一种饲料用酿酒酵母菌高密度发酵培养基配方及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于农业微生物【技术领域】，涉及一种饲料用酿酒酵母的高密度发酵培养基配方及其应用。培养基配方为：淀粉18-22g/L、蔗糖5g/L、牛肉膏10g/L、尿素10g/L、酵母提取物5g/L。其发酵工艺条件为温度25℃、pH值6-6.5、通气量1.2:1的初始条件下发酵20-24小时，在OD值在600nm波长下吸收值达到1.4之后2-3小时开始以v/v计1:10进行补料。补料液的组成如下：淀粉100g/L、蔗糖25g/L、牛肉膏50g/L、尿素50g/L、酵母提取物25g/L。通过本发明的实施，酿酒酵母菌的发酵密度相对于YPED培养基活菌数增加7.3倍，菌体浓度达到了1.05×109cfu/ml，菌体干重达到112g/L。减少了蛋白胨和葡萄糖的用量，降低了生产成本，使之更加适合工业生产。CGMCC No943620140710
【专利说明】一种饲料用酿酒酵母菌高密度发酵培养基配方及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于农业微生物【技术领域】，涉及一种饲料用酿酒酵母菌的高密度发酵培养基配方及其应用。
【背景技术】
[0002]随着畜牧业生产的发展，动物对蛋白质的需求量越来越大，而在农业生产的总量是有一定限度的，生长必需的蛋白质饲料需求量越来越大。而酿酒酵母菌体蛋白的营养价值很闻，酵母干物质中蛋白质含量可闻达50%,赖氣酸、精氣酸等含量较闻，接近动物蛋白，色氨酸含量比大豆高7倍以上，此外酿酒酵母菌中还含有丰富的核苷酸、B族维生素、矿物质以及其它生理活性物质，适合用于添加作为高蛋白活性酵母饲料。随着微生物工程和发酵工程的发展，酿酒酵母越来越被广泛用于优质蛋白质饲料的生产。
[0003]同时随着酵母菌在饲料中的广泛应用，在容积有限的发酵罐空间内实现酵母菌的高密度发酵，是维持酵母制品生产规模和控制成本的关键，因此对酵母各方面的特征尤其是发酵特征的研究显得十分必要。
[0004]普通的发酵方法通过优化溶氧、pH值、温度、培养基等实现酿酒酵母的高密度发酵，将众多因素及其相互影响整合优化形成一套完整的发酵工艺，这项工艺是一项程序复杂、综合性高的工作。在基础的研究工作和一些工业化生产中，酿酒酵母多采用酵母浸出粉胨葡萄糖(Yeast Extract Peptone Dextrose, YEPD)培养基,其培养基成分未能针对特定的酿酒酵母菌株进行优化。因此，有必要根据酿酒酵母的碳源利用的模式，采用原料来源广泛，价格低廉的营养成分，开发适合大规模工业化生产且能有效提高活菌数的培养基。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种饲料用酿酒酵母cerevisiae NDFJ12中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号=CGMCC N0.9436高密度发酵发酵培养基组成，以及提供该培养基在酿酒酵母高密度发酵中的应用。本发明能保证酿酒酵母的旺盛生长，又能降低发酵成本，解决目前酵母发酵菌体浓度不高的问题。本发明通过以下技术方案实现:
本发明用于高密度培养酿酒酵母的培养基组成为:按每升的配比，淀粉18-22g/L、蔗糖5g/L、牛肉膏10g/L、尿素10g/L、酵母提取物5g/L，其余为水。本发明培养基配制方法如下:
按照培养基组成分别称取各组分，使用蒸馏水溶解；将配置好的培养基装入发酵罐中，搅拌混匀，121°C灭菌15分钟；
为达到培养基的最佳效果，使用本培养基发酵酿酒酵母时，发酵过程如下:
1、菌种活化，将冷冻保存的酿酒酵母菌在YEH)琼脂平板上活化，挑取单菌接种于本培养基液体试管，25°C培养12小时后，以v/v计，将1%本酵母菌液培养基转接于本培养基液体试管，培养12小时后作为种子培养基； 2、按照培养基配方配制酿酒酵母高密度发酵培养基4500ml装入发酵罐中，灭菌后将温度降至25°C ;以v/v计，按5%的接种量将得到的种子培养基接种于发酵罐中；
3、发酵条件设定为:温度25°C，转速300rpm，pH值6-6.5，通气量1.2:1。在此条件下发酵20-24小时，当pH降低时则自动加入碱性中和剂NaOH，泡沫过多时自动加入消泡剂吐温80 ；
4、当发酵液OD值在600nm波长下吸收值达到1.4之后2_4小时开始补料500ml。补料液的组成如下:淀粉150g/L、蔗糖50g/L、牛肉膏100g/L、尿素100g/L、酵母提取物50g/L ；
5、继续发酵48小时，收取菌体。
[0006]本发明所用的酵母提取物为市场购得。
[0007]本发明提供的用于酿酒酵母高密度培养培养基，所用材料和工艺均以大规模产生酵母菌体为目的。采用上述培养基培养酿酒酵母，有利于酿酒酵母的快速生长，同时酵母中蛋白含量较高。本发明中培养基采用淀粉和蔗糖作为碳源，降低了发酵成本，另外补充的尿素可以有效地提升菌体中的蛋白含量。采用此技术发酵活菌数达到1.05X 19 cfu/ml，菌体干重达到112 g/L，这是目前技术较难达到的发酵标准，较普通的YEH)培养基活菌数提高7.3倍，实现了酿酒酵母的高密度发酵。
[0008]本发明的酿酒酵母cerevisiae NDFJ12,已于 2014 年 07 月 10日交由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏单位的地址位于北京中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.9436，酿酒酵母feccAaro耶cmcerevisiae NDFJ12 的分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae')。
【具体实施方式】
[0009]通过以下实施案例进一步对本发明进行描述:
实施例1发酵培养基的配置和发酵结果对比
酿酒酵母高密度发酵培养基组成:按每升的比例，淀粉20g/L、蔗糖5g/L、牛肉膏1g/L、尿素10g/L、酵母提取物5g/L。
[0010]培养基配制方法如下:
按照培养基组成分别称取各组分，使用蒸馏水溶解；
将配置好的培养基装入发酵罐中，搅拌混匀，121°C灭菌15分钟；
为达到培养基的最佳效果，使用本培养基发酵酿酒酵母时，发酵过程如下:
高密度发酵主要步骤如下:
O将冷冻保存的酿酒酵母菌(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏号=CGMCC N0.9436)在YETO琼脂平板上活化，挑取单菌接种于本培养基液体试管，25°C培养12小时后，以v/v计，按1%的比例，转接于本培养基液体试管，培养12小时后作为种子培养基；
2)按照培养基配方，配制酿酒酵母高密度发酵培养基4500ml装入发酵罐中，灭菌后将温度降至25 °C ；
3)以v/v计，按5%的比例的接种量将得到的种子培养基接种于发酵罐中；
4)发酵条件设定为:温度25°C，转速300rpm，pH值6-6.5，通气量1.2:1。在此条件下发酵10-14小时，当pH降低时则自动加入碱性中和剂NaOH，pH值6-6.5，泡沫过多时加入5-8克消泡剂吐温80 ；
5)当发酵液OD值在600nm波长下吸收值达到1.4之后2小时补料500ml。补料液的组成如下:淀粉100g/L、蔗糖25g/L、牛肉膏50g/L、尿素50g/L、酵母提取物25g/L。
[0011 ] 将发酵完成后的菌体进行收集与干燥，所各为酵母蛋白。
[0012]本方法与现有技术的比较:对照试验培养基和发酵过程
1)对照试验采用的酵母浸出粉胨葡萄糖(YeastExtract Peptone Dextrose,YEF1D)培养基组成:酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L ；
2)将冷冻保存的酿酒酵母菌在YEH)琼脂平板上活化，挑取单菌接种于YEH)培养基液体试管，25°C培养12小时后，以v/v计1%转接于YEH)培养基液体试管，培养12小时后作为种子培养基；
3)配置YEro培养基4500ml装入发酵罐中，灭菌后将温度降至25°C ；
4)以v/v计5%的接种量将得到的种子培养基接种于发酵罐中；
5)发酵条件设定为:温度25°C，转速300rpm，pH值6-6.5，通气量1.2:1。在此条件下发酵20-24小时，当pH降低时则自动加入碱性中和剂NaOH，泡沫过多时自动加入消泡剂吐温80 ；
6)当发酵液OD值在600nm波长下吸收值达到1.4之后2小时补料500ml。补料液的组成如下:酵母膏50g/L,蛋白胨100g/L,葡萄糖100g/L。
[0013]7)继续发酵48小时，收取菌体。
[0014]应用本发明的培养基及其发酵方法，可以得到酿酒酵母活菌数达1.05X 109 cfu/ml，菌体干重达到112 g/L。而对照组采用YEH)培养基及其发酵方法，得到的酿酒酵母活菌数仅为1.26X 18 cfu/mL.试验证明本发明的培养基及其发酵方法得到的酿酒酵母活菌数比现有技术提高了约7.3倍，实现了酿酒酵母菌的高密度发酵。
[0015]实施例2发酵培养基的配置和发酵结果对比
酿酒酵母高密度发酵培养基组成:按每升的比例，淀粉22g/L、蔗糖5g/L、牛肉膏1g/L、尿素10g/L、酵母提取物5g/L。
[0016]培养基配制方法如下:
按照培养基组成分别称取各组分，使用蒸馏水溶解；
将配置好的培养基装入发酵罐中，搅拌混匀，121°C灭菌15分钟；
为达到培养基的最佳效果，使用本培养基发酵酿酒酵母时，发酵过程如下:
高密度发酵主要步骤如下:
1)将冷冻保存的酿酒酵母菌在YEro琼脂平板上活化，挑取单菌接种于本培养基液体试管，25°C培养12小时后，以v/v计，1%转接于本培养基液体试管，培养12小时后作为种子培养基；
2)按照培养基配方配制酿酒酵母高密度发酵培养基4500ml装入发酵罐中，灭菌后将温度降至25 °C ；
3)以v/v计，按5%的接种量将得到的种子培养基接种于发酵罐中；
4)发酵条件设定为:温度25°C，转速300rpm，pH值6-6.5，通气量1.2:1。在此条件下发酵10-14小时，当pH降低时则自动加入碱性中和剂NaOH，泡沫过多时自动加入消泡剂吐温80 ；
5)当发酵液OD值在600nm波长下吸收值达到1.4之后2小时补料500ml。补料液的组成如下:淀粉100g/L、蔗糖25g/L、牛肉膏50g/L、尿素50g/L、酵母提取物25g/L。
[0017]本方法与现有技术的比较:对照试验培养基和发酵过程
1)对照试验采用的酵母浸出粉胨葡萄糖(YeastExtract Peptone Dextrose,YEF1D)培养基组成:酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L ；
2)将冷冻保存的酿酒酵母菌在YEH)琼脂平板上活化，挑取单菌接种于YEH)培养基液体试管，25°C培养12小时后，以v/v计1%转接于YEH)培养基液体试管，培养12小时后作为种子培养基；
3)配置YEro培养基4500ml装入发酵罐中，灭菌后将温度降至25°C ；
4)以v/v计5%的接种量将得到的种子培养基接种于发酵罐中；
5)发酵条件设定为:温度25°C，转速300rpm，pH值6-6.5，通气量1.2:1。在此条件下发酵20-24小时，当pH降低时则自动加入碱性中和剂NaOH，泡沫过多时自动加入消泡剂吐温80 ；
6)当发酵液OD值在600nm波长下吸收值达到1.4之后2.5小时补料500ml。补料液的组成如下:酵母膏50g/L,蛋白胨100g/L,葡萄糖100g/L。
[0018]7)继续发酵48小时，收取菌体。
[0019]应用本发明的培养基及其发酵方法，可以得到酿酒酵母活菌数达9.81 X 18 cfu/ml，菌体干重达到105 g/L。而对照组采用YEH)培养基及其发酵方法，得到的酿酒酵母活菌数仅为1.26X 18 cfu/mL.试验证明本发明的培养基及其发酵方法得到的酿酒酵母活菌数比现有技术提高了约6.8倍，实现了酿酒酵母菌的高密度发酵。
[0020]实施例3 发酵培养基的配置和发酵结果对比
1.酿酒酵母高密度发酵培养基组成:按每升的比例，淀粉18g/L、蔗糖5g/L、牛肉膏10g/L、尿素10g/L、酵母提取物5g/L。
[0021]2.培养基配制方法如下:
O按照培养基组成分别称取各组分，使用蒸馏水溶解；
2)将配置好的培养基装入发酵罐中，搅拌混匀，121°C灭菌15分钟；
为达到培养基的最佳效果，使用本培养基发酵酿酒酵母时，发酵过程如下:
1.高密度发酵主要步骤如下:
I)将冷冻保存的酿酒酵母菌在YEro琼脂平板上活化，挑取单菌接种于本培养基液体试管，25°C培养12小时后，以v/v计1%转接于本培养基液体试管，培养12小时后作为种子培养基；
2 )按照培养基配方配制酿酒酵母高密度发酵培养基4500 ml装入发酵罐中，灭菌后将温度降至25 °C ；
3)以v/v计5%的接种量将得到的种子培养基接种于发酵罐中；
4)发酵条件设定为:温度25°C，转速300rpm，pH值6-6.5，通气量1.2:1。在此条件下发酵10-14小时，当pH降低时则自动加入碱性中和剂NaOH，泡沫过多时自动加入消泡剂吐温80 ；
5)当发酵液OD值在600nm波长下吸收值达到1.4之后4小时补料500ml。补料液的组成如下:淀粉100g/L、蔗糖25g/L、牛肉膏50g/L、尿素50g/L、酵母提取物25g/L。
[0022]1.对照试验培养基和发酵过程
1)对照试验采用的酵母浸出粉胨葡萄糖(YeastExtract Peptone Dextrose,YEF1D)培养基组成:酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L ；
2)将冷冻保存的酿酒酵母菌在YEH)琼脂平板上活化，挑取单菌接种于YEH)培养基液体试管，25°C培养12小时后，以v/v计1%转接于YEH)培养基液体试管，培养12小时后作为种子培养基；
3)配置YEro培养基4500ml装入发酵罐中，灭菌后将温度降至25°C ；
4)以v/v计5%的接种量将得到的种子培养基接种于发酵罐中；
5)发酵条件设定为:温度25°C，转速300rpm，pH值6-6.5，通气量1.2:1。在此条件下发酵20-24小时，当pH降低时则自动加入碱性中和剂NaOH，泡沫过多时自动加入消泡剂吐温80 ；
6)当发酵液OD值在600nm波长下吸收值达到1.4之后2小时补料500ml。补料液的组成如下:酵母膏50g/L,蛋白胨100g/L,葡萄糖100g/L。
[0023]7)继续发酵48小时，收取菌体。
[0024]应用本发明的培养基及其发酵方法，可以得到酿酒酵母活菌数达9.95X 18 cfu/ml，菌体干重达到106 g/L。而对照组采用YEH)培养基及其发酵方法，得到的酿酒酵母活菌数仅为1.26X 18 cfu/ml。试验证明本发明的培养基及其发酵方法得到的酿酒酵母活菌数比现有技术提高了约6.9倍，实现了酿酒酵母菌的高密度发酵。
【权利要求】
1.一种饲料用酿酒酵母的高密度发酵培养基配方，其特征在于:培养基的主要成分和含量为:按每升计，淀粉18-22g/L、蔗糖5g/L、牛肉膏10g/L、尿素10g/L、酵母提取物5g/L，其余为水；发酵过程中的补料液主要成分和含量为:淀粉100g/L、蔗糖25g/L、牛肉膏50g/L、尿素50g/L、酵母提取物25g/L，其余为水。
2.一种饲料用酿酒酵母的高密度发酵方法，其特征在于:高密度发酵过程如下: 1)菌种活化:将冷冻保存的酿酒酵母菌cerevisiaeNDFJl2保藏编号CGMCC N0.9436，在YETO琼脂平板上活化，挑取单菌接种于如权利要求1所述的培养基液体试管，25°C培养12小时后，以v/v计1%转接于如权利要求1所述的培养基液体试管，培养12小时后作为种子培养基； 2)菌种培养:将活化的菌种接种于培养基，按培养基配方配制酿酒酵母高密度发酵培养基4500 ml装入发酵罐中，灭菌后将温度降至25°C ；以v/v计5%的接种量将种子培养基接种于发酵罐中； 3)发酵条件设定为:温度25°C，转速300rpm，pH值6-6.5，通气量1.2:1，在此条件下发酵20-24小时，当pH降低时则加入碱性中和剂NaOH调节，泡沫过多时加入5_8克消泡剂吐温80 ； 4)当发酵液OD值在600nm波长下吸收值达到1.4之后2_4小时补料500ml ； 5)继续发酵48小时，收取菌体。
3.—种饲料用酿酒酵母菌种，其特征在于:该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC N0.9436。
【文档编号】C12N1/16GK104403953SQ201410621690
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月7日 优先权日:2014年11月7日
【发明者】方俊, 符晨星, 卢向阳 申请人:湖南农业大学