一种用于测序的高通量扩增质粒的方法
【专利摘要】本发明一种用于测序的高通量扩增质粒的方法，属于质粒扩增【技术领域】。包括：将10×phi29 DNA聚合酶缓冲液、Hexamer引物、待测样品和去离子水混合均匀，在95℃加热3分钟，然后置于冰上冷却，得到反应液(Ⅰ)；在反应液(Ⅰ)中加入浓度为dNTP、100×BSA和phi29 DNA聚合酶，将其混合均匀，在30℃温育8小时，最后在65℃加热10分钟，得到反应液(Ⅱ)；将反应液(Ⅱ)用灭菌去离子水稀释3-6倍后，得到用于测序的DNA。本发明具有可以利用混合质粒库或单一质粒转化的大肠杆菌菌落作为模板，省去大量提取质粒的时间和人力消耗的优点。
【专利说明】一种用于测序的高通量扩增质粒的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于质粒扩增【技术领域】，具体涉及一种用于测序的高通量扩增质粒的方 法。
【背景技术】
[0002] 在常规质粒sanger测序过程中，一般的方法须准备测序模板，由过夜培养增菌、 传统碱裂解法提取质粒，摇菌和提质粒的过程至少需要16小时以上，如果是低拷贝的质粒 提取的产量和质量都比较低，这样直接影响测序结果。如果大量提取质粒（超过1〇〇个样 本）需要的时间更长，并且消耗更多的人力和成本。
【发明内容】
[0003] 为了快速大量的得到质粒，并且避免大规模提取质粒，滚环扩增（Rollingcircle amplication,RCA)技术可用于扩增大的环状DNA模板，比如质粒DNA。该技术是借鉴自然 界中环状病原生物体DNA分子滚环式复制方式建立的核酸扩增技术，可在室温下进行，使 用一个随机引物便可实现线性滚环扩增，具有快速、灵敏、特异的特点。该技术扩增得到的 DNA直接可用于sanger测序。
[0004] 本发明的目的在于公开了一种用于测序的高通量扩增质粒的方法。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0006] -种用于测序的高通量扩增质粒的方法，包括下述步骤：
[0007] (1)、将 10Xphi29DNA聚合酶缓冲液 1.OilL、浓度为lOOiiM的Hexamer引物 2. 5iiL、待测样品0. 5iiL和去离子水4. 9iiL混合均匀，在95°C加热3分钟，然后置于冰上 冷却，得到反应液（I);
[0008] (2)、在反应液（I)中加入浓度为 10mM的dNTP0.5iiL、100XBSA0?liiL和 phi29DNA聚合酶0. 5iiL，使总反应体系为10. 0iiL，将其混合均匀，在30°C温育8小时，最 后在65°C加热10分钟，得到反应液（II );
[0009](3)、将步骤（2)中得到的反应液（II )用灭菌去离子水稀释3-6倍后，得到可直 接用于测序的DNA。
[0010] 上述技术方案所述的一种用于测序的高通量扩增质粒的方法，其中，步骤（1)中 的待测样品选自通过转化获得阳性菌落、冻存的甘油菌液或细胞培养液中的一种。
[0011] 上述技术方案所述的一种用于测序的高通量扩增质粒的方法，其中，步骤（3)中 所述测序为sanger测序。
[0012] 本发明具有以下有益效果：
[0013] 1、与传统的以提取所得的DNA为模板的技术相比，本发明的方法可以利用混合质 粒库或单一质粒转化的大肠杆菌菌落作为模板；
[0014] 2、与传统的利用特异的双引物扩增，只能扩增特异DNA，利用了phi29DNA聚合酶 的链替换活性和聚合活性的技术相比，本发明的方法利用phi29DNA聚合酶的滚环复制特 点，利用随机的引物可以扩增任何菌落的质粒DNA，尤其是低拷贝的质粒，在菌落里数目较 少，如果利用质粒小提法不能提取出来的DNA浓度不能满足测序要求，而利用RCA扩增可以 放大质粒的浓度达到测序目的；
[0015] 3、本发明的方法可以利用96孔板高通量的扩增质粒，省去大量提取质粒的时间 和人力消耗；
[0016] 4、本发明的方法扩增出来的DNA主要用于测序反应；
[0017] 5、本发明的方法在在PCR仪或沙浴中30°C下反应8小时即可，与传统的PCR仪中 30摄氏度反应10-15小时方法相比，缩短了反应时间。
【专利附图】
【附图说明】：
[0018] 1、图1为采用本发明方法扩增后的DNA产物；
[0019] 2、图2为图1中扩增产物列2的测序结果。
【具体实施方式】：
[0020] 为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明一种用于测序的 高通量扩增质粒的方法作进一步的说明。
[0021] 试验例1 :一种用于测序的高通量扩增质粒的方法:
[0022] 1、待测样品为通过转化获得阳性菌落，或冻存的甘油菌液，或细胞培养液等；
[0023] 2、按照表1中的组成配置反应体系，将反应体系中各物质混合均匀，在95°C加热3 分钟，然后置于冰上冷却，得到反应液（I);其中phi29DNA聚合酶为克劳宁公司或NEB公 司产品；Hexamer引物序列为NNNN*N*N，其中N=A、G、C或T，并且*表示硫代磷酸酯键，由 上海生工合成；
[0024] 表1反应体系
[0025]
[0026]
【权利要求】
1. 一种用于测序的高通量扩增质粒的方法，包括下述步骤： (1) 、将 10Xphi29 DNA 聚合酶缓冲液 1. 0 ii L、浓度为 100 ii M 的 Hexamer 引物 2. 5 ii L、 待测样品〇. 5 ii L和去离子水4. 9 ii L混合均匀，在95°C加热3分钟，然后置于冰上冷却，得 到反应液（I ); (2) 、在反应液（1)中加入浓度为10禮的(1阶130.51^、100\85六0.11^和？1^29 DNA聚合酶0. 5 ii L，使总反应体系为10. 0 ii L，将其混合均勻，在30°C温育8小时，最后在 65°C加热10分钟，得到反应液（II ); (3) 、将步骤（2)中得到的反应液（II )用灭菌去离子水稀释3-6倍后，得到可直接用 于测序的DNA。
2. 根据权利要求1所述的一种用于测序的高通量扩增质粒的方法，其特征在于：步骤 (1)中的待测样品选自通过转化获得阳性菌落、冻存的甘油菌液或细胞培养液中的一种。
3. 根据权利要求1所述的一种用于测序的高通量扩增质粒的方法，其特征在于：步骤 (3)中所述测序为sanger测序。
【文档编号】C12Q1/68GK104328111SQ201410593687
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月29日 优先权日:2014年10月29日
【发明者】董志, 李桂澜 申请人:北京大学