甲基化dna富集试剂及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及甲基化DNA富集试剂及其制备方法和应用。甲基化DNA富集试剂是一种由甲基化结合蛋白和凝胶或磁珠合成的甲基化DNA亲和介质。利用本发明的甲基化DNA亲和介质可建立简单、高效的尿液甲基化DNA富集试剂和DNA转化的一步法。大体积尿液中的甲基化DNA可以通过甲基化结合蛋白的亲和介质富集，提高了检测的灵敏度和速度。富集的甲基化DNA无需进一步的DNA分离纯化，可以直接用于甲基化分析。
【专利说明】甲基化DNA富集试剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体地涉及一种利用甲基化结合蛋白直接富集，转化并鉴定尿液中甲基化DNA的试剂及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]DNA甲基化(DNA methylat1n)是指在DNA甲基化转移酶(DNMT)催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将活性甲基转移至DNA链中特定碱基上的化学修饰过程。哺乳动物基因组中，DNA甲基化多发生在CpG 二核苷酸中的胞嘧啶的5位碳原子。DNA甲基化是一种表观(epigenetic)修饰，它在不改变DNA序列的情况下，对个体的生长、发育、基因表达模式以及基因组的稳定性起到重要的调控作用，并且这种修饰在发育和细胞增殖的过程中是可以稳定传递的。近年来的大量研究表明，DNA异常甲基化与肿瘤的发生、发展、细胞癌变有着密切的联系。目前基础研究表明DNA甲基化异常在肿瘤发生、发展中的作用主要包括:(I)DNA甲基化异常促使C~T突变发生，研究表明DNA甲基化使胞嘧啶转变成5 mC,而5mC的突变率比其他碱基(包括没有甲基化的胞嘧啶)突变率高。同时DNA甲基转移酶(DNMT)在催化突变反应方面有重要作用，参与导致C-U-T的转换，包括p53在内的许多肿瘤抑制基因的5 mC在恶性肿瘤中都是突变的热点，DNA甲基化异常在这些突变中发挥一定的作用。(2)DNA甲基化异常影响基因的表达。肿瘤组织中基因组甲基化状态不同于正常组织，表现为整个基因组的低甲基化与部分区域特别是基因启动子区CpG岛的高甲基化共存，这种甲基化状态与许多肿瘤相关基因的异常表达有关。肿瘤中基因组甲基化程度普遍降低，其中许多特异癌基因也出现低甲基化，同时伴随它们的表达有不同程度的增加。有报道认为在细胞群体中，DNA低甲基化可能是导致肿瘤形成的原始细胞克隆增殖的关键因素之一。但低甲基化与基因表达的关系还有待进一步研究阐明。肿瘤细胞中许多抑癌基因的启动子区CpG岛发生高甲基化目前被广泛研究，这种甲基化异常与该基因的转录抑制相关，并能通过有丝分裂稳定的遗传。所以认为，启动子区CpG岛的异常高甲基化是抑癌基因失活的一种机制。研究发现在结直肠癌细胞株中，一个P16等位基因发生突变而未甲基化，另一个未突变但高度甲基化，最终该基因发生转录抑制。此外越来越多的基因被报道在肿瘤中因高甲基化而导致转录抑制，这些基因涉及细胞周期调控、生长和分化(ER基因)、血管生成(THBS1基因)、粘连和转移(--ΜΡ3基因)、DNA修复(MGMT基因)等多方面，表明高甲基化在肿瘤形成中发挥着作用。
[0003]DNA甲基化在肿瘤中的作用主要表现在以下几个方面:一，甲基化的CpG岛二核苷酸中的胞嘧啶以较高的频率脱氨基变成胸腺嘧啶，造成基因突变；二，抑癌基因和DNA修复基因由于超甲基化而沉默；三，癌基因甲基化水平降低而活化；四，基因组总体甲基化水平降低使转座子、重复序列活化导致染色体稳定性下降。这些因素是肿瘤发生、发展、转移、恶化最终导致患者死亡的重要原因。DNA总体甲基化水平(即甲基化谱)和特定基因甲基化程度改变可作为肿瘤诊断指标。
[0004]目前常用的甲基化DNA检测方法是从组织样本中提取DNA进行甲基化DNA检测。此种方法的缺点是不适合肿瘤的早期诊断。而早期肿瘤的治愈率远高于晚期肿瘤。相应的死亡率也大大降低。因此能够提高肿瘤早期诊断率的方法和技术一直是医学界探索的重要目标。
[0005]尿液做为常规检验样本，收集简单，易于处理，可以大量获得。如果能从尿液中富集甲基化DNA，那么当肿瘤出现DNA甲基化时，在早期阶段即有可能被发现。医生可以迅速采取必要的医疗措施，及早消除病患。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种方法简单、高效，可将富集和转化一步完成的甲基化DNA富集试剂。
[0007]本发明的另一目的是提供一种利用甲基化DNA富集试剂富集尿液中甲基化DNA的方法。
[0008]本发明采用的技术方案是:一种甲基化DNA富集试剂，是一种由甲基化结合蛋白和带有镍配基的凝胶或磁珠合成的甲基化结合蛋白凝胶或甲基化结合蛋白磁珠。
[0009]上述的甲基化DNA富集试剂，所述的镍配基的凝胶是金属镍螯合琼脂糖凝胶；所述的镍配基的磁珠是琼脂糖镍磁珠。
[0010]上述的甲基化DNA富集试剂，甲基化DNA富集试剂中含有稳定剂，所述的稳定剂包含 PPG 或 Tween20。
[0011]上述的甲基化DNA富集试剂，所述的甲基化结合蛋白的DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0012]上述的甲基化DNA富集试剂的制备方法如下:
[0013]I)按SEQ ID N0.1所示的DNA序列，人工合成甲基化结合蛋白基因，将得到的基因插入到载体质粒PET中，构建甲基化结合蛋白表达质粒ρΕΤ-ΜΒΡ，将质粒ρΕΤ-ΜΒΡ转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到重组大肠杆菌；将重组大肠杆菌接种于LB培养基中进行摇瓶培养，当菌液吸光度值达到0.4时，在37°C条件下用IPTG诱导，使IPTG的终浓度为0.5mM,诱导15~17小时，7000转/分钟离心，收集菌体细胞；
[0014]2)将菌体细胞经溶菌酶裂解30分钟后，超声波破碎，离心，得到含有甲基化结合蛋白的裂解液，加入金属镍螯合琼脂糖凝胶或琼脂糖镍磁珠，混合并在4°C孵育2小时，1000转/分钟离心，除去上清液，并用1ml 50mM Tris-HCl pH7.5 ；150mM NaCl缓冲液洗两次，每次用1000转/分钟离心，最后以Iml的50mM Tris-HCl pH7.5 ；150mM NaCl缓冲液悬浮带有甲基化结合蛋白的凝胶，制得甲基化DNA富集试剂。
[0015]本发明的甲基化DNA富集试剂用于富集尿液中甲基化DNA，方法如下:
[0016]I)取尿样，3000转/分钟，取上清液；
[0017]2)向50ml上清液中加入甲基化DNA富集试剂10微升，于4_25°C下振荡保温Ih ；
[0018]3) 1000 转 / 分钟离心，除去上清液，以 Iml 的 50mM Tris-HCl ρΗ7.5，150mM NaCl缓冲液将甲基化结合蛋白凝胶转移到离心管中，离心除去上清液，即得富集了尿样中甲基化DNA的甲基化结合蛋白凝胶。
[0019]本发明的甲基化DNA富集试剂还可用于制备富集甲基化DNA的试剂盒。
[0020] 本发明的有益效果是:本发明是一种利用凝胶或磁珠与甲基化结合蛋白结合而建立的简单、高效的尿液甲基化DNA富集、转化一步法。本发明将甲基化结合蛋白的基因克隆到细菌表达质粒的基因表达位点。表达出来的甲基化结合蛋白带有六个组氨酸的C-末端。该蛋白可以用亲和层析方法直接纯化，并以非共价键形式连接在凝胶或磁珠上，制成的甲基化富集试剂可以用于甲基化的DNA富集。肿瘤组织释放出的甲基化DNA可以通过血液进入尿液。尿液的成份相对血液要简单并容易收集，更容易用于肿瘤检测。大体积尿液中的甲基化DNA可以通过甲基化结合蛋白凝胶或磁珠富集，进一步提高检测的灵敏度和速度。富集的甲基化DNA无需进行通常的DNA分离纯化，直接用于甲基化分析。
[0021]尿样中含有两类DNA:—类来自血液，另外一类来自输尿管和膀胱。有诊断意义的DNA是来自血液的较小的DNA片段。本发明首先经离心将尿液里的大分子DNA和细胞碎片分离。然后将含有血液DNA的尿液与带有甲基化结合蛋白的凝胶或磁珠混合。经孵育后，离心过滤收集带有甲基化DNA的甲基化结合蛋白凝胶。凝胶-甲基化结合蛋白-DNA复合沉淀可以直接用于甲基化DNA的转化和测定。尿液中甲基化基因特定位点的甲基化可通过亚硫酸氧化和快速、灵敏的实时定量PCR方法测定。本发明的创新之处在于通过简单的一步法可以将大量尿液中待测的甲基化DNA特异性富集，无需进一步的分离纯化直接进行转化和检测，进而提高了检测速度和灵敏度。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1.甲基化结合蛋白表达质粒的构建。
[0023]图2.甲基化结合蛋白的电泳图；
[0024]图中，I).纯化甲基化结合蛋白；2).凝胶-甲基化结合蛋白；
[0025]3).磁珠-甲基化结合蛋白。
[0026]图3.甲基化DNA亚硫酸盐转化和PCR分析；
[0027]图中，I).DNA标准物；2).阴性对照；3).阳性结果。
[0028]具体实施方法
[0029]实施例1甲基化DNA富集试剂
[0030]I)甲基化结合蛋白表达质粒(ρΕΤ-ΜΒΡ)的构建
[0031]按SEQ ID N0.1所示的DNA序列，人工合成甲基化结合蛋白基因，将得到的基因插入到载体质粒PET中，构建甲基化结合蛋白表达质粒ρΕΤ-ΜΒΡ，将质粒ρΕΤ-ΜΒΡ转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到重组大肠杆菌；将重组大肠杆菌接种于LB培养基中进行摇瓶培养，当菌液吸光度值达到0.4时，在37°C条件下用IPTG诱导，使IPTG的终浓度为0.5mM，诱导16小时，7000转/分钟离心，收集菌体细胞，保存在_80°C低温冰箱。
[0032]2)凝胶甲基化DNA富集试剂
[0033]菌体细胞经溶菌酶裂解(lmg/ml，30分钟，不时摇动)，然后，超声波破碎(1x10分钟，冰浴控制温度)，离心，得到含有甲基化结合蛋白的裂解液，加入2毫升的金属镍螯合琼脂糖凝胶，混合并在4°C孵育2小时，1000转/分钟离心，除去上清液，并用50mM Tris-HClpH7.5 ；150mM NaCl缓冲液1ml洗两次，每次用1000转/分钟分离，最后以Iml的50mMTris-HCl pH7.5 ；150mM NaCl缓冲液悬浮带有甲基化结合蛋白的凝胶，从而得到甲基化结合蛋白凝胶，即甲基化DNA富集试剂。其电泳检测分子量2.6kDa(如图2)。
[0034]3)磁珠甲基化DNA富集试剂
[0035]菌体细胞经溶菌酶裂解(lmg/ml，30分钟，不时摇动)，然后，超声波破碎(1x10分钟，冰浴控制温度)，离心，得到含有甲基化结合蛋白的裂解液，加入2毫升的琼脂糖镍磁珠，混合并在4°C孵育2小时，1000转/分钟离心，除去上清液，并用50mM Tris-HClpH7.5 ；150mM NaCl缓冲液1ml洗两次，每次用1000转/分钟分离，最后以Iml的50mMTris_HClpH7.5 ；150mM NaCl缓冲液悬浮带有甲基化结合蛋白的磁珠，从而得到甲基化结合蛋白磁珠，即甲基化DNA富集试剂。
[0036]得到的甲基化DNA富集试剂的稳定性也可以通过加入甲基化结合蛋白稳定剂增加其稳定性。稳定剂包含PPG、Tween20或者特异蛋白等。
[0037]实施例2尿样中甲基化DNA的富集
[0038]方法如下:
[0039]1.尿样采集
[0040]可以采用标准尿样容器，采集量约50毫升。尿样转移到50ml的离心管中，然后离心，3000转/分钟，除去尿样中杂质。将离心得到的上清液转移至新的50ml的离心管中，进入下面结合步骤。
[0041]2.甲基化DAN结合
[0042]向50ml上清液中加入实施例1中2)制备的凝胶甲基化DNA富集试剂10微升，并在室温摇动(60次左右/分钟)，保温一小时。此过程也可以在4°C下进行。此时尿样中的甲基化DNA已和富集试剂中的甲基化结合蛋白结合。
[0043]3.甲基化DAN富集
[0044] 1000 转 / 分钟离心，除去上清液，并以 Iml 的 50mM Tris-HCl ρΗ7.5，150mM NaCl缓冲液将富集了甲基化DNA的凝胶转移到1.5ml的离心管中。1000转/分钟离心，除去上清，即得富集了甲基化DNA的甲基化结合蛋白凝胶。所得到的凝胶可以直接用于甲基化分析。包括转化、杂交、CPR以及DNA序列测定等甲基化分析。
[0045]4.甲基化DNA亚硫酸盐转化和PCR分析
[0046]富集了甲基化DNA的凝胶试剂不需分离和纯化，直接经亚硫酸盐转化和PCR甲基化分析。首先，向富集的甲基化DNA样品中加入100微升的转化试剂，然后对转化的样品进行脱磺酸基处理(Zymo甲基化DNA转化试剂盒)。转化后的DNA经甲基化特异性引物(正向引物为 TATAAACCCTAAACACTAAACCACG，反向引物为 TATATTCGGGGTGTGTGTGTTTGAC)进行PCR扩增，得到PCR产物，其电泳图如图3所示。PCR条件:20微升反应物，95oC 10分钟；40X(95oC，30秒;60oC，30秒;72oC，30秒)；72oC，3分钟。实验中采用的是正常人甲基化DNA靶物。PCR得到的DNA条带长度为130对碱基(图3)。
[0047]本发明采用尿样为检测样品，方便、无创。采用甲基化DNA富集凝胶或磁珠富集甲基化DNA，方法简便，并可以提高检测灵敏度。甲基化DNA直接在磁珠上进行转化，不需DNA纯化。因此本发明所阐述的方法具有快速、无创、方便、准确等诸多优点。
【权利要求】
1.一种甲基化DNA富集试剂，其特征在于:甲基化DNA富集试剂是由甲基化结合蛋白和带有镍配基的凝胶或磁珠合成的甲基化结合蛋白凝胶或甲基化结合蛋白磁珠。
2.如权利要求1所述的甲基化DNA富集试剂，其特征在于:所述的带有镍配基的凝胶是金属镍螯合琼脂糖凝胶；所述的镍配基的磁珠是琼脂糖镍磁珠。
3.如权利要求1或2所述的甲基化DNA富集试剂，其特征在于:甲基化DNA富集试剂中含有稳定剂，所述的稳定剂包含PPG或TWeen20。
4.如权利要求1或2所述的甲基化DNA富集试剂，其特征在于:所述的甲基化结合蛋白的DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
5.权利要求4所述的甲基化DNA富集试剂的制备方法，其特征在于方法如下: 1)按SEQID N0.1所示的DNA序列，人工合成甲基化结合蛋白基因，将得到的基因插入到载体质粒中，构建甲基化结合蛋白表达质粒，将质粒转入大肠杆菌感受态细胞中，得到重组大肠杆菌； 2)将菌体细胞经溶菌酶裂解30分钟后，超声波破碎，离心，得到含有甲基化结合蛋白的裂解液，加入金属镍螯合琼脂糖凝胶或琼脂糖镍磁珠 ，混合并在4°C孵育2小时，1000转/分钟离心，除去上清液，并用1ml 50mM Tris-HCl pH7.5,150mM NaCl缓冲液洗两次，每次用1000转/分钟离心，最后以Iml的50mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl缓冲液悬浮带有甲基化结合蛋白的凝胶，制得甲基化DNA富集试剂。
6.权利要求1或2所述的甲基化DNA富集试剂在富集尿液中甲基化DNA的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于方法如下: 1)取尿样，3000转/分钟，取上清液； 2)向50ml上清液中加入甲基化DNA富集试剂10微升，于4_25°C下振荡保温Ih； 3)1000转/分钟离心，除去上清液，以Iml的50mM Tris-HCl ρΗ7.5，150mM NaCl缓冲液将甲基化结合蛋白凝胶转移到离心管中，离心除去上清液，即得富集了尿样中甲基化DNA的甲基化结合蛋白凝胶。
8.权利要求1或2所述的甲基化DNA富集试剂在甲基化DNA富集试剂盒中的应用。
【文档编号】C12N15/10GK104131004SQ201410361087
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月25日 优先权日:2014年7月25日
【发明者】李伟东 申请人:沈阳百创特生物科技有限公司