一种副干酪乳杆菌直投式菌种中霉菌和酵母的定量检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种副干酪乳杆菌直投式菌种中霉菌和酵母的定量检测方法，属于微生物检验【技术领域】。该检测方法包括下述顺序的检验步骤：称取5g副干酪乳杆菌直投式菌种至盛有95g灭菌生理盐水的锥形瓶中，震荡2min后静置30min，制得1:20的样品匀液；取10g样品匀液通过孔径1um的滤膜进行第一次抽滤，滤膜放入20-50g无菌生理盐水中稀释，将稀释后的样品匀液全部通过孔径1um的滤膜进行第二次抽滤，同样进行第三次抽滤，最后按10倍递增稀释样品并倒无菌平板28±1℃培养5天计数。本发明定量检测的方法避免了直接用国标法检验由于受乳酸菌的影响，使检测结果更加准确。
【专利说明】一种副干酪乳杆菌直投式菌种中霉菌和酵母的定量检测方 法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物检验【技术领域】，具体涉及一种副干酪乳杆菌直投式菌种中霉菌 和酵母的检测方法。
【背景技术】
[0002] 直投式酸奶发酵剂（Directed Vat Set，DVS)是指一系列高度浓缩和标准化的冷 冻干燥发酵剂菌种，可直接加入到热处理的原料乳中进行发酵，而无需对其进行活化、扩培 等其它预处理工作。直投式发酵剂的活菌数一般为l〇 1(l-l〇12CFU/g，由于直投式发酵剂的活 力强、类型多，生产厂家可以根据需要任意选择，从而丰富了乳酸菌产品的品种。直投发酵 剂不需要扩大培养，可直接使用，产品质量相对稳定，成为目前大型乳品企业的首选。乳酸 菌直投式菌种基本是国外进口，有一百多年的生产历史，质量相对稳定，由于直投式菌种价 格相对较贵，打开后如不及时使用，会导致活力下降并且容易污染，故对乳酸菌直投式菌种 进厂检验相对较少，偶尔抽检一下活菌数，霉菌酵母含量直接用国标法检测，没有对直投式 菌种进行预处理，由于乳酸菌对霉菌酵母的抑制作用，检测结果不准确。在实际生产中，偶 尔有部分批次产品生产过程中产酸弱，同时伴随保质期过程有鼓盖现象，无法查找到产品 出质量问题的原因。目前国内对直投式菌种的研究论文有90多篇，基本围绕乳酸菌遗传稳 定性、传代培养、菌株选育、分离鉴定、生化特性等，而对直投式菌种纯度的定量检验方法没 有相应报道。
【发明内容】
[0003] 针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种副干酪乳杆菌直投式 菌种中霉菌和酵母的定量检测方法，主要解决直接用国标法检测会受稀释倍数、抑制作用 等因素的干扰而使检测结果有很大误差的问题。
[0004] 为实现上述发明目的，本发明是通过下述技术方案来实现的：一种副干酪乳杆菌 直投式菌种中霉菌和酵母的定量检测方法，其特征在于：包括下述顺序的检测步骤： (1)样品处理： A样品制备：称取5g副干酪乳杆菌直投式菌种至盛有95g灭菌生理盐水的锥形瓶中， 震荡2min后静置30min，制得1:20的样品匀液； B第一次抽滤：固定好滤器，将IOg上述步骤A制得的样品匀液通过孔径Ium的滤膜过 滤，然后将过滤好的滤膜放入20-50g灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振摇，制得第一次抽 滤后的样品勾液； C第二次抽滤：固定好滤器，将上述步骤B制得的第一次抽滤后的样品匀液全部通过 孔径Ium的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜放入20-50g灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振 摇，制得第二次抽滤后的样品匀液； D第三次抽滤：固定好滤器，将上述步骤C制得的第二次抽滤后的样品匀液全部通过 孔径Ium的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜放入计算好的灭菌生理盐水质量的锥形瓶中， 充分振摇，制成稀释度为IXKT2的样品匀液； E制备培养皿：取Ig上述步骤D制得的稀释度为I X KT2的样品匀液，注入9g灭菌生 理盐水的试管中，充分振摇，制得稀释度为IX KT3的样品匀液，按此操作程序，制备10倍系 列稀释样品匀液，每递增稀释1次，换用一次无菌吸管；在进行10倍递增稀释的同时，每个 稀释度分别吸取Ig样品匀液于2个无菌平皿，及时将15 - 20g冷却至46-50°C的孟加拉红 培养基倾注平皿，转动平皿使其混合均匀； (2) 培养：待琼脂凝固后，将平皿倒置，28±1°C培养5天，观察并记录； (3) 菌落计数及报告：选取菌落数在10-150CFU之间的平板进行计数，一个稀释度使用 两个平板，取两个平板菌落数的平均值，乘以稀释倍数报告。
[0005] 与现有技术相比，本发明具有的有益效果有： 1、本发明根据乳酸菌与霉菌酵母不同的形态大小，通过抽滤的微过滤形式，避免了 乳酸菌抑制霉菌酵母生长的干扰因素，使检测结果更加准确。酵母细胞的大小是（1-5) umX (5-30)um、霉菌孢子的大小是（2-10) um，副干酪乳杆菌直投式菌种由于采用冷冻真空 干燥工艺，菌株宽度一般小于lum。根据不同菌株分子大小不同的特性，通过Ium微膜抽滤 将副干酪乳杆菌和霉菌酵母分离开，即霉菌和酵母留在滤膜上，副干酪乳杆菌分离在滤液 中。
[0006] 2、本发明通过定量检验，首次将直投式菌种中是否有霉菌和酵母检测出来，避免 了副干酪乳杆菌对检测过程的干扰。
[0007] 3、本发明的实施将有效的控制国外进口直投式菌种的产品质量，保证乳酸菌发酵 产品在生产过程中的稳定性，同时避免了产品保质期发生鼓盖的质量问题。
【具体实施方式】
[0008] 下面通过实施例对本发明作进一步的说明，但不限于该实施例。
[0009] 实施例1 一种副干酪乳杆菌直投式菌种样品中霉菌和酵母的检测方法，其特征在于：包括下述 顺序的工艺步骤： A样品制备：称取5g副干酪乳杆菌直投式菌种至盛有95g灭菌生理盐水的锥形瓶中， 先用拍击式震荡器震荡2min，后在无菌环境中静置30min，制得质量比为1:20的样品匀 液； B第一次抽滤：首先用无菌镊子夹起灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌 的滤床上，固定好滤器，取IOg上述步骤A制得的样品匀液，通过孔径Ium的滤膜过滤，然后 将过滤好的滤膜放入20g灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振摇，制得第一次抽滤后的样品 匀液； C第二次抽滤：固定好滤器，取上述步骤B制得第一次抽滤后的样品匀液，通过孔径 Ium的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜放入20g灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振摇，制得 第二次抽滤后的样品匀液； D第三次抽滤：固定好滤器，取上述步骤C制得第二次抽滤后的样品匀液，通过孔径 Ium的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜放入49. 2g灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振摇，制 得稀释度为IX 1(Γ2的样品匀液； E制备培养皿：取Ig上述步骤D制得的稀释度为IX KT2的样品匀液，注入9g灭菌生 理盐水的试管中，充分振摇，制得IX KT3稀释度的样品匀液，按此操作程序，制备10倍系列 稀释样品匀液，每递增稀释1次，换用一次无菌吸管；在进行10倍递增稀释的同时，每个稀 释度分别吸取Ig样品匀液于2个无菌平皿，同时分别取Ig样品稀释液加入2个无菌平皿 作空白对照，及时将15 - 20g冷却至46-50°C的孟加拉红培养基倾注平皿，转动平皿使其混 合均匀； (2 )培养：待琼脂凝固后，将平皿倒置，28 ± I °C培养5天，观察并记录。
[0010] (3)菌落计数及报告：肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉 菌和酵母数目，以菌落形成单位CFU表示；选取菌落数在10-150CFU之间的平板进行计数， 一个稀释度使用两个平板，取两个平板菌落数的平均值，乘以稀释倍数报告。菌落数计数结 果见表1。
[0011] 对比例A 一种副干酪乳杆菌直投式菌种样品中霉菌和酵母的国标检测法，包括下述顺序的步 骤： (1)在100级的洁净工作台进行过滤操作，称取IOg副干酪乳杆菌直投式菌种至盛有 90g灭菌生理盐水的锥形瓶中，用拍击式震荡器震荡2min，后在无菌环境中静置30min，制 得质量比为1:10的样品匀液。
[0012] (2)取Ig步骤（1)制得的1:10样品匀液，注入9g灭菌生理盐水的试管中，充分振 摇，制得1:100的稀释液，按此操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释1次，换 用一次无菌吸管；根据对样品污染状况的估计，选择IX 1〇_2、IX 1〇_3、IX 1〇_4、IX 1〇_5稀释 度的样品匀液，每个稀释度分别吸取Ig样品匀液于2个无菌平皿，同时分别取Ig稀释液加 入2个无菌平皿作空白对照，及时将15 - 20g冷却至46-50°C的孟加拉红培养基倾注平皿， 转动平皿使其混合均匀。
[0013] (3)培养、菌落计数及报告均同实施例1，菌落数计数结果见表1。
[0014] 对比例B 一种副干酪乳杆菌直投式菌种样品中霉菌和酵母的对照检测法，包括下述顺序的步 骤： (1)在100级的洁净工作台进行过滤操作，称取IOg副干酪乳杆菌直投式菌种至盛有 90g灭菌生理盐水的锥形瓶中，用拍击式震荡器震荡2min，后在无菌环境中静置30min，制 得质量比为1:10的样品匀液。
[0015] (2)第一次抽滤：首先用无菌镊子灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭 菌的滤床上，固定好滤器，取IOg上述步骤（1)制得的样品匀液通过孔径Ium的滤膜过滤， 然后将过滤好的滤膜放入99. Ig灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振摇，制得第一次抽滤后 稀释度为IX KT2的样品匀液。
[0016] (3)第二次抽滤：同样固定好滤器，取IOg上述步骤（2)制得的第一次抽滤后的样 品匀液，通过孔径Ium的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜放入99. 3g灭菌生理盐水的锥形瓶 中，充分振摇，制得第二次抽滤后释度为IX KT3的样品匀液。
[0017] (4)固定好滤器，取IOg上述步骤（3)制得第二次抽滤后的样品匀液通过孔径Ium 的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜放入99. 4g灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振摇，制得释 度为IXKT4的样品匀液。
[0018] (5)取Ig上述步骤（4)制得稀释度为I X KT4的样品匀液，注入9g灭菌生理盐水 的试管中，充分振摇，制得IX 1〇_5稀释度的样品匀液，按此操作程序，制备10倍系列稀释样 品匀液，每递增稀释1次，换用一次无菌吸管；选择IX 1〇_2、IX 1〇_3、IX 1〇_4、IX 1〇_5稀释度 的样品匀液，每个稀释度分别吸取Ig样品匀液于2个无菌平皿，同时分别取Ig样品稀释液 加入2个无菌平皿作空白对照，及时将15 - 20g冷却至46-50°C的孟加拉红培养基倾注平 皿，转动平皿使其混合均匀。
[0019] (6)培养、菌落计数、结果报告都同实施例1，菌落数计数结果见表1。 表1 :不同稀释度样品培养出的霉菌和酵母菌落数计数结果
【权利要求】
1. 一种副干酪乳杆菌直投式菌种中霉菌和酵母的定量检测方法，其特征在于：包括下 述顺序的检测步骤： (1) 样品处理： A样品制备：称取5g副干酪乳杆菌直投式菌种至盛有95g灭菌生理盐水的锥形瓶中， 震荡2min后静置30min，制得1:20的样品匀液； B第一次抽滤：固定好滤器，将IOg上述步骤A制得的样品匀液通过孔径Ium的滤膜过 滤，然后将过滤好的滤膜放入20-50g灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振摇，制得第一次抽 滤后的样品勾液； C第二次抽滤：固定好滤器，将上述步骤B制得的第一次抽滤后的样品匀液全部通过 孔径Ium的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜放入20-50g灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振 摇，制得第二次抽滤后的样品匀液； D第三次抽滤：固定好滤器，将上述步骤C制得的第二次抽滤后的样品匀液全部通过 孔径Ium的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜放入计算好的灭菌生理盐水质量的锥形瓶中， 充分振摇，制成稀释度为IXKT 2的样品匀液； E制备培养皿：取Ig上述步骤D制得的稀释度为I X KT2的样品匀液，注入9g灭菌生 理盐水的试管中，充分振摇，制得稀释度为I X KT3的样品匀液，按此操作程序，制备10倍系 列稀释样品匀液，每递增稀释1次，换用一次无菌吸管；在进行10倍递增稀释的同时，每个 稀释度分别吸取Ig样品匀液于2个无菌平皿，及时将15 - 20g冷却至46-50°C的孟加拉红 培养基倾注平皿，转动平皿使其混合均匀； (2)培养：待琼脂凝固后，将平皿倒置，28±1°C培养5天，观察并记录； (3)菌落计数及报告：选取菌落数在10-150CFU之间的平板进行计数，一个稀释度使用 两个平板，取两个平板菌落数的平均值，乘以稀释倍数报告。
【文档编号】C12Q1/06GK104313113SQ201410639028
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年11月13日 优先权日:2014年11月13日
【发明者】董雪凤, 杨子彪, 赵旭燕 申请人:云南皇氏来思尔乳业有限公司