一种禽流感病毒增殖方法及利用该方法制备的禽流感疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种禽流感病毒增殖方法及利用该方法制备的禽流感疫苗。本发明主要利用鸡胚无限稀释法对流感病毒进行纯化，提高了病毒的增殖能力和毒液滴度，制备的病毒含量可以高达IO^^EIDjo/O.lmL?lCT9.5EID50/0.lmL;培养流感病毒时稀释倍数有所提高，提高了病毒的增殖活力，并且节约了病毒培养时间；以本发明方法培养的流感病毒无需浓缩，无需浓缩或稀释后制备成品疫苗，简化了后续疫苗生产工艺、降低生产成本；利用本发明制备的流感病毒灭活疫苗，免疫鸡群后能够较快的产生抗体，并且抗体持续期长，疫苗的保护率有所提高。
【专利说明】一种禽流感病毒增殖方法及利用该方法制备的禽流感疫苗
【技术领域】
[0001] 本发明涉及兽用疫苗【技术领域】，具体涉及一种禽流感病毒增殖方法及利用该方法 制备的禽流感疫苗。
【背景技术】
[0002] 禽流感（Avian Influenza)是由正粘病毒科甲型流感病毒引起的一种禽类烈性传 染病，被国际兽疫局定为I类传染病。根据毒株致病性的不同，禽流感可分为高致病性禽流 感和低致病性禽流感两大类。H9亚型禽流感属于低致病性禽流感，产蛋家禽感染后，可引 起产蛋率下降，软壳蛋、无壳蛋增多，严重的将会停止产蛋。种禽感染后，除上述症状外，还 表现出受精率下降，孵化初期死胚增多，孵化后期雏禽出壳困难，出壳后的雏禽弱雏增多。 雏禽在一周内死亡率较高，且易感染大肠杆菌，治疗较困难。H9亚型禽流感混合感染其他病 原时，可导致发病率和死亡率的大幅度提高，给养殖业带来巨大损失。
[0003] 疫苗接种是预防和控制流感病毒流行的最有效手段。目前，控制禽流感病毒发病 的主要手段是接种灭活全病毒疫苗，其生产主要依靠鸡胚法实现。为了提高灭活疫苗的免 疫原性，必须提高疫苗制备时抗原的含量，故如何提高病毒滴度成为关键环节。现在，提高 流感病毒含量的方法主要通过浓缩的方法实现，这样将提高疫苗制备的成本，使疫苗制备 过程复杂化，并且增加了病毒液的损失和污染风险。
【发明内容】
[0004] 为克服现有技术的技术缺陷，本发明提供一种禽流感病毒增殖方法及利用该方法 制备的禽流感疫苗，旨在节约疫苗制备成本，提升生产效率。
[0005] 为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
[0006] 一种禽流感病毒增殖方法，包括以下步骤：
[0007] 1)对禽流感病毒进行复苏处理；
[0008] 2)将步骤1)复苏处理完毕的病毒液进行梯度稀释，以各稀释度病毒液接种鸡胚， 再取全部受感染鸡胚尿囊液中其HA效价排名处于前10%或前20%的尿囊液作为种子批；
[0009] 3)将步骤2)得到的种子批分别接种鸡胚并传代6?10代，将各代次受感染鸡胚 尿囊液中EID 5tl指标彡1(T9_°EID5(i/0. ImL的种子批作为基础种子批；
[0010] 4)将步骤3)得到的基础种子批接种鸡胚，增殖禽流感病毒。
[0011] 优选的，步骤1)所述的复苏处理包括以下流程：取出冻存的禽流感病毒，进行 KT3?KT 4稀释，接种10日龄SPF鸡胚，36. 5?37. 5°C培养，收获24?96h死亡胚和96h 活胚尿囊液，传2?3代，收获24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液即为复苏处理完毕的病 毒液。
[0012] 优选的，步骤2)具体包括以下流程：将步骤1)复苏处理完毕的病毒液进行10倍 系列稀释，分别取稀释度为10'10'10'Kr'KT 11的病毒液接种鸡胚，每个稀释度接种 若干鸡胚，接种量为0. 08?0. 12mL，36. 5?37. 5°C孵育，分别收集接种后24-96h死亡胚和 96h未死鸡胚尿囊液，测定HA效价并以HA效价> (1:256)认定为鸡胚已感染病毒，在已感 染病毒的鸡胚尿囊液中选取由最大稀释倍数病毒液接种鸡胚得到的尿囊液1?2例作为后 续传代用病毒液，以此重复上述稀释、筛选步骤3?5代，每代、每例尿囊液分别保存，将其 中HA效价排名处于前10%或前20%的尿囊液作为种子批；
[0013] 优选的，步骤3)具体包括以下流程：将步骤2)得到的种子批进行KT3?KT 4稀 释，接种10日龄SPF鸡胚，36. 5?37. 5°C培养，收获24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液，再 传6?10代，收获24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液从中筛选病毒含量彡l〇- 9_°EID5Q/0. ImL 的尿囊液作为基础种子批。
[0014] 优选的，步骤4)具体包括以下流程：将步骤3)得到的基础种子批进行KT3-KT 6稀 释，接种鸡胚，收获24?96h鸡胚尿囊液即为病毒液；进一步的，可以优选为以下流程：将 步骤3)得到的基础种子批进行KT 4-KT5稀释，接种鸡胚，收获65?75h鸡胚尿囊液即为病 毒液。
[0015] 优选的，步骤1)所述的禽流感病毒为H9亚型禽流感病毒。
[0016] 优选的，步骤1)所述的禽流感病毒含量为l〇-8_°EID5Q/0. ImL?l〇-8 5EID5Q/0. lmL。
[0017] 优选的，步骤1)所述的禽流感病毒含量为1(T8_3EID 5tlA). lmL。
[0018] 此外，本发明还提供了利用上述禽流感病毒增殖方法进一步制备的禽流感疫苗， 该疫苗由以下方法制备：
[0019] 1)病毒的灭活：将利用上述禽流感病毒增殖方法制备的禽流感病毒液用甲醛灭 活，甲醛终浓度为1%。，20°C灭活20小时得到灭活毒液；
[0020] 2)水相的制备：水相的制备：将灭活毒液以3500r/min离心20min，经8层纱布过 滤，将过滤后的灭活毒液与吐温80以（22?26) : 1的比例混匀，即得到疫苗水相；
[0021] 3)油相的制备：取白油佐剂95份、司班805份、硬脂酸铝2份混勻，即得到疫苗油 相；
[0022] 4)疫苗的乳化：取4份水相慢慢的加入到6份油相，以12000r/min转速剪切 2-5min，即得到禽流感疫苗。
[0023] 优选的，所述白油佐剂型号为Marc〇152。
[0024] 本发明技术方案具有以下优点：本发明主要利用鸡胚无限稀释法对流感病毒进行 纯化，提高了病毒的增殖能力和毒液滴度，制备的病毒含量可以高达KT 91EID5ciA). ImL? KT9 5EID5tlA). ImL ;培养流感病毒时稀释倍数有所提高，提高了病毒的增殖活力，并且节约 了病毒培养时间；以本发明方法培养的流感病毒无需浓缩，无需浓缩或稀释后制备成品疫 苗，简化了后续疫苗生产工艺、降低生产成本；利用本发明制备的流感病毒灭活疫苗，免疫 鸡群后能够较快的产生抗体，并且抗体持续期长，疫苗的保护率有所提高。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1是本发明实施例2制备的疫苗接种后产生的抗体水平对比图。
【具体实施方式】
[0026] 实施例1
[0027] -种禽流感病毒增殖方法，包括以下步骤：
[0028] 1)取出冻存的禽流感病毒，进行KT3稀释，接种10日龄SPF鸡胚，37°C培养，收获 24-96h鸡胚尿囊液，传3代，收获24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液即为复苏处理完毕的 病毒液。
[0029] 2)将步骤1)复苏处理完毕的病毒液进行10倍系列稀释，分别取稀释度为10' 10' 10' KT' 10_n的病毒液接种鸡胚，每个稀释度接5枚鸡胚，接种量为0. lmL，36. 5? 37. 5°C孵育，分别收集接种后24-96h死亡胚和96h未死鸡胚尿囊液，测定HA效价并以HA效 价> (1:256)认定为鸡胚已感染病毒，在已感染病毒的鸡胚尿囊液中选取由最大稀释倍数 病毒液接种鸡胚得到的尿囊液2例作为后续传代用病毒液，以此重复上述稀释、筛选步骤5 代，每代、每例尿囊液分别保存，将其中HA效价排名处于前10%的尿囊液作为种子批；
[0030] 3)将步骤2)得到的种子批进行KT3?KT4稀释，接种10日龄SPF鸡胚，37°C培 养，收获24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液，再传8代，收获24?96h死亡胚和96h活胚尿 囊液从中筛选病毒含量> l〇_9_°EID5(l/0. ImL的尿囊液作为基础种子批，在传代过程中发现， 随代次的变化其尿囊液中病毒含量的变化为Pl =KT8 9EID5tlA). lmL，P2 :l〇-91EID5Q/0. lmL， P3 : KT9.3EID50A). lmL，P4 : KT9.5EID50A). lmL，P5 :1(T9.3EID50A). lmL，P6 : KT9.3EID50A). lmL， P7 : KT8. 7EID5(i/0. lmL，P8 : KT8. 3EID5(i/0. lmL。
[0031] 4)分别将基础种子批进行10'10'10'KT6稀释并分别接种鸡胚，并考察各稀释 倍数的种子批接种鸡胚后24-96h收获鸡胚尿囊液时的病毒含量。结果证明将毒种进行KT 4 稀释、接种后70h收获得到的尿囊液病毒含量最高，达到I(T9 5EID5tlA). lmL。
[0032] 实施例2
[0033] 一种禽流感病毒增殖方法，包括以下步骤：
[0034] 1)取出冻存的禽流感病毒，进行10_4稀释，接种10日龄SPF鸡胚，36. 5°C培养，收 获24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液，传2代，收获24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液即 为复苏处理完毕的病毒液。
[0035] 2)将步骤1)复苏处理完毕的病毒液进行10倍系列稀释，分别取稀释度为10' 10' 10' KT' 10_n的病毒液接种鸡胚，每个稀释度接10枚鸡胚，接种量为0. 08mL，36. 5°C 孵育，分别收集接种后24-96h死亡胚和96h未死鸡胚尿囊液，测定HA效价并以HA效价 > (1:256)认定为鸡胚已感染病毒，在已感染病毒的鸡胚尿囊液中选取由最大稀释倍数病 毒液接种鸡胚得到的尿囊液1例作为后续传代用病毒液，以此重复上述稀释、筛选步骤4 代，每代、每例尿囊液分别保存，将其中HA效价排名处于前20%的尿囊液作为种子批；
[0036] 3)将步骤2)得到的种子批进行KT3?KT4稀释，接种10日龄SPF鸡胚，37. 5°C 培养，收获24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液，再传10代，收获24?96h死亡胚和96h活 胚尿囊液从中筛选病毒含量> l〇_9_°EID5(l/0. ImL的尿囊液作为基础种子批。
[0037] 4)将基础种子批进行KT5稀释而后接种鸡胚，接种后65h收获被接种鸡胚的尿囊 液，即得到禽流感病毒。
[0038] 实施例3
[0039] 一种禽流感病毒增殖方法，包括以下步骤：
[0040] 1)取出冻存的禽流感病毒，进行KT4稀释，接种10日龄SPF鸡胚，37. 5°C培养，收 获24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液，传3代，收获24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液即 为复苏处理完毕的病毒液。
[0041] 2)将步骤1)复苏处理完毕的病毒液进行10倍系列稀释，分别取稀释度为10' 10' 10' KT' 10_n的病毒液接种鸡胚，每个稀释度接15枚鸡胚，接种量为0. 12mL，37. 5°C 孵育，分别收集接种后24-96h死亡胚和96h未死鸡胚尿囊液，测定HA效价并以HA效价 > (1:256)认定为鸡胚已感染病毒，在已感染病毒的鸡胚尿囊液中选取由最大稀释倍数病 毒液接种鸡胚得到的尿囊液1例作为后续传代用病毒液，以此重复上述稀释、筛选步骤3 代，每代、每例尿囊液分别保存，将其中HA效价排名处于前20%的尿囊液作为种子批；
[0042] 3)将步骤2)得到的种子批进行KT3?KT4稀释，接种10日龄SPF鸡胚，36. 5°C 培养，收获24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液，再传6代，收获24?96h死亡胚和96h活 胚尿囊液从中筛选病毒含量> l〇_9_°EID5(l/0. ImL的尿囊液作为基础种子批。
[0043] 4)将基础种子批进行KT4 5稀释而后接种鸡胚，接种后75h收获被接种鸡胚的尿 囊液，即得到禽流感病毒。
[0044] 实施例4
[0045] 取实施例1制备的禽流感病毒进行如下工艺，以制备禽流感疫苗：
[0046] 4. 1病毒的灭活
[0047] 将上述的病毒液进行灭活，甲醛终浓度为1%。，20°C灭活20小时。灭活检验证明毒 液灭活完全。
[0048] 4. 2疫苗的制备
[0049] 水相的制备：将灭活的毒液以3500r/min离心20min，经8层纱布过滤。取96份 灭活的毒液，4份吐温80混匀。该水相包括4种毒液，即克隆法获得的高滴度毒液（病毒含 量为1(T9_ 3EID5tlA). ImL)、克隆法获得毒液的稀释液（病毒含量为1(T8_ 3EID5tlA). ImL) HSy 株禽流感病毒繁殖毒液（病毒含量为1(T8_3EID5(i/0. lmL)、Sy株禽流感病毒浓缩毒液（病毒 含量为 ΚΓ9· 3EID5tlA). ImL)。
[0050] 油相的制备：进口白油95份，司班805份，硬脂酸铝2份。
[0051] 疫苗的乳化：取4份水相慢慢的加入到6份油相，12000r/min剪切2-5min即可。
[0052] 4. 3疫苗的质量检测
[0053] 疫苗的剂型、稳定性和粘度检测均证明制备的疫苗合格。
[0054] 4. 4疫苗的安全性检验
[0055] 取上述制得的4种疫苗进行如下检验：
[0056] 将疫苗分别进行1次超剂量（ImL)和单剂量重复接种（0. 3mLX2)的安全试验。观 察14天，试验鸡均无任何局部和全身不良反应，疫苗安全性良好。
[0057] 4. 5疫苗的效力检验
[0058] 4. 5. 1血清学方法
[0059] 取3-4周龄SPF鸡接种疫苗，第1组注射原始Sy株禽流感病毒繁殖毒液制备的疫 苗，第2组注射克隆法获得毒液的稀释液制备的疫苗，第3组注射克隆法获得的高滴度毒液 制备的疫苗，第4组注射Sy株禽流感病毒浓缩毒液制备的疫苗，第5组注射磷酸盐缓冲液 作为对照，同样条件下饲养，实验条件见表1，免疫后每周采集血清，直至免疫后第8周，按 照《中华人民共和国兽药典》规定的血凝抑制试验（HI)方法对特异性抗体进行检测。
[0060] 表1不同组疫苗免疫剂量及分组
[0061]
【权利要求】
1. 一种禽流感病毒增殖方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 对禽流感病毒进行复苏处理； 2) 将步骤1)复苏处理完毕的病毒液进行梯度稀释，以各稀释度病毒液接种鸡胚，再取 全部受感染鸡胚尿囊液中其HA效价排名处于前10%或前20%的尿囊液作为种子批； 3) 将步骤2)得到的种子批分别接种鸡胚并传代6?10代，将各代次受感染鸡胚尿囊 液中EID5tl指标彡1(T 9_°EID5(i/0. ImL的种子批作为基础种子批； 4) 将步骤3)得到的基础种子批接种鸡胚，增殖禽流感病毒。
2. 根据权利要求1所述的一种禽流感病毒增殖方法，其特征在于步骤1)所述的复苏 处理包括以下流程：取出冻存的禽流感病毒，进行1〇_ 3?1〇_4稀释，接种10日龄SPF鸡胚， 36. 5?37. 5°C培养，收获24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液，传2?3代，收获24?96h 死亡胚和96h活胚尿囊液即为复苏处理完毕的病毒液。
3. 根据权利要求1所述的一种禽流感病毒增殖方法，其特征在于步骤2)具体包括以 下流程：将步骤1)复苏处理完毕的病毒液进行10倍系列稀释，分别取稀释度为1〇_ 7、1〇_8、 10_9、ΙΟ-1'10- 11的病毒液接种鸡胚，每个稀释度接种若干鸡胚，接种量为0· 08?0· 12mL， 36. 5?37. 5°C孵育，分别收集接种后24-96h死亡胚和96h未死鸡胚尿囊液，测定HA效价并 以HA效价> (1:256)认定为鸡胚已感染病毒，在已感染病毒的鸡胚尿囊液中选取由最大稀 释倍数病毒液接种鸡胚得到的尿囊液1?2例作为后续传代用病毒液，以此重复上述稀释、 筛选步骤3?5代，每代、每例尿囊液分别保存，将其中HA效价排名处于前10%或前20% 的尿囊液作为种子批。
4. 根据权利要求1所述的一种禽流感病毒增殖方法，其特征在于步骤3)具体包括以下 流程：将步骤2)得到的种子批进行KT3?KT 4稀释，接种10日龄SPF鸡胚，36. 5?37. 5°C 培养，收获24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液，再传6?10代，收获24?96h死亡胚和 96h活胚尿囊液从中筛选病毒含量> 1(T9_°EID5(i/0. ImL的尿囊液作为基础种子批。
5. 根据权利要求1所述的一种禽流感病毒增殖方法，其特征在于步骤4)具体包括以下 流程：将步骤3)得到的基础种子批进行KT 3-KT6稀释，接种鸡胚，收获24?96h鸡胚尿囊 液即为病毒液。
6. 根据权利要求1所述的一种禽流感病毒增殖方法，其特征在于步骤1)所述的禽流感 病毒为H9亚型禽流感病毒。
7. 根据权利要求1所述的一种禽流感病毒增殖方法，其特征在于步骤1)所述的禽流感 病毒含量为 1(T8_〇EID5(i/0. ImL ?ΚΓ8· 5EID5tlA). lmL。
8. 根据权利要求5所述的一种禽流感病毒增殖方法，其特征在于步骤4)具体包括以下 流程：将步骤3)得到的基础种子批进行KT 4-KT5稀释，接种鸡胚，收获65?75h鸡胚尿囊 液即为病毒液。
9. 一种禽流感疫苗，其特征在于由以下方法制备： 1) 病毒的灭活：将利用权利要求1方法制备的禽流感病毒液用甲醛灭活，甲醛终浓度 为1%〇,20°C灭活20小时得到灭活毒液； 2) 水相的制备：水相的制备：将灭活毒液以3500r/min离心20min，经8层纱布过滤，将 过滤后的灭活毒液与吐温80以（22?26) : 1的比例混匀，即得到疫苗水相； 3) 油相的制备：取白油佐剂95份、司班80 5份、硬脂酸铝2份混勻，即得到疫苗油相； 4)疫苗的乳化：取4份水相慢慢的加入到6份油相，以12000r/min转速剪切2-5min， 即得到禽流感疫苗。
10.根据权利要求9所述的一种禽流感疫苗，其特征在于所述白油佐剂型号为 Marcol52〇
【文档编号】C12N7/00GK104212771SQ201410449666
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月4日 优先权日:2014年9月4日
【发明者】张立霞, 李亚杰, 郁宏伟, 刘涛, 杨保收, 盛长忠, 梁武 申请人:天津瑞普生物技术股份有限公司