一种重组t4噬菌体多核苷酸激酶及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种T4噬菌体多核苷酸激酶(T4bacteriophage?polynucleotide?kinase，T4PNK)的表达和纯化，特别涉及一种T4噬菌体多核苷酸激酶(T4bacteriophage?polynucleotide?kinase，T4PNK)的可溶性表达及纯化方法。属生物化学领域。本发明通过载体构建将T4噬菌体多核苷酸激酶基因克隆到pGEX载体中，在低温条件下T4多核苷酸激酶与GST融合表达，蛋白表达量达到15％，可溶性达95％。
【专利说明】一种重组T4噬菌体多核苷酸激酶及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种T4卩遼菌体多核苷酸激酶(T4 bacter1phage polynucleotidekinase, T4PNK)的表达和纯化，特别涉及一种T4噬菌体多核苷酸激酶(Τ4 bacter1phagepolynucleotide kinase, T4 ΡΝΚ)的可溶性表达及纯化方法。属生物化学领域。
【背景技术】
[0002]T4 卩遼菌体多核苷酸激酶(Τ4 bacter1phage polynucleotide kinase, T4 ΡΝΚ),是一种多聚核苷酸5'羟基激酶，可以催化ATP的？位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'羟基转移。其他NTP也可产生相同的反应:5' -0Η+ΝΤΡ ? 5' -P+NDP。T4Polynucleotide Kinase 同时具有 3'磷酸酯酶活性，可催化3'磷酸化的多聚核苷酸的去磷酸化:3' -P? 3' -OH+Pi。T4噬菌体多核苷酸激酶应用广泛，如寡核苷酸、DNA或RNA的5'末端标记,用作Southern、Northern、EMSA等的探针，凝胶电泳的marker,DNA测序引物,PCR引物等；使寡核苷酸、DNA或RNA的5'端磷酸化,确保后续连接反应顺利进行。作为常用的分子生物学产品，T4噬菌体多核苷酸激酶市场需求量大，目前基因工程技术克隆的重组T4噬菌体多核苷酸激酶在pET系统中表达量高，但是容易形成包涵体，纯化后只能得到少量的活性蛋白。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是为克服上述技术的不足之处，提供一种重组T4噬菌体多核苷酸激酶在大肠杆菌中可溶性表达及纯化方法。本发明通过载体构建将T4噬菌体多核苷酸激酶基因克隆到PGEX载体中，在低温条件下T4噬菌体多核苷酸激酶与GST融合表达，T4噬菌体多核苷酸激酶蛋白表达量可以达到15%，可溶性达到95%。
[0004]本发明是以如下技术方案实现的:一种重组T4噬菌体多核苷酸激酶，其特征在于的T4噬菌体多核苷酸激酶的核苷酸序列如序列表SEQ IF NO:1所示。
[0005]其制备方法包括如下步骤:通过载体构建将密码子优化的T4噬菌体多核苷酸激酶基因克隆到PGEX载体中，在低温条件下通过与GST融合表达，来提高蛋白表达量和可溶性；T4噬菌体多核苷酸激酶基因序列如序列表SEQ ID NO:1所示；Τ4噬菌体多核苷酸激酶与GST在宿主菌中融合表达，融合表达蛋白为GST-T4 PNK ;融合表达蛋白含有GST标签，用GST柱子纯化融合蛋白。
[0006]进一步的,载体构建步骤具体为如下步骤:
[0007]引物设计如下:
[0008]所用正向引物为:5 ’ -CATGGGATCCATGAAGAAAATCATT-3 下划线部分为BamHI的酶切位点；
[0009]所用反向引物为:5’-CATGCTCGAGTCAAAAGTCCCCACTAG-3’ ；下划线部分为 XhoI 的酶切位点；
[0010]以合成的Τ4 PNK为模板，用PCR的方法扩增Τ4 PNK编码序列，PCR反应条件为:94°C热变性I分钟，55°C退火lmin，72°C延伸90秒，共进行25个循环；纯化的PCR产物用BamHI和XhoI进行双酶切，然后插入pGEX的多克隆位点；对融合蛋白表达载体pGEX_T4PNK进行DNA测序，分析其阅读框和编码序列的正确性。
[0011]进一步的，融合表达步骤具体为如下步骤:
[0012]分别将融合蛋白表达载体PGEX-T4PNK和对照载体pGEX转入表达宿主菌Escherichiacoli BL21 (DE3),挑取单克隆接种至新鲜的含50mg/l氨节青霉素的LB培养基；待细菌长至OD6tltl为0.6左右，分别加入终浓度为0.6mM的IPTG诱导T4PNK的表达；将诱导过程中的温度设定为15°，诱导两个小时后收集菌体。
[0013]进一步的，纯化融合蛋白步骤具体为如下步骤:
[0014]收集一升发酵液的细胞，并用40ml冰浴的PBS重悬，PBS含有137mM NaCl, 2.7mMKCl，1mM Na2HPO4.12H20,2mM KH2PO4, pH7.4，冰浴超声裂解细胞，离心取上清，上清通过PBS预平衡的GST resin，上样完毕用PBS充分洗涤，最后用GST洗脱液，GST洗脱液为0.154gGSH溶于50ml 50mM Tris_HCl，洗脱目的蛋白；GST亲和层析去除了绝大部分菌体杂蛋白，离子交换进一步去除杂蛋白和痕量的DNA。
[0015]本发明的优点是:通过载体构建将T4多核苷酸激酶基因克隆到pGEX载体中，在低温条件下与GST融合表达，使表达蛋白可溶性大大增加。另外，GST标签的加入则使T4多核苷酸激酶的纯化更加简化、高效。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明:
[0017]图1A是重组表达载体pGEX-T4 PNK的质粒图谱；
[0018]图1B是重组T4多核苷酸激酶蛋白表达的SDS-PAGE分析；
[0019]其中，泳道I为蛋白marker(KD),泳道2和泳道3分别为IPTG诱导前和诱导后PGEX-T4PNK的全菌蛋白表达；
[0020]图2是T4多核苷酸激酶表达条件的优化；
[0021]其中，M:蛋白marker(KD) ;T、S、I分别代表全蛋白、上清和沉淀；15°C和37°C代表不同的诱导温度；
[0022]图3 是纯化后的 GST-T4 PNK 的 SDS_PAGE(12% )分析:
[0023]其中，泳道1:大量表达超声上清；泳道2 =GST纯化介质穿过；泳道3:buffer A洗漆；泳道4:buffer B洗漆；泳道5:buffer C洗漆；泳道6:buffer D洗脱融合蛋白；M:蛋白 marker (KD)；
[0024]图4是纯化后的T4多核苷酸激酶的活性测定；
【具体实施方式】
[0025]本发明通过重组T4多核苷酸激酶原核表达载体pGEX-T4 PNK的构建，成功将密码子优化的T4多核苷酸激酶基因克隆至GST标签编码序列的下游并与之处于同一阅读框，构建了融合蛋白GST-T4 PNK的原核表达载体，测序结果表明阅读框及DNA序列全部正确。通过对比实验，发现在低温诱导条件下PGEX-T4多核苷酸激酶蛋白的表达量达到15%，而可溶性达到95%。GST亲和层析去除了绝大部分菌体杂蛋白，离子交换进一步去除杂蛋白和痕量的DNA，一升发酵液中得到了约7mg的T4多核苷酸激酶(纯度约95% )。12% SDS-PAGE分析表明，纯化的T4多核苷酸激酶分子量为65kD。纯化的T4多核苷酸激酶表现出和商品化酶(NEB公司)相似的活性，比活约为10000units/mg。
[0026]下面通过优选实例对本发明做更详细的论述。
[0027]重组T4多核苷酸激酶原核表达载体pGEX-T4 PNK的构建:
[0028]以合成的T4 PNK为模板，用PCR的方法扩增T4 PNK编码序列，
[0029]所用正向引物为:5’ -CATGGGATCCATGAAGAAAATCATT-3 ’，
[0030]反向引物为:5’ -CATGCTCGAGTCAAAAGTCCCCACTAG-3 ’。
[0031]在正向引物中有一个BamHI的酶切位点(下划线)，反向引物中有一个XhoI的酶切位点(下划线)。PCR反应条件为:94°C热变性I分钟，55°C退火lmin，72°C延伸90秒，共进行25个循环。纯化的PCR产物用BamHI和XhoI进行双酶切，然后插入pGEX的多克隆位点。对重组表达载体pGEX-T4 PNK进行DNA测序，分析其阅读框和编码序列的正确性。
[0032]按照方法中所述的步骤，将密码子优化的T4 PNK基因克隆至GST标签编码序列的下游并与之处于同一阅读框。重组质粒经测序验证，成功构建了融合蛋白T4 PNK的原核表达载体，阅读框及DNA序列全部正确，其简图参见图1A。
[0033]1、T4PNK爾的表达:
[0034](I)融合蛋白T4 PNK的表达
[0035]分别将T4 PNK融合蛋白表达载体pGEX-T4 PNK和对照载体pGEX转入表达宿主菌Escherichiacoli BL21 (DE3),挑取单克隆接种至新鲜的LB培养基(含50mg/l氨节青霉素)。待细菌长至OD6tltl为0.6左右，分别加入终浓度为0.6mM的IPTG诱导T4 PNK的表达。诱导两个小时后收集菌体，处理后的菌体蛋白样品走12% SDS-PAGE，使用UVP white/ultrav1let transilluminator对考马斯亮蓝染色的凝胶进行扫描记录,采用专业分析软件Grab-1t2.5和Gelwork分析目的蛋白占菌体总蛋白的比例。本文中，可溶性定义为:可溶性的目的蛋白/总的目的蛋白X 100%。在IPTG诱导后，出现了一条约为65kD的蛋白条带，和理论分子量大小吻合，经凝胶扫描灰度分析，T4多核苷酸激酶融合蛋白约占菌体总蛋白的15%左右(图1B)。(3)融合蛋白T4 PNK表达条件的优化
[0036]经对比实验发现，在低温15°的诱导条件下，融合蛋白T4 PNK的可溶性增加，约为37°C诱导条件下的3倍。实验结果如图2所示。
[0037](2)蛋白的纯化
[0038]收集一升发酵液的细胞，并用40ml冰浴的PBS (137mM NaCl, 2.7mM KCl，1mMNa2HPO4.12H20, 2mM KH2PO4, pH7.4)重悬，冰浴超声裂解细胞，离心取上清，上清通过PBS预平衡的GST resin，上样完毕用PBS充分洗涤，最后用GST洗脱液(0.154g GSH溶于50ml50mMTris-HCl pH8.0)洗脱目的蛋白。GST亲和层析去除了绝大部分菌体杂蛋白，离子交换进一步去除杂蛋白和痕量的DNA，一升发酵液中得到了约7mg的T4多核苷酸激酶(纯度约95% )0 12% SDS-PAGE分析表明，纯化的T4多核苷酸激酶分子量为65kD(图3)。
[0039](4) T4 PNK的活性测定方法
[0040]T4PNK的活性采用[Y -32PlATP掺入法进行定量分析，具体流程参考文献(Proc.Natl Acad.Sc1.USA.54(1965)，158-165)。I 单位即 I 个 Richardson 单位，指 37°C条件下，30分钟内催化Inmol酸不溶性[32p]掺入所需要的酶量。
[0041]如图4所示，在50μ 1T4多聚核苷酸激酶反应缓冲液体系中，37°C温育30分钟，？-磷酸基团从ATP转移至d(T)8的5'羟基末端[ATP与d(T)8比例是1: 1，量为50pmol]，结果显示 20单位酶量可使超过90%的磷酸基团转移。
【权利要求】
1.一种重组T4噬菌体多核苷酸激酶，其特征在于所述的T4噬菌体多核苷酸激酶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
2.如权利要求1所述的一种重组T4噬菌体多核苷酸激酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:通过载体构建将密码子优化的T4噬菌体多核苷酸激酶基因克隆到pGEX载体中，在低温条件下通过与GST融合表达，来提高蛋白表达量和可溶性；所述T4噬菌体多核苷酸激酶基因序列如序列表SEQ ID NO:1所示；T4噬菌体多核苷酸激酶与GST在宿主菌中融合表达，融合表达蛋白为GST-T4 PNK ;所述融合表达蛋白含有GST标签，用GST柱子纯化融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的一种重组T4噬菌体多核苷酸激酶的制备方法，其特征在于所述载体构建步骤具体为如下步骤: 引物设计如下: 所用正向引物为:5’ -CATGGGATCCATGAAGAAAATCATT-3’:下划线部分为BamHI的酶切位占.所用反向引物为:5’ -CATGCTCGAGTCAAAAGTCCCCACTAG-3’ ;下划线部分为XhoI的酶切位点； 以合成的T4 PNK为模板，用PCR的方法扩增T4 PNK编码序列，PCR反应条件为:94°C热变性I分钟，55°C退火Imin，72°C延伸90秒，共进行25个循环；纯化的PCR产物用BamHI和XhoI进行双酶切，然后插入pGEX的多克隆位点；对融合蛋白表达载体pGEX-T4 PNK进行DNA测序，分析其阅读框和编码序列的正确性。
4.根据权利要求 2所述的一种重组T4噬菌体多核苷酸激酶的制备方法，其特征在于所述融合表达步骤具体为如下步骤: 分别将融合蛋白表达载体PGEX-T4 PNK和对照载体pGEX转入表达宿主菌Escherichiacoli BL21 (DE3),挑取单克隆接种至新鲜的含50mg/l氨节青霉素的LB培养基；待细菌长至OD6tltl为0.6左右，分别加入终浓度为0.6mM的IPTG诱导T4 PNK的表达；将诱导过程中的温度设定为15°，诱导两个小时后收集菌体。
5.根据权利要求2所述的一种重组T4噬菌体多核苷酸激酶的制备方法，其特征在于所述纯化融合蛋白步骤具体为如下步骤: 收集一升发酵液的细胞，并用40ml冰浴的PBS重悬，所述PBS的构成为137mM NaCl，.2.7mM KCiaOmM Na2HPO4.12H20,2mM KH2PO4, pH7.4，冰浴超声裂解细胞，离心取上清，上清通过PBS预平衡的GST resin,上样完毕用PBS充分洗涤，最后用GST洗脱液，所述GST洗脱液的构成为0.154g GSH溶于50ml 50mM Tris-HCl，洗脱目的蛋白；GST亲和层析去除了绝大部分菌体杂蛋白，离子交换进一步去除杂蛋白和痕量的DNA。
【文档编号】C12N15/54GK104178467SQ201410361153
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年7月24日 优先权日:2014年7月24日
【发明者】孙启明, 张亚, 徐卫国, 陈远 申请人:孙启明