乙醇高温高产工程菌株的构建及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及乙醇高温高产工程菌株的构建及应用，具体是通过基因工程的方法将粗糙脉孢霉(Neurospora?crassa)来源的木糖还原酶基因，树干毕赤酵母(Scheffersomyces?stipitis)的木糖醇脱氢酶突变基因，以及下游的一系列基因在耐热酵母马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces?marxianus)中高效表达或敲除，使该菌株通过木糖代谢路径在较高温度(>42℃)下，能够高效地利用和发酵木糖，大量快速生产乙醇。所述酵母菌株可以在42℃的条件下，快速高效利用高浓度木糖发酵生产乙醇,产量和发酵速率都超过已报道的耐热菌株。
【专利说明】乙醇高温高产工程菌株的构建及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】。尤其涉及通过工程菌株改造来提高高温下利用木糖发酵生产乙醇的【技术领域】。具体地，本发明构建了能够在高温条件下利用木糖发酵生产乙醇且乙醇生产速率和产量大幅度提高的耐热工程酵母菌株。
【背景技术】
[0002]木糖是半纤维素生物质水解的主要产物，是世界上第二富集的发酵原料(Zhanget al.，2011)。作为木质半纤维素水解产物中含量最多的五碳糖，木糖无疑是从可再生生物质中生产高附加值产品的关键(Sasaki et al.，2010)。
[0003]乙醇是醇类的一种，是酒的主要成份，所以也俗称酒精。乙醇的用途很广，可以用作溶剂，作为有机合成的原料，用于各种化合物的结晶，还可以作为洗涤剂和萃取剂，食用酒精可以勾兑白酒。乙醇在化工行业也有很重要的用途。生物乙醇最重要的用途是在能源领域。乙醇可以调入汽油，作为车用燃料，乙醇汽油也被称为(E型汽油)，它可以改善油品的性能和质量，降低一氧化碳、碳氢化合物等主要污染物排放。
[0004]采用耐热酵母马克思克鲁维酵母(K.marxianus)在高温下发酵有以下几个优点:
1.高温下发酵可以降低发酵中的冷却费用；2.纤维素酶等的最适催化温度较高，高温会提高以淀粉、纤维素等生物质为原料的同步糖化发酵(SSF)效率，促进糖化，减少在酶上的费用(Fonseca et al., 2008 ；Zhang et al., 2013) ；3.能在耐热范围内生存的微生物较少，因此，高温会降低污染的风险(Kumar et al., 2009 ；Zhang et al.，2013)。除此之外，马克思克鲁维酵母是一种GRAS (general regarding as safe)酵母,广泛的在乳制品、葡萄酒发酵制造中存在，对环境、动物及人类是安全的微生物。它能够在较高的温度下生长，最高达52°C，具有很高的生长速率(0.86 - 0.99h-1，40°C ) (Banat and Marchant, 1995)。马克思克鲁维酵母有很高的代谢多样性，能利用多种工业上的底物糖类生长发酵。能利用多种廉价底物、耐热、高生长率等特点，使其被认为是替代酿酒酵母用来进行工业发酵和外源蛋白表达的候选者。由于马克思克鲁维酵母有很多比酿酒酵母优秀的品质，马克思克鲁维酵母被越来越多的用于生物能源的生产(Fonseca et al.，2008)。所以利用马克思克鲁维酵母发展成乙醇生产菌株具有非常重要的应用价值。
[0005] 已经有一些关于利用耐热酵母发酵木糖生产乙醇的研究，其中，Rodrussamee等利用马克思克鲁维酵母可以在40 °C利用木糖生产2.2g/的乙醇(Rodrussamee etal.，2011)。Zhang等利用树干毕赤酵母的木糖还原酶突变体替换马克思克鲁维酵母的木糖还原酶，可以利用40g/L的木糖在42°C生产4.51g/L的乙醇(Zhang et al.，2013)。Wang等构建木糖异构酶途径代替马克思克鲁维酵母本身的XYL1-XYL2系统，可以利用50g/L的木糖在 42°C 生产 11.52g/L 的乙醇(Wang et al.，2013)。Kumar 等利用 Kluyveromycessp.1IPE453 发酵木糖在 50°C产生 1.75g/L 乙醇(Kumar et al., 2009)。Goshima 等利用基因工程改造的马克思克鲁维酵母DMB3-7可以在42°C发酵木糖产生4.9g/L乙醇，在45°C产生3.3g/L乙醇(Goshima et al.，2013)。而Dmytruk等利用木糖异构酶途径改造的另一种酵母Hansenula polymorpha可以在48°C发酵木糖产生1.31g/L乙醇(Dmytruk etal., 2008)。Ismail等构建了一株比较耐热的利用基因工程菌Saccharomyces cerevisiaesun049T可以在38°C发酵木糖产生15.2g/L乙醇(Ismail et al.，2013)。以上的这些研究还没有充分发挥耐热酵母在高温下发酵木糖生产乙醇的潜力，他们利用木糖发酵的速率、产量以及利用木糖的能力都还远远不够(表1)。我们的此发明申请中的NcXYLl-PsXYL2的ARS突变基因组合结合增加的木酮糖激酶基因(KmXYL3)的表达大幅度提高了耐热酵母在高温下发酵木糖生产乙醇，结合产生木酮糖之后的下游代谢工程改造进一步提高了木糖发酵的能力，产量和发酵速率都远超已有的菌株，证明本发明构建的方法和构建的菌株在生物质转化乙醇工业上有很巨大的应用前景。
【发明内容】
[0006]本发明通过在耐热酵母中高效表达粗糙脉孢霉的木糖还原酶基因，树干毕赤酵母的木糖醇脱氢酶突变基因，以及下游的KmXYL3，KmADH2, KmPDCl，KmTALl，KmTKLl，KmRPEI,KmRKIl, KmGLNl基因的过表达和KmGPDl基因的敲除，构建了在较高温度(>42°C )下能够利用和发酵木糖的高效生产乙醇的耐热酵母马克思克鲁维酵母菌株；本发明对马克思克鲁维酵母中的木糖还原酶基因(XYLl)和木糖醇脱氢酶基因(XYL2)进行双敲除，构建工程菌株，再将粗糙脉孢霉的木糖还原酶基因，树干毕赤酵母的木糖醇脱氢酶突变基因，以及下游的一系列基因在上述基因敲除的耐热酵母中表达或敲除，构建了对利用木糖生产乙醇的能力大幅度改良，能够在较高温度下利用木糖大量生产乙醇的耐热工程酵母菌株。构建过程见图1。
[0007]具体的，本发明涉及以下各项:
[0008]1.一种乙醇高温高产工程菌株，其特征在于所述工程菌株通过在双敲除木糖还原酶基因KmXYLl和木糖醇脱氢酶基因KmXYL2的马克思克鲁维酵母(K.marxianus)中重组入粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)的木糖还原酶基因NcXYLl和树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis)的木糖醇脱氢酶突变基因PsXYL2_ARS，以及马克思克鲁维酵母的木酮糖激酶基因KmXYL3而获得，其中所述树干毕赤酵母木糖醇脱氢酶突变基因PsXYL2-ARS为在野生型树干毕赤酵母木糖醇脱氢酶基因的基础上具有D207A/I208R/F209S突变。
[0009]2.根据I所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于所述菌株含有两个拷贝的所述树干毕赤酵母木糖醇脱氢酶突变基因PsXYL2-ARS。
[0010]3.根据2所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于在所述菌株中进一步转入马克思克鲁维酵母的乙醇脱氢酶基因KmADH2和马克思克鲁维酵母的丙酮酸脱羧酶基因KmPDCl。
[0011]4.根据3所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于在所述菌株中进一步转入马克思克鲁维酵母的转醛酶基因KmTALl和马克思克鲁维酵母的转酮酶基因KmTKLl。
[0012]5.根据4所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于在所述菌株中进一步转入马克思克鲁维酵母的L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶基因KmRPEl。
[0013]6.根据5所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于在所述菌株中进一步转入包括马克思克鲁维酵母的核糖-5-磷酸酮醇异构酶基因KmRKIl。
[0014]7.根据6所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于在所述菌株中敲除马克思克鲁维酵母的甘油-3磷酸脱氢酶基因KmGPDl。
[0015]8.根据7所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于在所述菌株中进一步转入马克思克鲁维酵母的谷氨酰胺合成酶基因KmGLNl。
[0016]9.一种乙醇高温高产工程菌株YZJ088，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.9387。
[0017]10.1-9任一项所述的乙醇高温高产工程菌株用于发酵木糖生产乙醇的用途。
[0018]本发明获得的最优选的木糖发酵产生木糖醇的应用菌株为马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus YZJ088。此菌株可直接利用木糖发酵生产乙醇,此菌株可以在高温条件下利用高木糖浓度高产乙醇。该菌株已于2014年06月26日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮编:100101)，保藏号为CGMCC N0.9387 (YZJ088菌株)。
[0019]本发明中采用一种新的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶组合结合木酮糖激酶基因(KmXYL3)的过表达使得K.marxianus工程菌在42°C利用木糖发酵的能力大幅度提高；进一步对下游基因进行工程改造后所得到的菌株YZJ088在高温条件下，可以很好的利用木糖生产乙醇，有着比野生型耐热菌株更强的利用木糖生产乙醇的能力。而酿酒酵母等在这个温度下，已经不能正常生长和发酵。
[0020]本发明中将粗糙脉孢霉的XYLl和树干毕赤酵母的XYL2的ARS突变体进行组合结合木酮糖激酶基因(KmXYL 3)的过表达，这种组合使得构建的工程菌在42°C利用100g/l木糖，乙醇产量达25.48g/L，生产速率为1.42g/L/h。本发明的YZJ088菌株，在42°C条件下，能在18h利用100g/L木糖生产35.94g/L乙醇，生产速率高达2.00g/L/h,产率为0.38g/g。与目前现有的耐热酵母利用木糖生产乙醇的最好水平相比，本发明的YZJ088菌株不仅在较高温度(>42°C )条件下有利用木糖生产乙醇的能力，而且比现有的耐热酵母生产乙醇的产量(11.52g/L, (Wang et al., 2013))高，速率(0.llg/L/h, (Zhang et al., 2013))快(表 I)。
[0021]表1:已发表的不同菌株和本专利中的菌株在利用木糖和生产乙醇效率的比较
[0022]
【权利要求】
1.一种乙醇高温高产工程菌株，其特征在于所述工程菌株通过在双敲除木糖还原酶基因KmXYLl和木糖醇脱氢酶基因KmXYL2的马克思克鲁维酵母(K.marxianus)中重组入粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)的木糖还原酶基因NcXYLl和树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis)的木糖醇脱氢酶突变基因PsXYL2_ARS，以及马克思克鲁维酵母的木酮糖激酶基因KmXYL3而获得，其中所述树干毕赤酵母木糖醇脱氢酶突变基因PsXYL2-ARS为在野生型树干毕赤酵母木糖醇脱氢酶基因的基础上具有D207A/I208R/F209S突变。
2.根据权利要求1所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于所述菌株含有两个拷贝的所述树干毕赤酵母木糖醇脱氢酶突变基因PsXYL2-ARS。
3.根据权利要求2所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于在所述菌株中进一步转入马克思克鲁维酵母的乙醇脱氢酶基因KmADH2和马克思克鲁维酵母的丙酮酸脱羧酶基因KmPDCl0
4.根据权利要求3所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于在所述菌株中进一步转入马克思克鲁维酵母的转醛酶基因KmTALl和马克思克鲁维酵母的转酮酶基因KmTKLl。
5.根据权利要求4所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于在所述菌株中进一步转入马克思克鲁维酵母的L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶基因KmRPEl。
6.根据权利要求5所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于在所述菌株中进一步转入马克思克鲁维酵母的核糖-5-磷酸酮醇异构酶基因KmRKIl。
7.根据权利要求6所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于在所述菌株中敲除马克思克鲁维酵母的甘油-3磷酸脱氢酶基因KmGPDl。
8.根据权利要求7所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于在所述菌株中进一步转入马克思克鲁维酵母的谷氨酰胺合成酶基因KmGLNl。
9.一种乙醇高温高产工程菌株YZJ088，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.9387。
10.权利要求1-9任一项所述的乙醇高温高产工程菌株用于发酵木糖生产乙醇的用途。
【文档编号】C12R1/645GK104164375SQ201410380023
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年8月4日 优先权日:2014年8月4日
【发明者】洪泂, 张佳, 张标 申请人:中国科学技术大学