一株高产纤维素酶的里氏木霉及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一株里氏木霉(Trichoderma reesei)突变菌株VLKDN-1，其保藏号为CCTCC NO：M 2014506。本发明利用紫外诱变技术，并结合摇瓶筛选获得一株高产纤维素酶的里氏木霉突变菌株。与出发菌相比，突变菌里氏木霉VLKDN-1的发酵上清液酶活提高了235％，蛋白含量提高了157％；该突变菌的菌落形态明显小于出发菌，且菌丝比出发菌的菌丝短、分枝多。在生产过程中，该突变菌株“小型化”的菌落形态以及菌丝短、分枝多的特点能使发酵菌液的粘度显著降低，达到降低搅拌速度又提高溶氧的目的，从而有利于降低生产成本，应用前景广泛。
CCTCC NO: M 2014506
2014.10.22
【专利说明】一株高产纤维素酶的里氏木霉及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物筛选【技术领域】，具体涉及一种高产纤维素酶的里氏木霉及其在 纤维素酶生产中的应用。
【背景技术】
[0002] 里氏木霉（Trichoderma reesei)是一种丝状真菌，属于多细胞的真核微生物，是 红褐肉座菌（Hypocrea jecorina)的无性型，分类上隶属于真菌门、半知菌亚门、丝孢纲、丛 梗孢目、木霉属。里氏木霉广泛分布于自然界，在腐木、种籽、植物残体、有机肥、土壤和甚至 是空气中（Montenecourt&Eveleigh，1979，Adv Chem Ser.)。
[0003] 里氏木霉能表达多种胞外纤维素酶和半纤维素酶，包括外切纤维素酶（CBH1和 CBH2)、内切纤维素酶（EG1、EG2、EG3、EG4和EG5等）、beta-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和甘 露聚糖酶等。通过这些纤维素酶和半纤维素酶的协同作用，将纤维素彻底分解为单糖 (Biely&Tenkanen. 1998, In Trichoderma and Gliocladium)，因此，木霉产纤维素酶已经是 二代纤维素生物乙醇的主要酶制剂来源。
[0004] 但是，木霉纤维素酶和半纤维素酶往往是协同表达的，而影响木霉纤维素酶表达 的因素很多。首先，培养碳源的影响：纤维素，乳糖和槐糖用来诱导木霉产纤维素酶；葡 萄糖和甘油等阻遏纤维素酶的表达。碳源的诱导作用是调控因子来影响表达的，如与诱 导表达相关的正调控因子是ACEII和XYR1，而负调控因子是CRE1和ACEI(Ilme' n et al.，1997, Mol. Gen. Genet. ;Foreman et al.，2003, J. Biol. Chem.)。其次，菌体（菌丝）形 态也是影响分泌表达的关键因素之一。一般认为，丝状真菌是通过顶端分泌来输出胞外蛋 白的。因此，高效分泌菌株形态上往往是多分枝的。
[0005] 然而从自然界中直接筛选到的木霉菌株产酶水平往往很低，不适合商业生产。因 此，如何通过现有技术改造木霉菌株提高其胞外蛋白含量，以降低生产成本就成为本领域 的研究热点之一。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一株高产纤维素酶的里氏木霉菌株及其应用，通过紫外诱变 的方法获得了一株菌落形态小且高产纤维素酶的里氏木霉突变株，可广泛应用于纤维素酶 的生产，降低生产成本。
[0007] 本发明一方面提供了 一株里氏木霉（Trichoderma reesei)突变菌株VLKDN-1， 已于2014年10月22日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC NO :M 2014506。
[0008] 本发明还提供了上述里氏木霉突变菌株VLKDN-1在纤维素酶生产中的应用。
[0009] 本发明利用紫外诱变技术，并结合摇瓶筛选获得一株高产纤维素酶的里氏木霉突 变菌株。与出发菌相比，突变菌里氏木霉VLKDN-1的发酵上清液酶活提高了 235%，蛋白含 量提高了 157% ;该突变菌的菌落形态明显小于出发菌，且菌丝比出发菌的菌丝短、分枝多。 在生产过程中，该突变菌株"小型化"的菌落形态以及菌丝短、分枝多的特点能使发酵菌液 的粘度显著降低，达到降低搅拌速度又提高溶氧的目的，从而有利于降低生产成本，应用前 景广泛。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图1 :出发菌和突变菌的菌落形态比较，其中：A为出发菌，B为突变菌里氏木霉 VLKDN-1；
[0011] 图2 :出发菌和突变菌的菌丝形态比较，其中：A为出发菌，B为突变菌里氏木霉 VLKDN-1。
【具体实施方式】
[0012] 下面结合具体的实施方案对本发明进行更详细的描述。但本发明并不受所述实施 例的限制。提供实施方案的目的是为了使说明书全面而透彻，并向本领域的技术人员全面 传达发明的范围。除另定义外，本发明所使用的所有技术和科学术语均具有作为本发明所 属【技术领域】中普通技术人员通常理解的同样的含义。
[0013] 实施例1菌落"小型化"突变菌株的筛选
[0014] 1、菌种处理：
[0015] 将出发菌种里氏木霉（该菌株是本专利发明人黄亦钧于2013年6月从青岛市崂 山区林场的枯树皮中筛选到的）接种于PDA琼脂平板（马铃薯200-300克，葡萄糖20克， 琼脂15-20克，自来水1000毫升，自然pH)上，28-30°C恒温培养1周至稳定期。待孢子成 熟后，往平板上加入5-10ml无菌水洗刷孢子，吸取孢子悬液并计数，依据孢子含量用调整 其浓度至1〇 5_6个/ml，然后进行后续诱变处理。
[0016] 2、诱变筛选：
[0017] 将上述孢子悬液，加入到空平板中，并进行磁力搅拌（20-550rpm)，然后利用紫 外对准平板进行诱变处理，诱变条件为：l〇-2〇W紫外灯，照射距离为10-20cm，照射时间为 3-5min;然后将诱变后的孢子悬液在暗光或红光条件下涂布于PDA琼脂平板；最后将平板 至于30°C恒温培养，直至长出菌落，时间约为7-10天。
[0018] 挑取菌落形态明显小于出发菌的突变体菌分别接种到PDA琼脂平板。
[0019] 实施例2高产纤维素酶突变菌株的筛选
[0020] 1、利用96深孔板筛选：
[0021] 在96深孔板的孔中加入2-3ml诱导培养基，诱导培养基（GLC培养基）的组成为 CaCl 2l. 125g/L，葡萄糖 10g/L，乳糖 20g/L，玉米浆 15mlg/L，微量元素 10ml/L，KH2P0420g/L， pH5. 0;其中微量元素（ME)的组成为 FeS04. 7H20 0? 75g/L，ZnS04. 7H20 0? 06g/L，CuS04. 5H20 0? 012g/L，MnS04. H200. 053g/L，H3B030.00 3g/L。然后将实施例1中筛选到的突变株分别接种 于各个孔中，置于摇床上，30°C，200rpm，培养3天。培养结束后，分别离心取上清进行酶活 检测和SDS-PAGE电泳检测。根据检测结果，筛选出酶活和胞外蛋白含量显著高于出发菌的 突变菌共 4 株，分别命名为 VLKDN-1，VLKDN-2, VLKDN-3, VLKDN-4。
[0022] (1)酶活测定的方法：CMC法
[0023](2)测定的原理：纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖。具有还原性末 端的寡糖和单糖在沸水浴条件下可以与3, 5-二硝基水杨酸（DNS)试剂发生显色反应。反 应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶 的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中纤维素酶的 活力。
[0024] (3)测定过程：取三支试管各加入0. 5mlCMC底物，与待测酶液一起50°C水浴预热 5min。在第一、二试管中各加入0. 5ml待测液，并计时，50°C水浴中反应15min。反应完后在 三支试管中各加入1. 5ml的DNS试剂，并在第三支试管中补加0. 5ml的待测酶液。取出并 摇勻三支试管后，在沸水浴中反应5min。迅速冷却至室温，用水定容至5. 0ml。以第三支试 管液为对照在540nm波长条件下测得第一、二试管液的吸光度。根据预先绘制的标准曲线 计算出酶活力值。
[0025] (4)酶活力计算：
[0026]酶活力（IU/ml 或 IU/g)=(葡萄糖等量值 /180/15/0. 5) Xn
[0027] 式中：180-葡萄糖从微克换算成微摩尔
[0028] 15-待测液与底物的反应时间
[0029] 0. 5一加入反应的待测酶液量
[0030] n-酶样的稀释倍数
[0031] 2、摇瓶筛选：
[0032]将上述四株突变菌（VLKDN-1，VLKDN-2, VLKDN-3, VLKDN-4)分别接种于 500ml 三 角瓶中（含50mlGLC诱导培养基），置于摇床上，30°C，200rpm，培养5-7天。培养结束后，分 别离心取上清，进行酶活检测（CMC酶活检测法）和蛋白含量测定（考马斯亮蓝检测法），结 果如表1所示。
[0033]
【权利要求】
1. 一株里氏木霉菌株，其特征在于，所述的菌株的保藏编号为CCTCC NO :M 2014506。
2. 权利要求1所述的里氏木霉菌株的制备方法，其特征在于，所述的制备方法是通过 紫外诱变获得的。
3. 权利要求1所述的里氏木霉菌株在纤维素酶生产中的应用。
4. 一种制备纤维素酶的方法，其特征在于，所述的方法是用权利要求1所述的里氏木 霉菌株接种到发酵培养基中，培养后添加乳糖诱导菌体进行发酵生产纤维素酶。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基的组成如下：葡萄糖 30-50g/L，乳糖 2. 0-10g/L，玉米浆 20-50g/L，硫酸铵 10-30g/L，硫酸镁 5-10g/L，磷酸二氢 钾 15-30g/L。
【文档编号】C12R1/885GK104328056SQ201410597983
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月29日 优先权日:2014年10月29日
【发明者】黄亦钧, 吴佳鹏, 许丽红, 李 瑞, 王玉明 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司, 潍坊康地恩生物科技有限公司