一种豇豆花叶病毒属病毒广谱检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种豇豆花叶病毒属病毒广谱检测试剂盒及其检测方法。本发明所提供的豇豆花叶病毒属病毒广谱检测试剂盒中含有由一条反转录引物和四条扩增引物组成的引物组；所述反转录引物为序列表中序列1所示的单链DNA;所述四条扩增引物为序列表中序列2、序列3、序列4和序列5所示的四条单链DNA。实验证明，本发明所提供的用于检测豇豆花叶病毒属病毒的引物组及其试剂盒具有广谱性好、灵敏度高、特异性强、检测周期短等特点，适用于进出境口岸及农业生产上豇豆花叶病毒属病毒的快速检测与监测。
【专利说明】一种豇豆花叶病毒属病毒广谱检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物检疫【技术领域】，涉及一种豇豆花叶病毒属病毒广谱检测试剂盒及 其检测方法，特别涉及用于检测豇豆花叶病毒属病毒的引物组、试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] Slii花叶病毒属（Comovirus)是类小 RNA 病毒目（Picornavirales)、伴生Slii病 毒科（Secoviridae)中的八个病毒属之一，与蚕豆病毒属（Fabavirus)、线虫传多面体病毒 属（Nepovirus)组成紅豆花叶病毒亚科（Comovirinae),共有15种病毒成员、1种暂定种。 该类病毒的寄主范围较窄，已发现的15种豇豆花叶病毒属病毒中，有11种病毒仅侵染豆科 植物，如大豆、豇豆、蚕豆等；有3种病毒分别危害茄科、十字花科、葫芦科等植物；其余2种 分别危害红三叶草、块根落葵。花叶和斑驳是该属病毒为害的主要症状特征，通常不产生环 斑。该类病毒可以通过甲虫介体传播，尤其是金花虫科的一些种类，甲虫保毒能力达数日至 数周。另外，菜豆荚斑驳病毒（BPMV)、蚕豆染色病毒（BBSV)、蚕豆真花叶病毒（BBTMV)、豇 豆花叶病毒（CPMV)、豇豆重花叶病毒（CPSMV)、豌豆轻型花叶病毒（PmiMV)、南瓜花叶病毒 (SqMV)等7种病毒种类还可通过种子传播。
[0003] 该类病毒中的多种病毒成员具有十分重要的经济重要性，对农业生产安全和生态 安全造成巨大的威胁。豇豆花叶病毒属病毒的许多成员具有重大检疫重要性，多种病毒被 世界各国列为禁止进境的检疫性有害生物。其中，安第斯马铃薯斑驳病毒（APMoV)被欧洲 与地中海植物保护组织（EPPO)、加拿大、乌克兰等国家或地区列为检疫性有害生物；菜豆 荚斑驳病毒（BPMV)被我国（包括台湾地区）等国家或地区列为禁止进境的检疫性有害生 物；菜豆粗缩花叶病毒（BRMV)被台湾地区列为禁止进境的检疫性有害生物；蚕豆染色病毒 (BBSV)被我国（包括台湾地区）等国家或地区列为禁止进境的检疫性有害生物；蚕豆真花 叶病毒（BBTMV)被摩洛哥、台湾等国家或地区列为禁止进境的检疫性有害生物；豇豆花叶 病毒（CPMV)被台湾地区等列为禁止进境的检疫性有害生物；豇豆重型花叶病毒（CPSMV)被 我国（包括台湾地区）等国家或地区列为禁止进境的检疫性有害生物；被台湾地区列为禁 止进境的检疫性有害生物还有大豆属花叶病毒（GMV)、豌豆轻型花叶病毒（PMiMV)JXSW 草斑驳病毒（RCMV)、南瓜花叶病毒（SqMV)、块根落葵C病毒（UVC)。
[0004] 目前，在植物病毒日常检测中，普遍采用血清学和分子生物学方法，特别是ELISA 和RT-PCR方法。ELISA检测需要特异的抗体，通常都是需要由专业的试剂公司制备和提供， 并且国内外检测试剂公司提供的ELISA检测试剂种类十分有限。据不完全统计，国内外各 试剂公司提供的豇豆花叶病毒属病毒抗体共有11种，但并不是常年供应，有些病毒种类会 出现缺货现象。RT-PCR方法是植物病毒检测中使用非常广泛的另外一种特异性检测方法。 目前，世界各国密切关注的只有BPMV、CPMV、CPSMV、SqMV等几种豇豆花叶病毒属病毒，建立 了这些病毒的特异性RT-PCR。因此，多数的豇豆花叶病毒属病毒种类没有相应的血清学，特 别是分子检测方法。
[0005] 基于简并引物的通用RT-PCR检测方法由于在一次实验中可以检测不同种类 的病毒（属于同一个属或同一个科的病毒），是一种广谱的检测方法，已越来越广泛应 用于植物病毒的检测鉴定中。豇豆花叶病毒属所在的伴生豇豆病毒科中，主要是针对 线虫传多面体病毒属（Nepovirus)病毒开展通用性检测。最早是Wetzel等（Wetzel T,Jardak R, Meunier L, et al.Simultaneous RT/PCR detection and differentiation of arabis mosaic and grapevine fanleaf nepoviruses in grapevines with a single pair of primers[J]. Journal of virological methods, 2002, 101(I):63-69.) 报道了用I对引物用于同时检测南芥菜花叶病毒（ArMV)和葡萄扇叶病毒（GFLV)、随后 Digiaro 等人（Digiaro M, Elbeaino T, Martelli G P. Development of degenerate and species-specific primers for the differential and simultaneous RT-PCR detection of grapevine-infecting nepoviruses of subgroups A, B and C[J]. Journal of virological methods, 2007, 141(1) :34-40.)建立用于检测及区分葡萄上线虫传多面体病 毒属不同亚组病毒的通用 RT-PCR 方法、而 Wei&Clover(Wei T, Clover G. Use of primers with 5' non-complementary sequences in RT-PCR for the detection of nepovirus subgroups A and B[J]. Journal of virological methods, 2008, 153(I):16-21.)则 建立了线虫传多面体病毒中亚组A和亚组B的通用RT-PCR方法。Ferrer等（Ferrer R M, Luis-Arteaga M, Guerri J, et al. Detection and identification of species of the genus Fabavirus by RT - PCR with a single pair of primers[J]. Journal of virological methods, 2007, 144(I):156-160.)、Panno 等（Panno S, Ferriol I, Rangel E A,et al. Detection and identification of Fabavirus species by one-step RT-PCR and multiplex RT_PCR[J]. Journal of virological methods, 2014, 197:77-82.)分别建立香 豆病毒属（Fabavirus)的通用RT-PCR检测方法。目前，还没有针对豇豆花叶病毒属的广谱 性分子检测方法，也没有专门用于豇豆花叶病毒属病毒广谱的检测试剂盒。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供一种可用于广谱检测豇豆花叶病毒属病毒的引物组。
[0007] 本发明所提供的用于检测豇豆花叶病毒属病毒的引物组，为引物组A或引物组B。
[0008] 所述引物组A具体由一条反转录引物和四条扩增引物组成；所述反转录引物为序 列表中序列1所示的单链DNA ;所述四条扩增引物为序列表中序列2、序列3、序列4和序列 5所示的四条单链DNA ;
[0009] 所述引物组B具体由四条扩增引物组成；所述四条扩增引物为序列表中序列2、序 列3、序列4和序列5所示的四条单链DNA。
[0010] 其中，序列1由18个核苷酸组成；序列2由40个核苷酸组成；序列3由42个核苷 酸组成；序列4由17个核苷酸组成；序列5由15个核苷酸组成。
[0011] 在所述引物组A中，既可以"各引物分别单独包装"，也可以"将所述反转录引物单 独包装于包装A中，将所述四条扩增引物一同包装于包装B中"。如果是前者，可为各引物 的配比可为任意比，如20:1:1:10:10。如果是后者，所述包装B中，所述四条扩增引物的摩 尔比为：序列表中序列2所示的单链DNA :序列表中序列3所示的单链DNA :序列表中序 列4所示的单链DNA :序列表中序列5所示的单链DNA具体为I : I : 10 : 10。
[0012] 在所述引物组B中，既可以各引物分别单独包装，也可以混合包装。如果是前者， 可为各引物的配比可为任意比，如1 : 1 : 10 : 10。如果是后者，所述四条扩增引物的摩 尔比为：序列表中序列2所示的单链DNA :序列表中序列3所示的单链DNA :序列表中序 列4所示的单链DNA :序列表中序列5所示的单链DNA具体为I : I : 10 : 10。
[0013] 本发明的第二个目的是提供用于检测豇豆花叶病毒属病毒的试剂。
[0014] 本发明所提供的用于检测豇豆花叶病毒属病毒的试剂，具体可包括所述引物组， 以及如下中的至少一种：dNTPs、Mg 2+、DNA聚合酶、反转录酶和RNA酶抑制剂。
[0015] 在所述试剂中，各物质可分别单独包装。
[0016] 在本发明中，所述DNA聚合酶具体为Taq DNA聚合酶；所述反转录酶具体为M-MLV 反转录酶。
[0017] 本发明的第三个目的是提供一种用于检测豇豆花叶病毒属病毒的试剂盒。
[0018] 本发明所提供的用于检测豇豆花叶病毒属病毒的试剂盒，具体可含有所述引物组 或所述试剂，以及作为阳性对照的豇豆花叶病毒属病毒的病叶冻干粉末（如含有南瓜花叶 病毒的叶片冻干粉末）；和/或作为阴性对照的水。
[0019] 所述引物组或所述试剂或所述试剂盒在检测待测样品中是否含有豇豆花叶病毒 属病毒中的应用也属于本发明的保护范围。
[0020] 本发明的第四个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品中是否含有豇豆花叶 病毒属病毒的方法。
[0021] 本发明所提供的检测或辅助检测待测样品中是否含有豇豆花叶病毒属病毒的方 法，具体可包括如下步骤：
[0022] (1)从所述待测样品中提取总RNA，采用所述反转录引物进行反转录反应，得到待 测 cDNA ;
[0023] (2)以所述待测cDNA作为模板，用所述四条扩增引物进行PCR反应，获得PCR产 物；
[0024] (3)根据所述PCR产物的大小按照如下方法确定所述待测样品中是否含有豇豆花 叶病毒属病毒：若所述PCR产物中含有大小为590?650bp的DNA片段，则所述待测样品中 含有或候选含有豇豆花叶病毒属病毒，反之则所述待测样品中不含有或候选不含有豇豆花 叶病毒属病毒。
[0025] 在所述方法的步骤（2)中，用所述四条扩增引物进行PCR反应时，所述四条扩增引 物的摩尔比具体可为：序列表中序列2所示的单链DNA :序列表中序列3所示的单链DNA :序列表中序列4所示的单链DNA :序列表中序列5所示的单链DNA为I : I : 10 : 10。
[0026] 进一步，步骤⑵的反应体系中，Mg2+的终浓度为2. 5mmol/L ;dNTPs的终浓度为 0? 2mmol/L ;引物ComoV-2-F2-M4(序列2)和引物ComoV-2-R2-Ml (序列3)的终浓度均为 0.04iimol/L;引物M4(序列4)和引物Ml (序列5)的终浓度均为0.4iimol/L;Taq DNA聚 合酶的终浓度为〇.〇6U/iiL。
[0027] 在所述方法的步骤（2)中，所述进行PCR反应共进行35个循环，前5个循环的退 火温度为42°C，后30个循环的退火温度为45°C。
[0028] 更加具体的，步骤（2)的反应条件为：95°C预变性3min ;然后94°C变性45s、42°C 退火45s、72°C延伸60s，如此共5个循环；94°C变性45s、45°C退火45s、72°C延伸60s，如此 共30个循环；最后72°C继续延伸7min，反应结束。
[0029] 在所述方法的步骤（1)中，所述进行反转录反应的温度为42°C。
[0030] 进一步，步骤⑴的反应体系中，所述总RNA的体积分数为20 %，引物 Oligo (dT) 18 (序列1)的终浓度为I ii mol/L ;dNTPs的终浓度为0. 5mmol/L ;M-MLV反转录酶 的终浓度为5U/ ii L ;RNA酶抑制剂的终浓度为IU/ ii L。
[0031] 在本发明中，以上所有的所述待测样品均可为植物样品，如感染了豇豆花叶病毒 属病毒的植物叶片。
[0032] 所述引物组的制备方法也属于本发明的保护范围。
[0033] 所述制备方法包括将所述引物组中各单链DNA分别单独包装的步骤。
[0034] 所述引物组在制备所述试剂或所述试剂盒中的应用同样属于本发明的保护范围。
[0035] 在本发明中，以上所有的所述豇豆花叶病毒属病毒均可为如下中的任一种或多 种：安弟斯马铃薯斑驳病毒、蚕豆真花叶病毒、菜豆荚斑驳病毒、豇豆花叶病毒、豇豆重花叶 病毒、萝卜花叶病毒、南瓜花叶病毒、菜豆粗缩花叶病毒、蚕豆染色病毒、大豆属花叶病毒、 豌豆绿斑驳病毒、豌豆轻花叶病毒、鹑豌豆花叶病毒、红三叶草斑驳病毒、块根落葵C病毒 和芜菁环斑病毒。
[0036] 实验证明，本发明所提供的用于检测豇豆花叶病毒属病毒的引物组及其试剂盒具 有广谱性好、灵敏度高、特异性强、检测周期短等特点，适用于进出境口岸及农业生产上豇 豆花叶病毒属病毒的快速检测与监测。
【专利附图】
【附图说明】
[0037] 图1为豇豆花叶病毒属病毒广谱检测试剂盒的广谱性检测结果。M :DNA分子量 标准IOObp DNA Ladder ;1:安弟斯马铃薯斑驳病毒（DSMZ PV-0057) ;2:蚕豆真花叶病毒 (DSMZ PV-0098) ;3 :菜豆荚斑驳病毒（ACD V082-PV) ;4 :菜豆荚斑驳病毒（Agdia C1858); 5:豇豆花叶病毒（Agdia C1319) ;6:豇豆花叶病毒（Agdia C1860) ;7:豇豆重花叶病毒 (ATCC PV-273) ;8 :豇豆重花叶病毒（DSMZ PV-0050) ;9 :萝卜花叶病毒（DSMZ PV-0355); 10 :南瓜花叶病毒（Agdia C2013) ;11 :空白对照。
[0038] 图2为豇豆花叶病毒属病毒广谱检测试剂盒的特异性验证结果。M :DNA分子量 标准IOObp DNA Ladder ;1 :菜豆荚斑驳病毒（Agdia C1858) ;2 :蚕豆萎蔫病毒1号（DSMZ PV-0067) ;3 :葡萄扇叶病毒（Adgen 1147-11) ;4 :桃丛簇花叶病毒（Agdia C1973) ;5 :悬钩 子环斑病毒（DSMZ PV-0429) ;6 :番爺黑环病毒（Adgen 1068-11) ;7 :番爺环斑病毒（Agdia C1939) ;8 :烟草环斑病毒（Agdia C1714) ;9 :健康豇豆叶片；10 :健康菜豆叶片；11 :健康南 瓜叶片；12 :空白对照。
[0039] 图3为豇豆花叶病毒属病毒广谱检测试剂盒的灵敏度检测结果。其中，A为本发明 实施例1试剂盒的检测结果；B为对照检测结果。A和B中，M :DNA分子量标准IOObp DNA Ladder ;1 :南瓜花叶病毒cDNA KT1稀释液；2 :南瓜花叶病毒cDNA KT2稀释液；3 :南瓜花 叶病毒cDNA KT3稀释液；4:南瓜花叶病毒cDNA KT4稀释液；5:南瓜花叶病毒cDNA KT5稀 释液；6 :南瓜花叶病毒cDNA KT6稀释液；7 :南瓜花叶病毒cDNA KT7稀释液；8 :南瓜花叶 病毒cDNA KT8稀释液。
【具体实施方式】
[0040] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0041] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0042] 安弟斯马铃薯斑驳病毒：德国菌种保藏中心（DSMZ)，保藏编号为DSMZ No.PV-0057。
[0043] 蚕豆真花叶病毒：德国菌种保藏中心（DSMZ)，保藏编号为DSMZ No. PV-0098。
[0044] 菜荚斑驳病毒：公司名称：AC Diagnostics, Inc.;产品编号为V082-PV。
[0045] 菜S?荚斑驳病毒：公司名称：Agdia, Inc.，产品编号为Lot No :C1858。
[0046] 豇豆花叶病毒：公司名称：Agdia，Inc.，产品编号为Lot No :C1319。
[0047] 豇豆花叶病毒：公司名称：Agdia，Inc.，产品编号为Lot No :C1860。
[0048] 豇豆重花叶病毒：美国菌种保藏中心（ATCC)，保藏编号为：ATCC No. PV-273。
[0049] 豇豆重花叶病毒：德国菌种保藏中心（DSMZ)，保藏编号为DSMZ No. PV-0050。
[0050] 萝卜花叶病毒：德国菌种保藏中心（DSMZ)，保藏编号为DSMZ No. PV-0355。
[0051] 南瓜花叶病毒：公司名称：Agdia，Inc.，产品编号为Lot No :C2013。
[0052] 蚕豆萎蔫病毒1号：德国菌种保藏中心（DSMZ)，保藏编号为DSMZ No. PV-0067。
[0053] 葡萄扇叶病毒：公司名称：NEOGEN EUROPE Ltd-ADGEN Phytodiagnostics (在中国 注册的公司名称：安德珍生物技术（北京）有限公司），产品编号为Adgen No. 1147-11。
[0054] 桃丛簇花叶病毒：公司名称：Agdia，Inc.，产品编号为Agdia Lot No. C1973。
[0055] 悬钩子环斑病毒：德国菌种保藏中心（DSMZ)，保藏编号为DSMZ No. PV-0429。
[0056] 番爺黑环病毒：公司名称：Agdia, Inc.，产品编号为Lot No :1068_11。
[0057] 番爺环斑病毒：公司名称：Agdia, Inc.，产品编号为Lot No :C1939。
[0058] 烟草环斑病毒病叶：公司名称：Agdia，Inc.，产品编号为Lot No :C1714。
[0059] 实施例I、豇豆花叶病毒属病毒广谱检测试剂盒配置（50次检测量）
[0060] 1)弓丨物 Oligo (dT)18 :浓度为 IOii mol/L，l 管（IOOiiL);
[0061] 2)反转录缓冲液：5X，1 管（250iiL);
[0062] 3) dNTPs :浓度为 10mmol/L，1 管（100 ii L);
[0063] 4)M_MLV 反转录酶：200U/ ii L，1 管（30 ii L);
[0064] 5) RNA 酶抑制剂：40U/ ii L，1 管（30 ii L);
[0065] 6)无 RNA 酶 ddH20,1 管（ImL)；
[0066] 7)PCR 缓冲液（含 25mmol/L 的 Mg2+) :10X，1 管（300 ii L);
[0067] 8) Taq DNA 聚合酶：5U/ ii L，1 管（30 ii L);
[0068] 9)引物 ComoV-2-F2-M4 :浓度为 I ii mol/L，1 管（120 ii L);
[0069] 10)引物 ComoV-2-R2_Ml :浓度为 I ii mol/L，1 管（120 ii L);
[0070] 11)弓丨物 M4 :浓度为 10iimol/L，l 管（120iiL);
[0071] 12)弓丨物 Ml :浓度为 10 ii mol/L，1 管（120 ii L);
[0072] 13)阳性对照样品：含有南瓜花叶病毒的叶片冻干粉末，1管（0. Ig)。
[0073] 其中，引物Oligo(ClT)18为反转录引物，其序列为：
[0074] 5, -AAAAAAAAAAAAAAAAAA-3,（序列 1)。
[0075] 引物 ComoV-2-F2-M4、ComoV-2-R2-Ml、M4 和 Ml 为四条 PCR 扩增引物， ComoV-2-F2-M4和ComoV-2-R2-Ml中除了含有M4和Ml序列外，其余序列是根据豇豆花叶病 毒属病毒RNA2上的CP基因的保守区域设计的1对简并引物。四条扩增引物的序列为：
[0076] ComoV-2-F2-M4 :5，-GTTTTCCCAGTCACGACGATGGBTGYCCHYAYYTRTRYGC-3,（序列 2);
[0077] ComoV-2-R2-Ml :5, -AGTCACGACGTTGTASSHMWWYTCRAADCCVBYRTTNGGHCC-3,（序列 3)。
【权利要求】
1. 用于检测豇豆花叶病毒属病毒的引物组，为引物组A或引物组B ; 所述引物组A由一条反转录引物和四条扩增引物组成；所述反转录引物为序列表中序 列1所示的单链DNA ;所述四条扩增引物为序列表中序列2、序列3、序列4和序列5所示的 四条单链DNA ; 所述引物组B由四条扩增引物组成；所述四条扩增引物为序列表中序列2、序列3、序列 4和序列5所不的四条单链DNA。
2. 用于检测豇豆花叶病毒属病毒的试剂，包括权利要求1所述的引物组，以及如下中 的至少一种：dNTPs、Mg2+、DNA聚合酶、反转录酶和RNA酶抑制剂。
3. 用于检测豇豆花叶病毒属病毒的试剂盒，含有权利要求1所述的引物组或权利要求 2所述的试剂，以及作为阳性对照的豇豆花叶病毒属病毒的病叶冻干粉末；和/或作为阴性 对照的水。
4. 权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的试剂或权利要求3所述的试剂盒在检 测待测样品中是否含有豇豆花叶病毒属病毒中的应用。
5. -种检测或辅助检测待测样品中是否含有豇豆花叶病毒属病毒的方法，包括如下步 骤： (1) 从所述待测样品中提取总RNA，采用权利要求1中所述的反转录引物进行反转录反 应，得到待测cDNA ; (2) 以所述待测cDNA作为模板，用权利要求1中所述的四条扩增引物进行PCR反应，获 得PCR产物； (3) 根据所述PCR产物的大小按照如下方法确定所述待测样品中是否含有豇豆花叶病 毒属病毒：若所述PCR产物中含有大小为590?650bp的DNA片段，则所述待测样品中含有 或候选含有豇豆花叶病毒属病毒，反之则所述待测样品中不含有或候选不含有豇豆花叶病 毒属病毒。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（2)中，用所述四条扩增引物进行 PCR反应时，所述四条扩增引物的摩尔比为： 序列表中序列2所示的单链DNA :序列表中序列3所示的单链DNA :序列表中序列4 所示的单链DNA :序列表中序列5所示的单链DNA为I : I : 10 : 10。
7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：步骤（2)中，所述进行PCR反应共进 行35个循环，前5个循环的退火温度为42°C，后30个循环的退火温度为45°C。
8. 根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：步骤（1)中，所述进行反转录反 应的温度为42 °C。
9. 权利要求1所述引物组的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括将权利要求1 所述引物组中各单链DNA分别单独包装的步骤。
10. 权利要求1所述引物组在制备权利要求2所述试剂或权利要求3所述试剂盒中的 应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104212917SQ201410478602
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月18日 优先权日:2014年9月18日
【发明者】廖富荣, 方志鹏, 林振基, 吴媛 申请人:厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心