一种处理流感病毒收获液的方法
【专利摘要】本发明提供了一种处理流感病毒收获液的方法，该方法将感染了流感病毒的鸡胚尿囊液收集后，分别使用碟片离心机、预过滤器、减菌滤器对其进行处理，使处理后的流感病毒收获液流感病毒抗原的损失率低于10％，显著降低流感病毒收获液中微生物限度，比国家药典中规定的微生物下限低了2个数量级。本发明方法能有效去除收获液中的杂质，为后期制备流感疫苗提供了安全保障，且能够提高了单根减菌滤器的通量和使用效率，降低了减菌滤器的使用成本，在流感病毒疫苗的制备领域具有较好的应用前景。
【专利说明】一种处理流感病毒收获液的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及疫苗制备领域，具体地，涉及一种处理流感病毒收获液的方法。
【背景技术】
[0002] 流行性感冒（influenza，简称流感）是由甲（A)、乙（B)、丙（C)三型流感病毒引起 的急性呼吸道感染疾病，具有传染性强、传播速度快的特点。甲型流感病毒常以流行形式出 现，引起世界性流感大流行，它在动物中广泛分布，并能在动物中引起流感流行和动物大量 死亡；乙型流感病毒常常引起流感局部暴发；丙型流感病毒主要以散在形式出现，主要侵 袭婴幼儿，一般不引起流感流行。流感主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污 染物品的接触传播。接种流感疫苗是预防和控制流感的最有效手段之一，可以减少接种者 感染流感的机会或者减轻流感症状。
[0003] 根据WHO相关指南规定，流感疫苗的生产可使用健康鸡群来源的鸡胚。目前，国内 外流感疫苗生产普遍遵循这一原则，基本工艺步骤包括毒种接种鸡胚尿囊腔、培养、病毒收 获、纯化、灭活、裂解、再纯化等。但传统的鸡胚培养技术存在收获液成分复杂不易处理问 题。收获液中杂质主要有卵清、蛋壳、鸡血细胞、来自蛋壳表面和鸡胚本身可能存在的外源 性微生物等，这些杂质会增加后期灭活和纯化工艺的难度，尤其微生物过多，会产生大量细 菌内毒素，增加疫苗的副反应，给疫苗的安全性带来风险。中国药典第三部（2010版）中规 定收获液中微生物限度应小于l〇 5CFU/ml。
[0004] 为了满足流感疫苗收获液中国家规定的微生物小于l〇5CFU/ml的标准，现有各厂 家在处理流感病毒收获液过程中使用了不同的工艺技术，分别采用絹布过滤，20 μ m-ι μ m 多级滤器过滤，管式离心机分离澄清，0. 45 μ m滤芯过滤，除菌级0. 2 μ m滤芯过滤，或前述 两种或两种以上方法的组合。但这些处理流感病毒收获液方法的效果均不理想，主要表现 在流感病毒抗原损失较大、收获液微生物限度降低不显著、使用大量滤芯造成成本增加。因 此需要开发一种处理流感病毒收获液的新工艺来解决上述问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种处理流感病毒收获液的方法，以解决现有技术在处理 后的流感病毒收获液中流感病毒抗原损失较大、收获液中微生物限度降低不显著、且使用 大量滤芯造成生产成本增加的诸多问题。
[0006] 本发明提供的一种处理流感病毒收获液的方法，包括以下步骤：
[0007] (1)将流感病毒收获液经碟片离心机离心后，收集澄清液；
[0008] (2)澄清液通过预过滤器过滤；
[0009] (3)滤液经过减菌滤器过滤；
[0010] 本发明所述的流感病毒收获液为接种流感病毒后收获的鸡胚尿囊液。所述的流感 病毒收获液获得方法是将l〇2-l〇5EID5(l/ml的流感病毒接种于9-11日龄鸡胚的尿囊腔中，将 接种后鸡胚置于32-36°C孵化器中培养30-90小时，留下活胚，置0-KTC冷胚后，收获的鸡 胚尿囊液即为流感病毒收获液。
[0011] 本发明方法中，步骤⑴碟片离心机转速为4000-10000rpm，排渣时间为 30_90min。
[0012] 优选地，步骤（1)碟片离心机转速为7200rpm，排渣时间为60min。
[0013] 其中，步骤（1)进料速度控制在2. 0?5. Okg/min。进料即将流感病毒收获液投放 入碟片离心机。
[0014] 本发明方法中，步骤（2)的预过滤器孔径彡5μπι。
[0015] 优选地，步骤（2)的预过滤器孔径为1. 0 μ m。
[0016] 步骤⑵过滤过程中滤器压力彡0· 2MPa。优选彡0· IMPa。
[0017] 本发明方法中，步骤（3)的减菌滤器孔径为(λ 2-0. 45μπι。优选(λ 2μπι
[0018] 其中，步骤（3)过滤过程中滤器压力彡0· 2MPa。优选彡0· IMPa。
[0019] 本发明提供了上述方法在制备流感疫苗中的应用。
[0020] 本发明的创新之处在于将碟片离心机、预过滤器、减菌滤器的组合应用于流感病 毒收获液的处理中。碟片离心机是立式连续流离心机的一种，其转鼓装在立轴上端，通过传 动装置由电动机驱动而高速旋转。在转鼓内有一组互相套叠在一起的碟形零件--碟片。 碟片与碟片之间留有很小的间隙。料液从位于转鼓中心的进料管进入转鼓。再流过碟片之 间的间隙，固体颗粒（或液滴）在离心机作用下沉降到碟片上形成沉渣（或液层）。沉渣沿 碟片表面滑动而脱离碟片并积聚在转鼓内直径最大的部位，分离后的液体从出液口排出转 鼓。
[0021] 碟片的作用是缩短固体颗粒（或液滴）的沉降距离、扩大转鼓的沉降面积，转鼓中 由于安装了碟片而大大提高了分离机的生产能力。积聚在转鼓内的沉渣通过排渣装置在不 停机的情况下从转鼓中排出。
[0022] 预过滤滤器和减菌滤器的原理：两种过滤器原理一样，都是料液经过一定孔径的 滤芯，在直接拦截和惯性撞击作用下，将料液中较大的微生物（细菌等）、较大的蛋白团块 拦截下来，比孔径小流感病毒等可通过滤芯，达到降低微生物限度的目的。
[0023] 本发明方法使用了碟片离心机大大的提高了处理料液能力，提高了生产能力。使 处理后的流感病毒收获液中流感病毒抗原的损失率低于10%，显著降低流感病毒收获液中 微生物限度，比国家药典中规定的微生物下限（< l〇5CFU/ml)低了 2个数量级。本发明方 法能有效去除收获液中的杂质，去除蛋壳、鸡血细胞、较大的蛋白团块等，使流感病毒充分 暴露，有利于后期流感病毒的灭活，使灭活更加充分，减少疫苗副反应的发生，保证了疫苗 的安全性，且能够提高了单根减菌滤器的通量和使用效率，降低了减菌滤器的使用成本，在 流感病毒疫苗的制备领域具有较好的应用前景。
【具体实施方式】
[0024] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0025] 若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的 技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明实施例中使用的碟片离心机，型 号：HGDH204VC-90A，南京中船绿洲机器有限公司；预过滤器，货号：ZCGF2-1. OC domni ck hunter ;减菌滤器，货号：BPH-2. 2-CAS domnick hunter ;鸡胚孵化器，型号：XF_45北京云 峰利民畜牧设备有限公司。
[0026] 本发明实施例中，流感病毒收获液是通过如下方法获得的：流感病毒工作种子 (工作种子是由世界卫生组织（WHO)推荐、并经国家药品管理部门认可的甲型和乙型流感 病毒的当年流行株或相似株传1-2代制备成的主种子批，主种子批传1-2代制备成的工作 种子批）接种、培养：将稀释至一定病毒量l〇 2-l〇5EID5(l/ml的工作种子接种于9-11日龄鸡 胚尿囊腔中，将接种后鸡胚置于32-36°C中培养30-90小时。收获流感病毒：对培养完成的 鸡胚进行照检，留下活胚，置〇-l〇°C经一定时间冷胚后，收获流感病毒尿囊液。
[0027] 从收获的流感病毒尿囊液中取样检测血凝素含量、微生物限度。采用平皿法检测 微生物限度。具体为，将样品用PH7. 0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液进行1 :10系列稀释，每 一稀释度各取2ml，分注于2个平皿中，每块平皿注入lml，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培 养，计数。
[0028] 实施例1处理流感病毒收获液的方法（1)
[0029] 1、碟片离心机离心：流感病毒收获液经过碟片离心机离心收集澄清液，碟片离心 机转速为4000rpm，排渣时间为30min，进料速度控制在2. Okg/min。
[0030] 2、澄清液经过孔径1 μ m的预过滤器过滤，过滤过程中滤器压力控制在0· 05MPa。
[0031] 3、料液再经过孔径为0.2μπι减菌滤器过滤，过滤过程中滤器压力控制在 0.05MPa，并记录减菌滤器的通量。过滤完成后取样检测血凝素含量、微生物限度。结果见 表1。本方法有效去除收获液中的杂质，去除蛋壳、鸡血细胞、较大的蛋白团块。
[0032] 实施例2处理流感病毒收获液的方法（2)
[0033] 1、碟片离心机离心：流感病毒收获液经过碟片离心机离心收集澄清液，碟片离心 机转速为7〇〇〇rpm,排渔时间为60min，进料速度控制在3. 5kg/min。
[0034] 2、澄清液经过孔径3 μ m的预过滤器过滤，过滤过程中滤器压力控制在0· IMPa。
[0035] 3、料液再经过孔径为0· 3 μ m减菌滤器过滤，过滤过程中滤器压力控制在0· IMPa， 并记录减菌滤器的通量。过滤完成后取样检测血凝素含量、微生物限度。结果见表1。本方 法有效去除收获液中的杂质，去除蛋壳、鸡血细胞、较大的蛋白团块。
[0036] 实施例3处理流感病毒收获液的方法（3)
[0037] 1、碟片离心机离心：流感病毒收获液经过碟片离心机离心收集澄清液，碟片离心 机转速为lOOOOrpm,排渔时间为90min，进料速度控制在5. Okg/min。
[0038] 2、澄清液经过孔径5 μ m的预过滤器过滤，过滤过程中滤器压力控制在0. 2MPa。
[0039] 3、料液再经过孔径为0.45 μ m减菌滤器过滤，过滤过程中滤器压力控制在 0. 2MPa，并记录减菌滤器的通量。过滤完成后取样检测血凝素含量、微生物限度。结果见表 1。 本方法有效去除收获液中的杂质，去除蛋壳、鸡血细胞、较大的蛋白团块。
[0040] 实施例4处理流感病毒收获液的方法（对照试验）
[0041] 流感病毒收获液通过20 μ m滤器、10 μ m滤器、3 μ m滤器、1 μ m滤器多级滤器过滤， 再将澄清液经过除菌级〇. 2 μ m滤芯过滤，进料速度与新工艺一致，记录减菌滤器的通量， 与实施例1-3方法的结果进行比较，评价本发明方法中减菌滤器的处理能力。结果见表1。
[0042] 通过对比实施例1-4的方法处理流感病毒收获液后的各项指标，可以发现，实施 例1-3采用本发明的方法收获抗原损失率较低，微生物限度远远低于2010版中国药典标准 (< 105CFU/ml)。本发明方法中减菌滤器通量高于对照工艺中减菌滤器通量。
[0043] 表1 :本发明方法处理流感病毒收获液后的各项指标评价
[0044]
【权利要求】
1. 一种处理流感病毒收获液的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将流感病毒收获液经碟片离心机离心后，收集澄清液； (2) 澄清液通过预过滤器过滤； (3) 滤液经过减菌滤器过滤； 所述的流感病毒收获液为接种流感病毒后收获的鸡胚尿囊液。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的流感病毒收获液获得方法是将 102-105EID 5(l/ml的流感病毒接种于9-11日龄鸡胚的尿囊腔中，将接种后鸡胚置于32-36°C 孵化器中培养30-90小时，留下活胚，置0-10°C冷胚后，收获的鸡胚尿囊液即为流感病毒收 获液。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤⑴碟片离心机转速为 4000-10000rpm,排渣时间为 30-90min。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)是将流感病毒收获液投放入碟片离 心机的速度控制在2. 0?5. Okg/min。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤⑵的预过滤器孔径< 5 μ m。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)过滤过程中滤器压力彡0. 2MPa。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3)的减菌滤器孔径为0.2-0. 45 μ m。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3)过滤过程中滤器压力彡0. 2MPa。
9. 权利要求1-8任一所述的方法在制备流感疫苗中的应用。
【文档编号】C12R1/93GK104195118SQ201410380228
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月4日 优先权日:2014年8月4日
【发明者】庞鉴勇, 陈秋兰, 惠增弟, 张景敏, 李军, 胡伟, 尹卫东 申请人:北京科兴生物制品有限公司