACACC
cbd-2: GCTTATTTCAAGGTAGGTGTC
以构建好的质粒pHsh-CelD为模板，以dockerin_up和dockerin-dn为引物,进行反向PCR ^fPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并割胶回收得到去除了 celD锚定域编码序列的线性DNA片段产物(4036bp)。同时以热纤梭菌基因组为模板，以cbd-Ι和cbd_2为引物进行PCR扩增基因和链接序列。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并割胶回收得到带有链接序列的片段(429bp)。将胶回收产物线性DNA片段和片段进行磷酸化连接反应，并电击转化到疋co7i DHlOB感受态细胞中，在含有氨苄青霉素(100 μ g/mL)的LB培养基中培养转化子，提取质粒，进行序列测定，长度为2043 bp的基因序列与预期一致。将改建成功的目标基因的表达产物命名为新型纤维素酶D (NceID)，其表达质粒命名为pHsh-NcelD。
[0028]实施例4:纤维素酶CelD和新酶NcelD的表达
将重组质粒pHsh- CelD和pHsh-NcelD分别转化到E.coli BL21中，获得基因重组菌。重组菌接种在含有氨苄青霉素(100 μ g/mL)的LB培养基中，置于30°C下震荡培养3-6小时后，将温度提升到40°C _42°C对基因进行诱导表达，在提高的温度下继续培养3-6小时后，离心收集细胞，以超声波使细胞裂解后离心，上清液为CelD和NcelD的粗酶液，进行SDS-PAGE分析，表明得到了超量表达(图3)。具体诱导表达条件:接种单菌落于含有100μ g/mL的LB培养基中，在30°C培养至OD6tltl为0.6-0.8之间，将其迅速转到42°C培养6小时，摇床转速为200 rpm。
[0029]实施例5:重组CelD和NcelD的纯化
培养液5000 rpm，4°C离心10 min收集细胞。用灭菌的去离子水洗涤细胞三次，彻底除去残留的培养基，按照1:2 (湿重:体积)的比例重悬于适量的邻苯二甲酸氢钾-咪唑(50mM,pH 6.0)缓冲液中，用高压破碎法破碎细胞后，以16000 rpm, 4°C离心15 min去除细胞碎片，上清液即为胞内粗酶液。将离心得到的粗酶液在60°C水浴锅中进行热处理30 min,以去除大肠杆菌中的杂蛋白。热处理后，4°C下以12000 rpm离心10 min去除热变性的杂蛋白，上清液为通过热处理得到部分纯化的酶液。
[0030]必要时用以下方法对酶进行进一步纯化:将热处理后的粗酶液进行DEAE-Sephrose离子交换层析。将80 mL离子交换树脂装柱后，先用10倍体积的去离子水冲洗用于保存填料的乙醇 ，再用缓冲液A平衡6~8个柱体积；将部分纯化的酶液泵入离子交换柱，流速为2 mL/min，用缓冲液洗涤2个柱体积将未结合的蛋白彻底洗尽；用400 mL含有O~0.5 mo I/L NaCl的梯度盐洗脱，收集含目标蛋白的洗脱液，以75%硫酸铵沉淀酶蛋白(4°C过夜)，4°C离心20 min后弃上清，加入缓冲液轻轻溶解蛋白并进行透析。所使用的透析缓冲液为Tris-HCl (25mM,pH7.0)，在冰上进行透析，每2小时更换一次透析缓冲液(更换3次)获得纯酶。
[0031]实施例6:纤维素酶活性测定方法
纤维素酶活性一般有两种表述:CMC水解活性、结晶纤维素水解活性。酶活性的测定都是用还原糖分析法，即用酶水解CMC或结晶纤维素底物后，测定反应液中增加的还原糖的量。
[0032]反应液的组分:45 μL 50 mM pH 5.0的缓冲液、50 μL 0.5% CMC或结晶纤维素(W/V)、5 PL适当稀释的酶液。
[0033]反应温度和时间:55°C预热10 min后加入5 μL酶液，如果以CMC为底物在55°C反应5 min ;如果以结晶纤维素为底物，在55°C反应30 min。
[0034]反应终止与显色:加入300 μL终止剂/显色剂PAHBAH (配方为:4体积的0.5 MNaOH和I体积的溶于0.5 M HCl的5% PAHBAH混合)终止反应；将混合物置于沸水浴中孵育10 min，置冰上冷却后，用分光光度计测定在波长410 nm处的吸收值。酶的活性单位定义为每分钟催化产生I Mmol还原糖的酶量。
[0035]实施例7:蛋白质浓度和还原糖浓度定量方法首先配置fcadford贮存液，其组成为:95 %乙醇10 mL与88 %磷酸20 mL混合，加入35 mg考马斯亮蓝G-250，溶解后室温下避光保存。
[0036]fcadford 工作液配方为:425 mL H2O ；15 mL 95 % 乙醇；30 mL 85 % 磷酸；30 mLBradford忙存液。
[0037]配好后,用Whatman I号滤纸过滤,避光保存于室温,可使用数周，但在使用前要再用滤纸过滤。制备标准曲线:配制标准蛋白溶液(I !^/!^牛血清白蛋白)，选择2.5 g~20 g的不同蛋白量，加入适量的水，使总体积为100 L，然后加入I mL的Bradford工作液，上下振荡混匀，放置2 min后在595 nm处测定吸收值，测量应在10 min内完成。线性回归后得到吸光度-牛血清白蛋白量标准曲线为:y = 0.0174x + 0.0051, R2 = 0.995，x表示BSA (g)，y表示吸光度A595。
[0038]样品检测同上 法，用适当稀释样品代替牛血清白蛋白，测量待测样品的A595,从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度。
[0039]葡萄糖的标准曲线的制作:
葡萄糖标准曲线制备:配制0.5 mM葡萄糖标准溶液，以不同浓度梯度的葡萄糖与NaOH/对羟基苯甲酸酰肼试剂反应，测定反应液的吸光度A41tl值。线性回归拟合后得到吸光度-葡萄糖含量标准曲线为:y = 189.23x + 0.03,R2 = 0.999，x表示葡萄糖浓度(Mmol)，I表不吸光度A41tl。
[0040]酶学性质的测定:
(I)最适反应温度的测定:取适量稀释的纯化酶液在40~80°C范围内，每隔5°C，分别测定酶活，反应体系为:适量稀释的酶液5 μ1，50 mM邻苯二甲酸氢钾-咪唑缓冲液(pH5.5)45 μΙ,Ο.5% (W/V)的CMC 50 μL，反应时间为5 min。以最高酶活力为100%，计算相对酶活。
[0041](2)温度稳定性的测定:取适量稀释的纯化酶液分别在45°C、50°C、55°C、60°C、65°C >70°C pH 5.5下保温60 min，在不同的时间取样测定酶活，以未保温(4°C保存)的酶活力为100%，计算相对酶活,确定酶的温度稳定性。
[0042](3)最适反应pH的测定:不同的pH (2.6^9.6) (pH在60°C校正)缓冲液，其中pH 2.6，3.8，4.0，4.2，4.6 的是 50 mM 乙酸-乙酸钠缓冲液，pH 4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,
7.0，7.5，8.0的是50 mM邻苯二甲酸氢钾-咪唑缓冲液，pH 8.0，8.6，9.2，9.6的是50 mMTris-甘氨酸缓冲液。于55°C分别测定酶活，反应体系为:5 μL适量稀释的纯化酶液，45μ1不同pH值的缓冲液，50 μL 0.5% (ff/V) CMC，反应5 min。以酶活力最高为100%，计算相对活性。
[0043](4) pH稳定性的测定:取5 μL适量稀释的纯化酶液分别加入不同pH值的缓冲液中，在60°C下保温30 min，再加入50 μL 0.5% (ff/V) CMC，反应时间5min再分别测定残留酶活性，以未保温(4°C保存)的酶活力为100%，计算相对酶活，比较不同pH条件下酶的稳定性。缓冲液的选择同最适反应PH的测定。反应所用缓冲液为pH 2.6~9.6的缓冲液。
[0044]试验结果表明，新型酶NcelD的活性和稳定性比自然酶CelD有明显提高(图4、5)。
【权利要求】
1.一种纤维酶体基因的改建方法，其特征在于，所述方法包括克隆目标基因、删除单体酶上的冗余序列、嫁接纤维素结合域步骤。
2.根据权利要求1所述的一种纤维酶体基因的改建方法，其特征在于，所述克隆目标基因步骤为:以纤维酶体的支架蛋白的编码基因为模板，通过PCR扩增其中的编码纤维素结合域的基因片段
3.根据权利要求1所述的一种纤维酶体基因的改建方法，其特征在于，所述删除单体酶上的冗余序列步骤为:删除cdi?中编码锚定域的碱基序列，得到基因片段
4.根据权利要求1所述的一种纤维酶体基因的改建方法，其特征在于，所述嫁接纤维素结合域步骤为将基因片段cbd融合到celD-?的尾部，得到基因celD-^cbd。
5.根据权利要求2所述的一种纤维酶体基因的改建方法，其特征在于，所述基因片段cbd的上游带有I个链接片段，编码10-60个氨基酸，在酶的主体与纤维素结合域之间起链接作用，融合有该链接片段的cbd序列称之为Lcbd。
6.一种通过基因改建获得的新型纤维素酶NcelD，其特征在于，所述新型纤维素酶NcelD由基因cdD-d+Zdi/编码，其肽链不带有与纤维酶体支架蛋白上的粘粒模块相吸附的锚定域、带有I段链接短肽、具有嫁接的纤维素结合域片段。
7.根据权利要求6所述的一种通过基因改建获得的新型纤维素酶NcelD，其特征在于，所述新型纤维素酶NcelD是能够结合纤维素的独立酶，不需要也不结合支架蛋白，水解纤维素的活性比自然单体酶CelD高。
8.一种新型纤维素酶NcelD的超量表达方法，其特征在于，以大肠杆菌表达系统PHsh的质粒为表达载体，表达质粒命名为pHsh-NcelD。
【文档编号】C12N9/42GK103923933SQ201410173567
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月28日 优先权日:2014年4月28日
【发明者】邵蔚蓝, 王洪成, 王蒙 申请人:江苏大学