测定癌症对表皮生长因子受体靶向性治疗反应性的方法

测定癌症对表皮生长因子受体靶向性治疗反应性的方法
【专利摘要】本发明涉及测定癌症对表皮生长因子受体靶向性治疗反应性的方法。本发明涉及癌症对表皮生长因子受体(EGFR)治疗的反应性的方法。在优选的实施方案中，在erbB1基因的激酶结构域中的至少一个变异的存在赋予对酪氨酸激酶抑制剂gefitinib的敏感性。因而，对于这些突变的诊断测定将允许向那些最有可能对药物起反应的患者施用gefitinib、erlotinib和其它酪氨酸激酶抑制剂。
【专利说明】测定癌症对表皮生长因子受体靶向性治疗反应性的方法
[0001] 本申请是申请日为2005年3月31日，申请号为201210028631. 5的、发明名称和 本发明相同的发明专利申请的分案申请。
[0002] 对相关申请的交叉参考
[0003] 本申请在35U.S.C. 119(e)之下要求递交于2004年3月31日的美国临时申请系列 号：60/558, 218,递交于2004年4月9日的美国临时申请系列号：60/561, 095,递交于2004 年4月27日的美国临时申请系列号：60/565, 753,递交于2004年4月27日的美国临时申 请系列号：60/565, 985,递交于2004年5月25日的美国临时申请系列号：60/574, 035,递交 于2004年6月7日的美国临时申请系列号：60/577,916和递交于2004年7月29日的美 国临时申请系列号：60/592, 287的权益，在此将其内容全部并入作为参考。
[0004] 政府支持
[0005] 本发明由国立卫生研宄院（NIH)奖助金号ROl CA 092824, P50CA 090578, POl 95281，和1K12CA87723-01支持，美国政府具有其某些权益。

【技术领域】 [0006] 和【背景技术】
[0007] 上皮细胞癌症，例如，前列腺癌、乳癌、结肠癌、肺癌、胰癌、卵巢癌、脾癌、睾丸癌、 胸腺癌等，是特征为上皮细胞异常、加速生长的疾病。这种加速的生长最初引发肿瘤形成。 最后，还能够发生向不同器官位点的转移。尽管已经在各种癌症的诊断和治疗上取得了一 些进展，但这些疾病仍然导致显著的死亡率。
[0008] 肺癌是工业化国家中主要的癌症死亡原因。根据细胞在显微镜下如何显现，将在 肺中开始的癌症分成两种主要类型，非小细胞肺癌和小细胞肺癌。非小细胞肺癌（鳞状细 胞癌，腺癌，和大细胞癌）一般比小细胞肺癌更慢地传播到其它器官。大约75%的肺癌病例 被分类为非小细胞肺癌（例如，腺癌），而其它25%为小细胞肺癌。非小细胞肺癌（NSCLC) 是在美国、日本和西欧癌症死亡的主要原因。对于患有进行性疾病的患者来说，化疗在存活 上提供了最适度的益处，但代价是显著的毒性，这强调了对治疗剂的需要，所述治疗剂特异 性靶向脂导肿瘤生长的关键遗传损伤（Schiller JH等，N Engl J Med，346:92-98, 2002)。
[0009] 表皮生长因子受体（EGFR)是170千道尔顿（kDa)的膜结合蛋白，其表达于上皮 细胞的表面上。EGFR是蛋白质酪氨酸激酶的生长因子受体家族的成员，所述激酶是一类 细胞周期调控分子（W. J. Gullick 等，1986, Cancer Res.，46 :285-292)。EGFR 当它的配体 (EGF或TGF- α )结合细胞外结构域时被激活，导致受体细胞内酪氨酸激酶结构域的自体磷 酸化（S. Cohen 等，1980, J. Biol. Chem.，255 :4834-4842 ;Α· Β. Schreiber 等，1983, J. Biol. Chem. ，258 :846-853)。
[0010] EGFR是促进生长的癌基因，erbB或ErbBl的蛋白产物，但是该基因是一种家 族的成员，即原癌基因的ERBB家族，其据信在许多人类癌症的发生和发展中发挥重要作 用。特别地，已经在乳腺、膀胱、肺、头、颈和胃癌以及胶质母细胞瘤中观察到EGFR表达的 提高。癌基因的ERBB家族编码四种，结构相关的跨膜受体，g卩，EGFR，HER-2/neu(erbB2)， HER-3 (erbB3)和HER-4 (erbB4)。临床上，已经报道肿瘤中的ERBB癌基因扩增和/或受 体过表达与疾病复发和患者不良预后，以及与治疗中的反应性有关（LHarris等，1999， Int.J. Biol. Markers，14 :8_15;和 J. Mendelsohn 和 J.Baselga，2000，Oncogene，19: 6550-6565)。
[0011] EGFR由三个主要结构域组成，g卩，细胞外结构域（E⑶），其被糖基化并且包含配 体结合性穴和两个半胱氨酸富集区；一个短的跨膜结构域，和一个具有固有酪氨酸激酶 活性的细胞内结构域。所述跨膜区将配体结合结构域连接到细胞内结构域上。氨基酸和 DNA序列分析，以及EGFR的非糖基化形式的研宄表明EGFR的蛋白质主链具有132kDa的 质量，具有1186个氨基酸残基氨基酸残基（A.L. Ullrich等，1984, Nature，307 :418-425 ; J. Downward 等，1984，Nature，307 :521-527 ;C. R. Carlin 等，1986，Mol. Cell. Biol.，6 : 257-264 ;和 F. L. V. Mayes 和 M. D. Waterfield，1984, The EMBO J.，3 :531-537)。
[0012] EGF或TGF-α与EGFR结合激活信号转导途径并导致细胞增殖。EGFR的二聚体 化，构象变化以及内化作用作用来传递细胞同信号，导致细胞生长调控（G. Carpenter和 S. Cohen，1979, Ann. Rev. Biochem.，48 :193-216)。影响生长因子受体功能，或导致受体和 /或配体过表达的遗传变化导致细胞增殖。此外，已经确定EGFR在细胞分化、细胞运动性 增强，蛋白质分泌，新血管形成，入侵，转移和癌细胞对化疗剂和放射的耐受性中发挥作用。 (M. -J. Oh 等，2000, Clin. Cancer Res.，6 :4760-4763) 〇
[0013] 已经鉴定了多种EGFR的抑制剂，包括多种已经进行临床试验用于治疗各种癌症。 近期的概述，见 de Bono, J.S.和 Rowinsky，E.K. (2002)，" The ErbB receptor Family: A Therapeutic Target For Cancer" , Trends in Molecular Medicine，8, S 19-26。
[0014] 在癌症的治疗中对于治疗性干预有希望的一组革E标包括HER-激酶axis的成员。 它们在实体上皮肿瘤，例如，前列腺、肺和乳腺肿瘤中经常上调，并且在胶质母细胞瘤中也 上调。表皮生长因子受体（EGFR)是HER-激酶axis的成员，并且已经是开发几种不同癌症 疗法的靶标选择。EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs)是这些疗法之一，因为酪氨酸残基 的可逆性磷酸化是EGFR途径激活所必需的。换句话说，EGFR-TKIs阻抑对促进和/或维持 细胞信号途径负责的细胞表面受体，所述信号途径诱导肿瘤细胸生长和分裂。具体地，据信 这些抑制剂干扰EGFR激酶结构域，称为HER-I。更有希望的EGFR-TKIs为三个系列的化合 物：喹唑啉类、吡啶并嘧啶类和吡咯并嘧啶类。
[0015] 在临床开发中两种更先进的化合物包括Gefitinib (由AstraZeneca UK Ltd.开 发的化合物 ZD1839 ;商品名 IRESSA ;下文为"IRESSA")和 Erlotinib (由 Genentech， Inc. and OSI Pharmaceuticals，Inc.开发的化合物 0SI-774 ;商品名 TARCEVA ;下文 为"TARCEVA");二者都产生了令人鼓舞的临床结果。用IRESSA和TARCEVA进行常规的 癌症治疗都包括每天口服不超过500mg的各自化合物。在2003年5月，当IRESSA被批准 用于治疗晚期非小细胞肺癌患者时，它在这些产品中成为第一个进入美国市场的。
[0016] IRESSA是一种口服活性喹唑啉，其通过直接抑制EGFR分子上的酪氨酸激酶磷酸 化而起作用。它竞争三磷酸腺苷（ATP)结合位点，导致HER-激酶axis的抑制。IRESSA反 应的确切机制并不完全清楚，不过，研宄提示EGFR的存在是其作用的必要条件。
[0017] 在使用这些化合物中的显著限制是其受体在他们开始对治疗反应后可能会发展 出对它们的治疗效果的耐受性，或者他们可能在任何可测量的程度上完全不对EGFR-TKIs 反应。事实上，只有10-15%的晚期非小细胞肺癌患者对EGFR激酶抑制剂反应。因而， 在靶向性治疗中对于那些最可能受益于这种治疗的个体来说更好地理解在对IRESSA和 TARCEVA的敏感性之下的分子机制将是极其有益的。
[0018] 本领域明显需要癌症的令人满意的治疗，特别是上皮细胞癌症如肺、卵巢、乳腺、 脑、结肠和前列腺癌症，其并入了 TKI治疗的益处并克服了由患者展现的无反应性。这种治 疗能够对个体的健康具有戏剧性的影响，特别是癌症特别常见的老人。


【发明内容】

[0019] 酪氨酸激酶抑制剂（TKI)疗法如gefitinib ( IRESSA? )在大多数爱上述癌症 影响的个体中并不有效。本发明人令人吃惊地发现EGFR激酶结构域躯体变异的存在基本 上提高了 EGFR对TKI如IRESSA，TARCEVA的敏感性。例如小于30%的患有这种癌症的患者 易受由目前TKIs进行的治疗的影响，而大于50%，更优选60, 70,80,90%的具有EGFR激酶 结构域突变的患者是易受影响的。此外，这些突变赋予EGFR提高的激酶活性。因而，具有 这些突变的患者将可能对目前的酪氨酸激酶抑制剂（TKI)疗法，例如，gefitinib有反应。
[0020] 因此，本发明提供一种确定在受癌症影响的人类患者中表皮生长因子受体（EGFR) 靶向性治疗有效性的可能性的新方法。该方法包括相对于野生型erbBl基因检测所述患 者的erbBl基因的激酶结构域中的至少一种核酸变异的存在或缺失。至少一种变异的存 在表示EGFR靶向性治疗可能有效。优选地，所述核苷酸变异提高EGFR的激酶活性。随后 可以用EGFR靶向性治疗来治疗所述患者。在本发明的一个实施方案中，所述EGFR靶向性 治疗是酪氨酸激酶抑制剂。在优选的实施方案中，所述酪氨酸激酶抑制剂是苯氨基喹唑 啉。所述苯氨基喹唑啉可以是合成的苯氨基喹唑啉。优选地，所述合成的苯氨基喹唑啉为 gefitinib或erlotinib。在另一个实施方案中，所述EGFR革巴向性治疗是不可逆的EGFR 抑制剂，包括4-二甲基氨基-but-2-烯酸[4-(3-氯-4-氟-苯氨基）-3-氰基-7-乙氧 基-喹啉-6-基]-酰胺（"EKB-569"，有时称作"EKI-569"，见例如 W0/2005/018677 和 Torrance 等，Nature Medicine，vol. 6，No. 9，Sept. 2000，P. 1024)和 / 或 HKI-272 或 HKI-357(Wyeth;见Greenberger等，Proc. Ilth NCI EORTC-AACR Symposium on New Drugs in Cancer Therapy,Clinical Cancer Res. Vol. 6Supplement,Nov. 2000,ISSN 1078-0432； in Rabindran 等，Cancer Res. 64 :3958-3965 (2004) ;Holbro and Hynes，Ann. Rev. Pharm. Tox. 44 :195-217(2004) ;Tsou 等，j. Med. Chem.2005,48, 1107-1131 ;and Tejpar 等， J. Clin.Oncol. ASCO Annual Meeting Proc. Vol. 22, No. 14S :3579 (2004))。
[0021] 在本发明的一个实施方案中，所述EGFR获自有或处于发生癌症危险中的患者的 生物样品。EGFR(或erbBl基因）激酶结构域中的变异影响ATP结合口袋的构象结构。优 选地，EGFR激酶结构域中的变异是框内删除或外显子18、19、20或21中的取代。
[0022] 在一个实施方案中，所述框内删除在EGFR(erbBl)的外显子19中。优选地所述外 显子19中的框内删除在删除处至少由密码子747, 748, 749,和750上的氨基酸亮氨酸、精 氨酸、谷氨酸和丙氨酸组成。在一个实施方案中，所述框内删除包含核苷酸2235-2249并删 除氨基酸746-750 (序列谷氨酸，亮氨酸，精氨酸，谷氨酸和丙氨酸），见表2,表S2,图2B，图 4A，图5,图6C，和图8C。在另一个实施方案中，所述框内删除包含核苷酸2236-2250并删除 氨基酸氨基酸746-750,见表S2,图5,和图6C。或者，所述框内删除包含核苷酸2240-2251， 见表2,图2C，图4A，图5,或核苷酸2240-2257,见表2,表S3A，图2A，图4A，图5,图6C，和 图8E。或者，所述框内删除包含核苷酸2239-2247与在核苷酸2248上的半胱氨酸对鸟嘌 呤的取代，见表S3A和图8D，或核苷酸2238-2255的删除和核苷酸2237上的胸腺嘧啶对 腺嘌呤的取代，见表S3A和图8F，或核苷酸2254-2277的删除，见表S2 (SEQ ID NO :437)。 或者，所述删除包含核苷酸 2239-2250delTTAAGAGAAGCA(SEQ ID N0:554) ;2251A>C，或 2240-2250delTAAGAGAAGCA(SEQ ID N0:720)，或 2257-2271delCCGAAAGCCAACAAG(SEQ ID NO :721)，如表S3B中所示。
[0023] 在另一个实施方案中，所述取代在EGFR的外显子2中。所述外显子2中的取代包 含至少一个氨基酸。在一个实施方案中，所述外显子2中的取代在核苷酸2573上包含一个 鸟嘌呤对胸腺嘧啶的取代，见图4A和图5。这种取代导致氨基酸取代，其中野生型亮氨酸 在氨基酸858上被精氨酸所替换，见图5,表2,表S2,表S3A，图2D，图6A，图8B，和SEQ ID NO :512。或者，所述外显子2中的取代在核苷酸2582上包含一个腺嘌呤对胸腺嘧啶的取 代，见图4A和图5。这种取代导致了氨基酸取代，其中野生型亮氨酸在氨基酸861上被谷 氨酰胺所替换，见图5 (分别是SEQ ID NOS 740-762,以出现的顺序），表2 (分别是SEQ ID NOS 730-739,以出现的顺序），图2E，表S3B(分别是SEQ ID NOS 554&720-729,以出现的顺 序），和 SEQ ID NO :512。
[0024] 所述取代还可以在EGFR的外显子18中。在一个实施方案中，所述外显子18中的 取代是在核苷酸2155上胸腺嘧啶对鸟嘌呤的取代，见图4A和图5。这种取代导致了氨基酸 取代，其中野生型甘氨酸在密码子719上被半胱氨酸所取代，见图5, SEQ ID NO :512。在另 一个实施方案中，所述外显子18中的取代是在核苷酸2155上腺嘌呤对鸟嘌呤的取代，导致 氨基酸取代，其中野生型甘氨酸在密码子719上被丝氨酸所取代，见表S2,图6B，图8A，图5 和 SEQ ID NO :512。
[0025] 在另一个实施方案中，所述取代是在如图5所示的核苷酸2316之后和核苷酸2317 之前鸟嘌呤，鸟嘌呤和胸腺嘧啶（GGT)的插入（23162317ins GGT)。这也可以描述为缬氨酸 (V)在氨基酸772上的插入（P772_H733insV)。其它的突变显示于表S3B中并包括，例如， 在如图5所示的的核苷酸2309之后和核苷酸2310之前CAACCCGG的插入和在如图5所示 的的核苷酸2311之后和核苷酸2312之前GCGTGGACA的插入。所述取代还可以在外显子20 中并且在一个实施方案中为在核苷酸2334和2335上的AA对于GG的取代，见表S3B。
[0026] 总之，在优选的实施方案中，erbBl基因的核酸变异是在如图5所示的核苷酸 2155上胸腺嘧啶对鸟嘌呤或腺嘌呤对鸟嘌呤的取代，在如图5所示的核苷酸2235-2249， 2240-2251，2240-2257, 2236-2250, 2254-2277,或 2236-2244 的删除，在如图 5 所示的核苷 酸2316之后和在核苷酸2317之前核苷酸鸟嘌呤，鸟嘌呤，和胸腺嘧啶（GGT)的插入，以及 在如图5所示的核苷酸2573上鸟嘌呤对胸腺嘧啶或在2582上腺嘌呤对胸腺嘧啶的取代。
[0027] 通过扩增编码受体的核酸片段可以测定至少一个核酸变异的存在或缺失的检测。 待扩增的片段为1000核苷酸长，优选地，500核苷酸长，最优选100核苷酸长或更小。待扩 增的片段可以包括多种变异。
[0028] 在另一个实施方案中，至少一个核酸变异的存在或缺失的检测提供了将包含变异 位点的EGFR核酸与至少一种核酸探针接触。所述探针优选地与包括变异位点并且在变异 位点包含互补核苷酸的核酸序列在选择性杂交条件下杂交。杂交可以用可检测的标记进行 检测。
[0029] 在又一个实施方案中，至少一个核酸变异的存在或缺失的检测包括对至少一个核 酸序列进行测序并将获得的序列与已知的erbBl核酸序列比较。或者，至少一个核酸变异 的存在或缺失包含至少一个核酸序列的质谱测定。
[0030] 在优选的实施方案中，至少一个核酸变异的存在或缺失的检测包括进行聚合酶链 式反应（PCR)。扩增包含假定变异的erbBl核酸序列并测定扩增的核酸的核苷酸序列。测 定扩增的核酸的核苷酸序列包括对至少一个核酸片段进行测序。或者，通过利用任何能够 根据其大小分离扩增产物的方法，包括自动的和手动的凝胶电泳等等可以分析扩增产物。
[0031] 或者，至少一个核酸变异的存在或缺失的检测包括测定基因中多种变异的单倍 型。
[0032] 在另一个实施方案中，通过分析erbBl基因产物（蛋白质）t可以检测EGFR变异 的存在或缺失。在这种实施方案中，使用特异性结合变异EGFR的探针。在优选的实施方案 中，所述探针是优选结合到变异EGFR上的抗体。变异EGFR的存在预示着EGFR靶向性治疗 有效的可能性。或者，所述探针可以是抗体片段，嵌合性抗体，人源化抗体或适体。
[0033] 本发明进一步提供一种探针，其在选择性结合条件下特异性结合到在EGFR基因 (erbBl)中包含至少一个核酸变异的核苷酸序列上。在一个实施方案中，所述变异是在 erbBl的激酶结构域中的突变，其赋予ATP结合性口袋的结构变化。
[0034] 本发明的探针可以包含大约500个核苷酸碱基的核苷酸序列，优选大约100个核 苷酸碱基，最优选大约50个核苷酸碱基或大约25个核苷酸碱基或更小的长度。所述探针 可以由DNA，RNA，或肽核酸（PNA)组成。另外，所述探针可以包含可检测的标记，如例如，荧 光或酶学标记。
[0035] 本发明另外提供一种在受癌症影响的患者中测定表皮生长因子受体（EGFR)靶向 性治疗有效的可能性的新方法。所述方法包括测定来自患者的生物样品中的EGFR的激酶 活性。与正常对照相比，在用EGFR配体刺激之后激酶活性的提高表明EGFR靶向性治疗很 可能是有效的。
[0036] 本发明进一步提供一种治疗具有或处于形成癌症的危险之中的患者的新方法。所 述方法包括确定患者的EGFR的激酶结构域是否包含至少一种核酸变异。优选地，EGFR位 于肿瘤或癌症的位点上并且所述核酸变异是躯体性的。这种变异的存在表示EGFR靶向性 治疗将是有效的。如果所述变异存在，向患者施用酪氨酸激酶抑制剂。
[0037] 如上，向经鉴定的患者施用的酪氨酸激酶抑制剂可以是苯氨基喹唑啉或不可逆的 酪氨酸激酶抑制剂，如例如，EKB-569, HKI-272和/或HKI-357 (Wyeth)。优选地，所述苯氨 基喹挫啉是合成的的苯氨基喹挫啉并且最优选地所述合成的的苯氨基喹挫啉是gefitinib 和 erlotinib。
[0038] 要通过本发明的方法治疗的癌症包括，例如，但不限于，胃肠癌、前列腺癌、卵巢 癌、乳癌、头颈癌、肺癌、非小细胞肺癌、神经系统癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、胰癌、生 殖-泌尿系统癌和膀胱癌。在优选的实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌。
[0039] 还包括实施本发明的PCR方法的试剂盒。所述试剂盒包括至少一对设计来退火到 基因边界核酸区上的简并引物对，所述基因编码EGFR激酶结构域的ATP结合口袋。此外， 所述试剂盒包含实施PCR扩增所必需的产品和试剂，以及说明书。
[0040] 在优选的实施方案中，包含在试剂盒中的引物对选自SEQ ID NO :505, SEQ ID NO: 506，SEQ ID N0:507,和SEQ ID N0:508。在实施例中的表6和7中列出的引物也是优选 的。
[0041] 在又一个实施方案中，本发明公开了一种选择化合物的方法，所述化合物抑制变 异表皮生长因子受体（EGFR)的催化性激酶活性。作为第一步，将变异EGFR与可能的化合 物接触。随后检测所述变异EGFR得到的激酶活性并选择抑制变异EGFR的激酶活性的化合 物。在一个实施方案中，所述变异EGFR包含在细胞中。
[0042] 还可以使用所述方法选择变异EGFR的激酶活性的化合物，所述变异EGFR在激酶 结构域中具有次发突变，其赋予对TKI，例如gefitinib或erlotinib的耐受性。
[0043] 在一个实施方案中，对所述变异EGFR进行标记。在另一个实施方案中，将EGFR结 合到固体支持物上。在优选的实施方案中，所述固体支持物是蛋白质芯片。
[0044] 在本发明的又一个实施方案中，公开了一种抑制变异表皮生长因子受体（EGFR) 的催化性激酶活性的药物组合物。抑制变异EGFR的催化剂激酶活性的化合物选自抗体、抗 体片段、小分子、肽、蛋白质、反义核酸、核酶、PNA、siRNA、寡核苷酸适体，和肽适体。
[0045] 还公开了一种治疗患有EGFR介导性疾病的患者的方法。按照该方法，对患者施用 抑制变异表皮生长因子受体（EGFR)的催化性激酶活性的药物组合物。
[0046] 在一个实施方案中，所述EGFR介导性疾病是癌症。在优选的实施方案中，所述癌 症是上皮起源的。例如，所述癌症是胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳癌、头颈癌、肺癌、非小细 胞肺癌、神经系统癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、胰癌、生殖 _泌尿系统癌和膀胱癌。在 优选的实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌。
[0047] 在另一个实施方案中，公开了一种预测在erbBl基因的激酶结构域中获得次发突 变（或选择突变）的方法。将表达erbBl的变异形式的细胞与有效的，然而是亚致死剂量 的酪氨酸激酶抑制剂接触。选择抗酪氨酸激酶抑制剂生长阻滞作用的细胞并对erbBl核酸 分析erbBl激酶结构域中其它突变的存在。在一个实施方案中，所述细胞是体外的。在另 一个实施方案中，所述细胞获自转基因动物。在一个实施方案中，所述转基因动物是小鼠。 在此小鼠模型中，待研宄的细胞获自肿瘤活检组织。通过本发明选择的在erbBl激酶结构 域中包含次发突变的细胞可以用在以上方法中以选择化合物，所述化合物抑制在激酶结构 域中具有次发突变的变异EGFR的激酶活性。
[0048] 在预测在erbBl基因的激酶结构域中获得次发突变的另一个实施方案中， 首先将表达erbBl基因变异形式的细胞与效量的诱变剂接触。所述诱变剂是，例 如，甲磺酸乙酯（EMS)，N-乙基-N-亚硝基脲（ENU)，N-甲基-N-亚硝基脲（MNU)， phocarbaxine hydrochloride (Prc)，甲横酸甲醋（MeMS)，苯丁 酸氣芥（Chl)，美法仑， porcarbazine hydrochloride，环磷酰胺（Cp)，硫酸二乙醋（Et2SO4),丙稀酰胺单体（AA)， 三亚乙基密胺（TEM)，氮芥，长春新碱，二甲基亚硝胺，N-甲基-N'-硝基-亚硝基胍 (MNNG)，7,12二甲基苯并（a)蒽（DMBA)，环氧乙烧，六甲基磷酰胺，bisulfan，或ethyl methanesulforate (EtMs)。随后将细胞与有效的，但亚致死剂量的酪氨酸激酶抑制剂接触。 选择抗酪氨酸激酶抑制剂生长阻滞作用的细胞并对erbBl核酸分析erbBl激酶结构域中其 它突变的存在。

【专利附图】

【附图说明】
[0049] 图1A-1B显示在顽固性非小细胞肺癌（NSCLC)中Gefitinib反应的代表性图示。 病例6的胸腔CT扫描（表I)，显示（图1A)用gefitinib治疗前在右肺中的大的质量，（图 1B)在开始Gefitinib治疗后的六周出现显著的改善。
[0050] 图2显示Gefitinib反应性肿瘤中的EGFR突变。
[0051] 图2A-2C显示肿瘤样本中EGFR基因的核苷酸序列，在激酶结构域内具有杂合的框 内删除（双峰）（出现顺序分别为SEQ ID N0S643-644和690-699)。在有义和反义方向的 追踪显示证明了删除的两人断裂点；野生型核苷酸序列以大写字母显示，而突变序列以小 写字母显示。delL747-T751insS突变的Y断裂点的前面为T-C取代，其并不改变编码的 氨基酸。
[0052] 图2D和图2E显示杂合的错义突变（箭头），导致在酪氨酸激酶结构域内的氨基酸 取代（SEQ ID NOS 701&703)。双峰代表杂合突变位点上的两个核苷酸。为了进行比较，还 显示了相应的野生型序列（SEQ ID NOS 700&702)。
[0053] 图2F是二聚EGFR分子被EGF配体结合的流程图。突出了细胞外结构域（包含两 种受体配体[L]-结构域和furin-like结构域），跨膜区，和细胞质结构域（包含催化性激 酶结构域）。指出了用途受体激活标记的自体磷酸化位点的酪氨酸 1CI68(Y-1068)的位置，以 及由EGFR自体磷酸化激活的下游效应剂（STAT3，MAP激酶（MAPK)，和AKT)。显示了肿瘤相 关突变的定位，都在酪氨酸激酶结构域中。
[0054] 图3表明突变EGFR的增强的EGF依赖型激活和突变EGFR对Gefitinib提高的敏 感性。
[0055] 图3A显示野生型EGFR相比，在添加 EGF到血清饥饿细胞中后delL747-P753insS 和L858R突变体的配体诱导的激活时间过程。EGFR自体磷酸化被用作受体激活的标记，与 Cos-7细胞中表达的EGFR总体水平（对照；右板）相比，使用用特异性识别EGFR的磷酸化 酪氨酸1(168残基的抗体的蛋白质印迹（左板）。在加入EGF(10ng/ml)的时间间隔上测量 EGFR的自体磷酸化。
[0056] 图3B是野生型和突变型受体磷酸化作用的EGF诱导的图示（见版A)。利用NIH 图像软件对来自三个独立实验的放射自显影进行量化；将EGFR磷酸化作用的强度规格化 为总体蛋白质表达，并显示为受体的百分比激活，带有标准偏差。
[0057] 图3C显示由Gefitinib产生的EGFR激活的剂量依赖型抑制。通过表达野生型 或突变型受体的Cos-7细胞的蛋白质印迹分析证明EGFR的酪氨酸 1(168的自体磷酸化，并用 100ng/ml的EGF刺激30min。如所示对细胞不处理（U)或用提高浓度的Gefitinib预处理 3hrs (左板）。表达的EGFR蛋白总量显示为对照（右板）。
[0058] 图3D显示来自对图版3C所述的两种实验的结果的量化（NIH图像软件）。将磷酸 化的EGFR浓度规格化为蛋白质表达水平并表示为受体的百分比激活。
[0059] 图4显示了在EGFR的ATP-结合性口袋内关键位点上的突变的聚类。
[0060] 图4A显示在多种NSCLC情况下（SEQ ID NOS 495-504 (DNA) )，EGFR基因的外显 子19中重叠的框内删除和外显子21的错义突变的位置。对每种外显子显示部分核苷酸序 列，通过虚线标记删除并突出和对错义突变下划线；显示野生型EGFR核苷酸和氨基酸序列 (SEQ ID NOS 493&494(DNA)&509-510(氨基酸））。
[0061] 图4B显示EGFR ATP裂口的立体结构，两翼是激酶结构域的氨基（N)和羧基（C)凸 起部（源自I3DBlMH的等同物，并利用Cn3D软件展示）。抑制剂Gef itinib，图示占据ATP 裂口。显示了两种错义突变的定位，在激酶的激活性环内；三个框内删除都存在于另一个环 内，在ATP裂口侧翼。
[0062] 图4C显示EGFR激酶结构域的特写，显示与结合ATP或抑制剂相关的氨基酸残基。
[0063] 具体地，4-苯氨基喹唑啉化合物如gefitinib通过占据ATP结合位点抑制催化， 其中它们与甲硫氨酸793 (M793)和半胱氨酸775 (C775)残基形成氢键，而它们的苯胺环接 近甲硫氨酸766(M766)，赖氨酸（K745)，和亮氨酸788(L788)残基。预测突变所靶向的环内 的框内删除相对于抑制剂改变这些氨基酸的位置。显示突变的残基在酪氨酸激酶的激活环 内。
[0064] 图5显示erbBl基因的核苷酸和氨基酸序列。所述氨基酸被描述为本领域技术人 员已知的单个字母。通过患者数目来突出激酶结构域中的核苷酸变异，见表2。如图5所示 的包括核苷酸1到3633。SEQ IDNO :512包括氨基酸1到1210。
[0065] 图6A-6C :在EGFR和B-Raf激酶结构域内的选定区的序列比对。人NSCLC中EGFR 突变的描绘。iEGFR(gb:X00588;)NSCLC肿瘤中的突变以灰色突出显示。在多种肿瘤类型 (5)中的B-Raf (gb:M95712)突变以黑色突出显示。星号表示残基EGFR和B-Raf之间保守 的残基。图6A描绘了激活环中的L858R突变（SEQ ID N0S477-479)。图6B描绘了 P环中 的G719S突变（SEQ ID NOS 480-482)。图6C描绘了 EGFR外显子19中的删除突变（SEQ ID NOS 483-489)〇
[0066] 图7 :EGFR激酶结构域的三维结构中的错义突变G719S和L858R和Del-I删除的位 置。激活环以黄色显示，P环以蓝色显示并指出C端凸起和N端凸起。由突变或删除靶向的 残基以红色突出显示。Del-I突变靶向密码子746-750的残基ELREA。突变定位在激酶内高 度保守的区域中并发现于P环和激活环中，其包围着ATP并且也是gefitinib和erlotinib 预测结合的区域。
[0067] 图8A-8F.来自正常组织和来自肿瘤组织的EGFR DNA的代表性色谱。鉴定的突变 的定位如下。图8A描绘了外显子18激酶结构域P环（SEQ ID NOS 704-705)。图8B描绘 了外显子21激酶结构域A-环（SEQ ID NOS 706-707)。图8C描绘了外显子19激酶结构 域 Del-1(SEQ ID NOS 708-710)。图 8D 描绘了外显子 19 激酶结构域 Del-3 (SEQ ID NOS 711-713)。图8E描绘了外显子19激酶结构域Del-4 (SEQ ID NOS 714-716)。图8F描绘了 外显子 19 激酶结构域 Del-5 (SEQ ID NOS 717-719)。
[0068] 图9 :EGFR和BCR-ABL多肽的序列比对和赋予药物耐受性表型的残基的定位。将由 GenBank编号NM005228中公开的核苷酸编码的EGFR多肽（SEQ ID N0:492)和由Gen Bank 编号M14752中公开的核苷酸序列编码的BCR-ABL多肽（SEQ ID NO :491)进行比对并用阴 影标注保守性残基。通过星号表示赋予对酪氨酸激酶抑制剂imatinib(STI571，Glivec/ Gleevec)耐受性的BCR-ABL突变。
[0069] 图10显示对于患有转移性NSCLC患者来说决定进行EGFR测试的过程。
[0070] 图IlEGFR外显子18-24的图（未给出比例尺）。箭头描述了鉴定突变的定位。星 号表明在每个位置上具有突变的患者的数目。单相交图描绘了外显子19删除的重叠，以及 具有每个删除的患者的数目（如图5所示的的核苷酸2233-2277和SEQ ID NO :512的残基 745-749)。注意这些结果并没有包括目前所有的EGFR突变。

【具体实施方式】
[0071] 本发明提供一种确定在受癌症影响的人类患者中表皮生长因子受体（EGFR)靶向 性治疗有效的可能性的新方法。该方法包括检测所述患者的erbBl基因的激酶结构域中的 至少一种核酸变异的存在或缺失。至少一种变异的存在表示EGFR靶向性治疗可能有效。优 选地，所述核苷酸变异提高EGFR的激酶活性。随后可以用EGFR靶向性治疗来治疗所述患 者。在本发明的一个实施方案中，所述EGFR靶向性治疗是酪氨酸激酶抑制剂。在优选的实 施方案中，所述酪氨酸激酶抑制剂是苯氨基喹唑啉。所述苯氨基喹唑啉可以是合成的苯氨 基喹挫啉。优选地，所述合成的苯氨基喹挫啉为gefitinib或erlotinib。
[0072] 定义：
[0073] 术语"ErbBl"，"表皮生长因子受体"，和"EGFR"在本文中相互交换使用 并指如，例如，在Carpenter等Ann. Rev. Biochem. 56 :881-914(1987)中公开的天然序列 EGFR，包括其变体（例如如在Humphrey等PNAS(USA)87 :4207-4211 (1990)中的删除突变 EGFR)。ErbBl指编码EGFR蛋白产物的基因。
[0074] 本文所用的术语"提高激酶活性的核苷酸变异"指基因的核苷酸序列中的变异 (即突变），其导致提高的激酶活性。提高的激酶活性是在所述核酸中的变异的直接结果并 且所述基因编码的蛋白质相关联。
[0075] 本文所用的术语"药物"或"化合物"指施用给个体以治疗或预防或控制疾病 或状况的化学实体或生物学产品，或化学实体或生物学产品的组合。优选地，但并非必需 地，所述化学实体或生物学产品是低分子量化合物，但是也可以是较大的化合物，例如， 核酸的寡聚体，氨基酸，或糖类，包括但不限于蛋白质，寡核苷酸，核酶，DNA酶，糖蛋白， siRNAs，脂蛋白，适体，及其改进和组合。
[0076] 在本发明的背景中术语"基因型"指基因的特定等位形式，其可以用在特定位点 存在于核酸序列中的特定核苷酸来定义。
[0077] 术语"基因的变异形式"，"基因的形式"，或"等位基因"指基因在群体中的 一种特定形式，所述特定形式与相同基因的其它形式在所述基因序列中的至少一个，经常 是大于一个变异位点的序列上有所不同。在基因的不同等位基因之间差异的这些变异位点 上的序列称作"基因序列变异"或"变异"或"变体"。本领域已知的其它等同术语包括 突变和多态性，尽管突变经常用来指与有害表型相关联的等位基因。在本发明的优选方面， 所述变异选自由本文变异表中所列出的变异。
[0078] 在本发明的背景下，术语"探针"指能够可检测地区分结构不同的靶分子的分 子。根据所用探针的类型和靶分子的类型，检测可以以多种不同方式实现。因而，例如，检 测可以基因靶分子的活性水平的区别，但优选基于特异性结合的检测。这种特异性结合的 例子包括抗体结合和核酸探针杂交。因而，例如，探针可以包括酶底物，抗体和抗体片段，优 选核酸杂交探针。
[0079] 如本文所用的，术语"有效"和"有效性"包括药学有效性和生理安全性。药学 有效性指治疗在患者中导致所需的生物学作用的能力。生理安全性指在细胞，组织和/或 生物水平上的毒性，或其它有害生理作用的水平（通常称为副作用），其是由治疗的施用而 产生的。"有效性较小的"指治疗导致药学有效性的治疗上明显较低的水平和/或有害生 理作用的治疗上较高的水平。
[0080] 术语"引物"正如本文所用的，是指这样一种寡核苷酸：S卩，当这种寡核苷酸被置 于催化合成与多核苷酸互补的引物延伸产物的条件下时，它能够用作沿互补链进行多核苷 酸合成的起始点。这些条件包括在适当的缓冲液（"缓冲液"包括作为辅因子或影响PH、 离子强度等的成份）中，和在适当的温度下存在四种不同的三磷酸核苷酸或核苷类似物以 及一种或多种用于聚合的试剂例如DNA聚合酶和/或反转录酶。引物必须长得足以在用于 聚合酶的试剂存在时引发延伸产物的合成。典型的引物含有长至少大约5个核苷酸的基本 上与靶序列互补的序列，但是在某种程度上较长的引物是优选的。引物通常含有大约15-26 个核苷酸，但也可以采用更长的引物。
[0081] 引物总是含有基本上与靶序列，即引物可以与之退火的待扩增的特异性序列，互 补的序列。除了与靶序列互补的序列之外，引物还可任选地包含其它序列。术语"启动子 序列"定义了由RNA聚合酶特异性识别的核酸序列单链，所述RNA聚合酶结合到所识别的 序列上并引发产生RNA转录本的转录过程。原则上，可以采用任何启动子序列，只要对于该 启动子具有已知的可获得的能够识别起始序列的聚合酶即可。已知的有用启动子是那些被 某些噬菌体聚合酶，如噬菌体T3、T7或SP6识别的启动子。
[0082] "微阵列"是在固体支持物表面上形成的具有优选不连续区域，每一区域具有限 定的面积，的线性或二维阵列。由单个固体支持物的表面上待检测的靶多核苷酸的总数 来确定微阵列上不连续区域的密度，优选的是至少大约50/cm 2,更优选的是至少大约100/ cm2,甚优选的是至少大约500/cm2,并且更甚优选的是至少大约l，000/cm 2。正如本文所用 的，DNA微阵列是置于芯片或其它表面上的用来扩增或克隆靶多核苷酸的寡核苷酸引物阵 列。由于每个特定引物组在阵列中的位置是已知的，因此基于靶多核苷酸与微阵列中特定 位置的结合，可以确定它们的特性。
[0083] 术语"标记物"是指能够产生指示测定样品中存在靶多核苷酸的可检测信号的 组合物。适宜的标记物包括放射性同位素、核苷酸发色团、酶、底物、荧光分子、化学发光部 分、磁性颗粒、生物发光部分以及类似物质。于是，标记物是可以由分光的、光化学的、生物 化学的、免疫化学的、电子的、光学的或化学的工具检测的任何组合物。
[0084] 术语："支持物"是指常规的支持物，如珠、颗粒、棒、纤维、过滤器、膜以及硅烷 或硅酸盐支持物，如玻片。
[0085] 术语"扩增"广义上是指产生扩增产物，所述扩增产物可包括例如其它靶分子， 或者靶样分子或者与靶分子互补的分子，所述分子是由样品中靶分子的存在而产生的。在 靶物是核酸的情形中，利用DNA或RNA聚合酶或转录酶可以酶促产生扩增产物。
[0086] 如本文所用的，"生物学样品"指从个体中分离的组织或液体的样品，它包括但 不限于，例如，血液、血浆、血清、肿瘤活检组织、尿液、粪便、痰、脊髓液、胸水、乳头吸取物、 淋巴液、皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外分泌物、泪液、唾液、乳液、细胞（包括但不限 于血细胞）、肿瘤、器官，也包括体外细胞培养组分的样品。在优选的实施方案中，样品来 自切除术、支气管活检组织，或原发性或转移性肿瘤的核心针活检组织，或来自胸水的细胞 团。此后，使用细针吸取样品。样品可以是石蜡包埋或冷冻的组织。
[0087] 术语"抗体"意为一种免疫球蛋白，其能够结合抗原。如本文所用的抗体意为包 括能够结合目标抗原或抗原片段的抗体片段，例如F(ab' )2, Fab'，Fab。优选地，所述抗 体结合抗原抑制EGFR的变异形式的活性。
[0088] 术语"人源化抗体"在本文用于描述完全的抗体分子，即由两条完全的轻链和两 种完全的重链组成，以及只由抗体片段，例如Fab，FaV，F (ab) 2,和Fv组成，其中⑶Rs源 自非人来源而剩余的Ig分子的部分或其部分源自人抗体，优选地产生自编码人抗体的核 酸序列。
[0089] 术语"人抗体"和"人源化抗体"在本文用来描述一种抗体，该抗体分子的所有 部分都源自编码人抗体的核酸序列。这些人抗体是适于用在抗体疗法中，因为这些抗体将 在人患者中引发小的或不引发免疫反应。
[0090] 术语"嵌合性抗体"在本文中用于描述抗体分子以及抗体片段，如上面在术语" 人源化抗体"的定义中所述。术语"嵌合性抗体"表达人源化抗体。嵌合性抗体具有源自 第一种哺乳类物种的重链或轻链氨基酸序列的至少一部分以及源自第二种不同的哺乳类 物种的重链或轻链氨基酸序列的另一部分。
[0091] 优选地，所述可变区源自非人哺乳类物种并且恒定区源自人类物种。具体地，嵌合 性抗体优选产自非人哺乳动物的编码可变区的9个核苷酸序列以及来自人的编码抗体恒 定区的核苷酸序列。
[0092] 表2是与本发明中所述方法相关的erbBl的激酶结构域中的DNA序列变异的部分 列表。这些变化由本发明人在来自对gefitinib起反应的患有NSCLC的患者以及不接触 g e f i t i n i b的患者的生物学样品的研宄中鉴定。
[0093] 利用任一种本领域公知的技术可以将核酸分子从特定的生物学样品中分离出 来，所选的特定分离方法适于特定的生物学样品。例如冻融和碱裂解方法可以用于从固 体物质中获得核酸分子；热和碱裂解方法可以用于从尿中获得核酸分子；而蛋白酶K提 取可以用于从血液中获核酸（Rolff，A 等 PCR :Clinical Diagnostics and Research， Springer(1994)。
[0094] 检测方法
[0095] 可以用多种方式来测定在具有或处于形成癌症的危险之中的患者中的erbBl基 因的激酶结构域中特定变异或多种变异的存在或缺失。这些测试通常利用收集自生物学样 品的DNA或RNA样品来进行，所述生物学样品例如，活检组织、尿、粪便、唾液、血液、细胞、组 织刮肩、乳腺抽吸物或其它细胞物质，并且能够通过多种方法进行，包括，但不限于，PCR，与 等位基因特异性探针杂交，酶学突变检测，化学剪切错配，质谱分析或DNA测序，包括小型 测序。在特定的实施方案中，与等位基因特异性探针杂交能够以两种形式进行：（1)等位基 因特异性寡核苷酸结合到固相（玻璃、硅、尼龙膜）和溶液中标记的样品上，正如在许多DNA 芯片应用中一样，或（2)在溶液中结合样品（经常是克隆的DNA或PCR扩增DNA)和标记的 寡核苷酸（可以是等位基因特异性的或短的以便允许通过杂交进行测序）。诊断测试可以 包括一组变异，经常在固体支持物上，其能够进行一个以上变异的同时测定。
[0096] 在另一方面，测定erbBl基因中至少一种提高激酶活性的核酸变异的存在必需单 倍型测试。测定单倍型的方法是本领域技术人员已知的，例如，在WO 00/04194中。
[0097] 优选地，测定至少一种提高激酶活性的核酸变异的存在或缺失包括通过聚合酶链 式反应（PCR)测定变异位点的序列。或者，测定提高激酶活性的核酸变异的存在或缺失可 以包括链末端DNA测序或小型测序，寡核苷酸杂交或质谱分析。
[0098] 本发明的方法可以用来预测在具有或处于形成癌症的危险之中的患者中EGFR靶 向性治疗有效（或无效）的可能性。优选地，癌症包括上皮组织起源的癌症，包括，但不限 于，胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳癌、头颈癌、肺癌、非小细胞肺癌、神经系统癌、肾癌、视网 膜癌、皮肤癌、肝癌、胰癌、生殖 _泌尿系统癌和膀胱癌。在优选的实施方案中，所述癌症是 非小细胞肺癌。
[0099] 本发明一般性地涉及erbBl基因的激酶结构域中的变异的鉴定，其是在具有或处 于形成癌症的危险之中的患者中EGFR靶向性治疗有效的指征。此外，在EGFR的激酶结构 域中特异性变异的鉴定，在效果上，能够用作诊断或预防测试。例如，在erbBl基因的激酶 结构域中至少一个变异的存在表明患者将可能受益于用EGFR靶向化合物进行的治疗，如， 例如，酪氨酸激酶抑制剂。
[0100] 用于诊断性测试的方法是本领域公知的并公开于专利申请W000/04194中，在此 并入作为参考。在一种例示性的方法中，所述诊断性测试包括扩增跨越erbBl基因序列的 激酶结构域中的一个或多个变异的DNA或RNA (-般在将RNA转变成cDNA后）片段。随后 对这种扩增的片段进行测序和/或进行聚丙烯酰胺凝胶电泳以便鉴定扩增片段中的核酸 变异。
[0101] PCR
[0102] 在一个实施方案中，本发明提供一种通过PCR，或，备选地，在连接链式反应（LCR) 中筛选erbBl基因的激酶结构域中变异的方法（见，例如，Landegran，等，1988. Science 241 :1077-1080 ;和 Nakazawa，等，1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :360-364)，后者可 以特别用于检测EGFR基因中的点突变（见，Abravaya，等，1995.Nucl.Acids Res. 23 : 675-682)。该方法包括以下步骤：设计简并引物用于扩增靶序列，所述引物对应于基因的一 种或多种保守性区域，利用获自测试生物学样品的DNA或cDNA作为模板用引物进行扩增反 应，和分析PCR产物。测试生物学样品与对照样品的PCR产物的比较表明测试生物学样品 中的变异。所述变化可以是核酸变异在测试生物学样品中的缺失或存在。
[0103] 备选的扩增方法包括：自持序列复制（见，Guatelli，等，1990.?1"〇(：.似1:1.八〇&(1· Sci.USA 87 :1874-1878)，转录扩增系统（见，Kwoh，等，1989.Proc.Natl.Acad. Sci.USA 86:1173-1177) ;Qb 复制酶（见，Lizardi，等，1988. BioTechnology 6:1197)，或任何其它 核酸扩增方法，然后利用本领域技术人员公知的技术对扩增的分子进行检测。这些检测方 案对于核酸分子的检测特别有用，如果这些分子以极低数目存在的话。
[0104] 利用蛋白质的氨基酸序列或erbBl基因的激酶结构域的核酸序列作为指导设计 根据本发明的有用引物，所述序列例如SEQ ID NO :493, SEQ ID NO :494, SEQ ID NO :509， 和SEQ ID NO :510。在基因的同源性区域设计引物，其中至少两个同源区域被可变序列的 差异区分隔开，所述序列在长度或核酸序列上是可变的。
[0105] 例如，相同的或高度同源的，优选具有至少大约6个，优选至少8-10个连接氨基 酸的至少80% -85%，更加优选至少90-99 %的同源性氨基酸序列。最优选地，所述氨基酸 序列是100%相同的。基于密码子简并性和在已知基因家族成员之间给定位置上各种氨基 酸的保持设计正向和反向引物。本文提到的同源性程度是基于利用标准序列比较软件进 行的氨基酸序列分析，如使用默认设置的蛋白质-BLAST(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ BLAST/)。
[0106] 下表3给出了简并密码子的用法和它们的标准符号：
[0107]

【权利要求】
1. 一种试剂盒，其包含： a. 设计来退火到EGFR激酶结构域的外显子19或21内部的核酸区域上的至少一种探 针； b. 进行退火反应所必需的产物和试剂；和 c?说明书， 其中所述探针在选择性结合条件下特异性结合到在erbBl基因中的外显子19或21中 包含至少一个变异的核酸序列上，其中所述变异为导致EGFR基因的外显子19中的框内删 除的突变，其由导致氨基酸改变的在密码子746-753内的删除组成，所述氨基酸改变包含 至少SEQ ID NO. 512中第747、748和749位的亮氨酸、精氨酸和谷氨酸的删除，或其中所述 变异为导致氨基酸改变的外显子21内的取代，所述氨基酸改变由序列SEQ ID NO. 512的 858位以精氨酸取代亮氨酸（L858R)组成。
2. -种试剂盒，其包含： a. 设计来退火到EGFR激酶结构域的外显子19或21的边界或内部的核酸区域上的至 少一对简并引物，其中所述引物对特异性扩增在EGFR基因中的外显子19或21中包含至少 一个变异的核酸序列，其中所述变异为导致EGFR基因的外显子19中的框内删除的突变， 其由导致氨基酸改变的在密码子746-753内的删除组成，所述氨基酸改变包含至少SEQ ID NO. 512中第747、748和749位的亮氨酸、精氨酸和谷氨酸的删除，或其中所述变异为导致氨 基酸改变的外显子21内的取代，所述氨基酸改变由序列SEQ ID NO. 512的858位以精氨酸 取代亮氨酸（L858R)组成； b. 进行PCR扩增所必需的产物和试剂；和 c?说明书。
3. -种试剂盒，其包含： a. 设计来检测EGFR激酶结构域的外显子19或21中的变异的至少一种核酸探针，其中 所述核酸探针检测EGFR基因中的外显子19或21中的至少一个变异，其中所述变异为导致 EGFR基因的外显子19中的框内删除的突变，其由导致氨基酸改变的在密码子746-753内的 删除组成，所述氨基酸改变包含至少SEQ ID NO. 512中第747、748和749位的亮氨酸、精氨 酸和谷氨酸的删除，或其中所述变异为导致氨基酸改变的外显子21内的取代，所述氨基酸 改变由序列SEQ ID NO. 512的858位以精氨酸取代亮氨酸（L858R)组成，其中所述检测基 于与核苷酸变异序列的特异性杂交； b. 进行退火反应所必需的产物和试剂；和 c?说明书。
4. 一种试剂盒，其包含： a. 设计来退火到EGFR激酶结构域的外显子18的边界或内部的核酸区域上的至少一对 简并引物，其中所述引物对特异性扩增在EGFR基因中的外显子18中包含至少一个变异的 核酸序列，其中所述变异为导致氨基酸改变的外显子18内的取代，所述氨基酸改变由序列 SEQ ID NO. 512的719位以半胱氨酸取代甘氨酸（G719C)组成； b. 进行PCR扩增所必需的产物和试剂；和 c?说明书。
5. -种试剂盒，其包含： a. 设计来检测EGFR激酶结构域的外显子18中的变异的至少一种核酸探针，其中所述 核酸探针检测EGFR基因中的外显子18中的至少一个变异，其中所述变异为导致氨基酸改 变的外显子18内的取代，所述氨基酸改变由序列SEQ ID NO. 512的719位以半胱氨酸取代 甘氨酸（G719C)组成，其中所述检测基于与核苷酸变异序列的特异性杂交； b. 进行退火反应所必需的产物和试剂；和 c?说明书。
6. -种探针，其在选择性结合条件下特异性结合到在erbBl基因中的外显子19或21 中包含至少一个变异的核酸序列上，其中所述变异为导致EGFR基因的外显子19中的框内 删除的突变，其由导致氨基酸改变的在密码子746-753内的删除组成，所述氨基酸改变包 含至少SEQ ID NO. 512中第747、748和749位的亮氨酸、精氨酸和谷氨酸的删除，或其中所 述变异为导致氨基酸改变的外显子21内的取代，所述氨基酸改变由序列SEQ ID NO. 512的 858位以精氨酸取代亮氨酸（L858R)组成。
7. 权利要求6的探针，其中所述探针包含长度为500个核苷酸碱基或更少的核酸序列。
8. 权利要求6的探针，其中所述探针包含肽核酸（PNA)。
9. 权利要求6的探针，其进一步包含可检测标记。
10. -种核酸探针，其设计来检测EGFR基因中的外显子19或21中的变异，其中所述 变异为导致EGFR基因的外显子19中的框内删除的突变，其由导致氨基酸改变的在密码子 746-753内的删除组成，所述氨基酸改变包含至少SEQ ID NO. 512中第747、748和749位 的亮氨酸、精氨酸和谷氨酸的删除，或其中所述变异为导致氨基酸改变的外显子21内的取 代，所述氨基酸改变由序列SEQ ID NO. 512的858位以精氨酸取代亮氨酸（L858R)组成，其 中所述检测基于与核苷酸变异序列的特异性杂交。
11. 权利要求10的核酸探针，其中所述核酸探针包含长度为500个核苷酸碱基或更少 的核酸序列。
12. 权利要求10的核酸探针，其中所述核酸探针包含肽核酸（PNA)。
13. 权利要求10的核酸探针，其进一步包含可检测标记。
14. 一种核酸探针，其设计来检测EGFR基因中的外显子18中的变异，其中所述变异为 导致氨基酸改变的外显子18内的取代，所述氨基酸改变由序列SEQ ID NO. 512的719位以 半胱氨酸取代甘氨酸（G719C)组成，其中所述检测基于与核苷酸变异序列的特异性杂交。
15. -种引物对，其设计来退火到EGFR激酶结构域的外显子19或21的边界或内部的 核酸区域上，其中所述引物对特异性扩增在EGFR基因中的外显子19或21中包含至少一个 变异的核酸序列，其中所述变异为导致EGFR基因的外显子19中的框内删除的突变，其由导 致氨基酸改变的在密码子746-753内的删除组成，所述氨基酸改变包含至少SEQ ID NO. 512 中第747、748和749位的亮氨酸、精氨酸和谷氨酸的删除，或其中所述变异为导致氨基酸改 变的外显子21内的取代，所述氨基酸改变由序列SEQ ID NO. 512的858位以精氨酸取代亮 氨酸（L858R)组成。
16. -种引物对，其设计来退火到EGFR激酶结构域的外显子18的边界或内部的核酸 区域上，其中所述引物对特异性扩增在EGFR基因中的外显子18中的至少一个变异，其中所 述变异为导致氨基酸改变的外显子18内的取代，所述氨基酸改变由序列SEQ ID NO. 512的 719位以半胱氨酸取代甘氨酸（G719C)组成。
17. -种具有SEQ ID N0:512氨基酸序列的分离的蛋白质，其中将选自氨基酸 746-750、747-751 和 747-753 的氨基酸删除。
18. -种具有SEQ ID NO :512氨基酸序列的分离的蛋白质，其包含在氨基酸858上用 精氨酸取代亮氨酸。
19. 一种具有SEQ ID NO :512氨基酸序列的分离的蛋白质，其包含在氨基酸719上用 半胱氨酸取代甘氨酸。
【文档编号】C12N15/11GK104480200SQ201410680729
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2005年3月31日 优先权日:2004年3月31日
【发明者】W. 贝尔 D., A. 哈伯 D., A. 贾恩 P., E. 约翰逊 B., J. 林奇 T., 迈耶森 M., G. 佩茨 J., R. 塞勒斯 W., E. 塞特尔曼 J., 索德拉 R. 申请人:综合医院公司, 达纳-法伯癌症协会有限公司