一种利用ssr指纹图谱鉴别白蜡种的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用SSR指纹图谱鉴别白蜡种的方法，步骤包括：(1)白蜡总DNA提取，(2)SSR序列PCR扩增，(3)PCR扩增产物电泳、染色及鉴定；其中：步骤(2)公开的4对SSR引物组合即可将白蜡DNA进行PCR扩增，获得扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测条带差异性明显的结果，并以此构建了白蜡种的SSR指纹图谱。本发明方法从分子水平上对白蜡种质资源进行了准确鉴定，解决了白蜡种质鉴定困难的问题，且检测时间短、重复性好、准确性高、在收集的12个种中具有专一性。
【专利说明】—种利用SSR指纹图谱鉴别白蜡种的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用SSR指纹图谱鉴别白蜡种的方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]指纹图谱最重要的应用之一是种质的鉴定。种质鉴定不清会导致劣种趋多，种质资源浪费，甚至种群退化。因此，种质鉴定无论在生产上或者研究中都非常的重要。传统的鉴定方法过程复杂，鉴定周期长，并且易受取样部位、发育时期及环境等多种因素的影响，准确率不高，对于实验人员的操作技术要求比较精细，因而无法大规模推广应用，鉴定效率低。尤其在植物苗木的鉴定上，近缘种内不同种源、无性系、品种间很难区分。近年来发展的指纹图谱技术方便快捷且结果准确稳定，被越来越多的应用与植物品种鉴定工作中。目前 DNA 指纹图谱技术主要有 RFLP (Restrict1n Fragment Length Polymorphism,限制性内切酶片段长度多态性)、RAPD(Random Amplified Polymorphism DNA，随机多态扩增DNA)、AFLP (Amplified fragment length polymorphism,扩增片段长度多态性)、SSR(SimpleSequence Repeat,简单序列重复)、ISSR(Inter Simple Sequence Repeat,简单序列重复区间扩增多态性)等。综合比较当今应用广泛的几种分子标记方法，SSR标记是种质鉴定方面最灵敏、最可靠的一种分子标记。
[0003]白蜡属植物为风媒花，混栽时很容易发生天然授粉杂交，尤其是绒毛白蜡(F.velutina)、红柊(F.pennsylvanica)、白柊(F.americana)等同为柊亚属柊组,其形态特征非常相似，亲缘关系极为亲近，杂交后代，传统的方法往往无法区分。以往在区分种苗时都是采用宏观遗传分析的生物学特性和形态特征指标，难以区分形态极为相似或亲缘关系极近的种苗，尤其是种内不同水平的良种更是无法识别，以致生产中出现混种、混系、混株，以假乱真的情况，其结果给生产带来了极大损失。因此，寻求从分子水平真正准确识别白蜡良种是极具现实意义的。在分子水平上对种质进行鉴定不受环境和生长阶段的影响，结果稳定，可靠性强。同时，使用的标记技术需要具有高度灵敏性，获得的标记需要具有个体特异性，目前，白蜡在分子水平上的研究极少，王健兵等进行了白蜡SSR-PCR反应体系优化及引物筛选(2014)，但关于白蜡SSR指纹图谱方面的实际应用及研究鲜见报道。
【发明内容】
[0004]针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种利用SSR指纹图谱鉴别白蜡种的方法。
[0005]本发明所述利用SSR指纹图谱鉴别白蜡种的方法，步骤包括:
[0006]1、白蜡总DNA提取:采用CTAB法提取白蜡总DNA ；
[0007]2、SSR序列PCR扩增:以步骤⑴提取的白蜡总DNA样品为模板，采用如下4对引物进行SSR-PCR扩增，
[0008]引物对1:上游:5 ‘TGTTCGGTTTCCTTGCTC’ 3
[0009]下游:5‘AAAGAGGGCTGCTGGAGT’ 3 ；
[0010]引物对2:上游:5 ‘ACTTGTAATGCTGGGAGG’ 3
[0011]下游:5‘AATTCCAGTGGTAGAGGC’ 3 ;
[0012]引物对3:上游:5 ‘TGGTGGAAACAAGATGGG’ 3 ；
[0013]下游:5‘CTCGGGACAGAATGGATG’ 3
[0014]引物对4:上游:5 ‘AGCAGCATTTATGAATGTTC’ 3
[0015]下游:5‘ATCAACTGAAGATGACGACG，3。
[0016]上述SSR-PCR 采用 1ul 反应体系:25mmol.F1Mg2+0.8 μ 1、10 μ mol.1-1 引物
0.2 μ IUOmmol.ΜΝΤΡΟ.3 μ 1、5U.μ F1Taq 酶 0.05 μ l、5_10ng.μ F1DNA 模板 2.00 μ I,10 X PCR 缓冲液 1.0 μ 1，ddH205.45 μ I ；
[0017]上述PCR反应条件为:94°C预变性3min，94°C变性lmin，54°C _58°C退火lmin，72°C延伸lmin，共35个循环；最后72°C延伸5延伸lmin，4°C 1min终止反应；
[0018]3、PCR扩增产物电泳及染色:采用6%聚丙烯酞胺凝胶电泳及银染显色，观察照相,记录电泳结果；
[0019]4、SSR指纹图谱结果分析及鉴定:采用统计电泳带型，构建供试材料SSR指纹图谱，进行白蜡种质鉴定。上述4对SSR引物组合构建的指纹图谱见表1。
[0020]表1:4对SSR引物组合构建的指纹图谱
[0021]
【权利要求】
1.一种利用SSR指纹图谱鉴别白蜡种的方法，步骤包括:(1)白蜡总DNA提取，(2) SSR序列PCR扩增，(3)PCR扩增产物电泳、染色及鉴定；其中:步骤⑴所述的白蜡总DNA提取，采用CTAB法，步骤(3)所述PCR扩增产物电泳采用6%聚丙烯酞胺凝胶电泳，染色采用银染法染色，鉴定采用统计电泳带型，构建供试材料SSR指纹图谱，进行白蜡种质鉴定； 其特征在于: 步骤⑵所述SSR序列PCR扩增是以步骤(1)提取的白蜡总DNA样品为模板，采用如下4对引物进行SSR-PCR扩增: 引物对 1:上游:5 ‘TGTTCGGTTTCCTTGCTC，3 下游:5 ‘AAAGAGGGCTGCTGGAGT’ 3 ； 引物对 2:上游:5 ‘ACTTGTAATGCTGGGAGG’ 3 下游:5 ‘AATTCCAGTGGTAGAGGC’ 3 ； 引物对 3:上游:5 ‘TGGTGGAAACAAGATGGG’ 3 ； 下游:5 ‘CTCGGGACAGAATGGATG’ 3 引物对 4:上游:5 ‘AGCAGCATTTATGAATGTTC’ 3
下游:5 ‘ATCAACTGAAGATGACGACG’ 3。
【文档编号】C12Q1/68GK104164503SQ201410380064
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年8月4日 优先权日:2014年8月4日
【发明者】燕丽萍, 李丽, 刘翠兰, 刘桂民, 王振猛, 夏阳 申请人:山东省林业科学研究院