一种从脐血中分离有核细胞的方法
【专利摘要】本发明公开一种从脐血中分离有核细胞的方法，它包括如下步骤：(1)取脐血，加入脐血1/5体积的羟乙基淀粉，混匀，离心，去除红细胞层，所述离心的离心力为90g，离心时间为6min；(2)再次离心，离心力为400g，离心时间为11min，去除血浆层，即得有核细胞悬液。本发明还提供了一种脐血的系统处理方法。本发明方法有效回收有核细胞，去除红细胞，优于传统方法，应用前景良好。
【专利说明】一种从脐血中分离有核细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种从脐血中分离有核细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 脐带血作为造血干细胞来源之一，用于血液系统疾病的移植治疗，已有20多年的 时间。经过20多年的建设，估计全球已有大大小小的公共脐带血库100余个，储存公共脐 带血单位超过500000份，为临床提供移植等治疗超过20000份。脐带血的无用成分会对脐 带血的冻存和移植产生负面影响，而且若以脐带全血冷冻保存，则需要建造庞大的储存室 并消耗大量液氮，因此，从脐带全血中去除无用成分而又不使干细胞丢失成为脐带血库的 技术核心。
[0003] 目前世界各个脐带血库通用的脐带血分离技术为羟乙基淀粉两次离心法，由 Rubinstein等于1995年所创立。该方法的原理是：在血液中，加入轻乙基淀粉，与红细胞 形成络合物，加速红细胞沉降，通过第一次轻离心，使红细胞、白膜层、血浆分层，使用血浆 分浆夹把血浆和白膜层（白细胞成分）挤入200ml血袋中，再进行第二次重离心，使白膜层 与血浆分层，去除掉多余的血浆，获取白膜层。如，兰炯采等，"脐血单个核细胞的分离及冻 存"，中国实验血液学杂志2002;10(4) ;351-354中公开的分离方法为：脐血与6%羟乙基淀 粉按5:1比例混合，50g离心5分钟去除红细胞，上层液第2次400g离心10分钟去掉上清 (血浆层），获得有核细胞悬液。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种改良的羟乙基淀粉两次离心法，用于从体积大于130ml的脐血 中分离有核细胞，还提供了一种脐血的系统处理方法。
[0005] 本发明从脐带血中分离有核细胞的方法，它包括如下步骤：
[0006] (1)取脐血，加入脐血1/5体积的羟乙基淀粉，混匀，离心，去除红细胞层（下层）， 所述离心的离心力为90g，离心时间为6min ;
[0007] (2)再次离心，离心力为400g，离心时间为llmin，去除血浆层（上层），即得有核 细胞悬液。
[0008] 步骤⑴中，所述脐血的体积不低于130ml。
[0009] 步骤（1)中，所述离心是正置离心。
[0010] 本发明还提供了一种脐血的制备分离方法，包括如下步骤：
[0011] a、取脐血，检测其体积；
[0012] b，若脐血体积大于等于130ml，按照前述方法分离有核细胞；
[0013] c、若脐血体积小于130ml，按照如下步骤分离有核细胞：取脐血，加入脐血1/5体 积的羟乙基淀粉，混匀，离心，去除红细胞层，所述离心的离心力为50g，离心时间为7min ; 再次离心,离心力为400g，离心时间为llmin，去除血浆层，S卩可。
[0014] 步骤c中，脐血体积大于等于IOOml时，离心采用正置离心；脐血体积小于IOOml 时，离心采用倒置离心。
[0015] 正置离心：是指离心时血袋正置，离心后上层的血浆和白膜层用夹板挤压通过导 管进入新的血袋。
[0016] 倒置离心：离心时血袋倒置，离心后下层的红细胞利用重力通过导管进入新的血 袋。
[0017] 目前世界各个脐带血库通用的脐带血分离技术为羟乙基淀粉两次离心法，具体步 骤为：脐血与6%羟乙基淀粉按5:1比例混合，50g离心5?7分钟去除红细胞，上层液第2 次400g离心10分钟去掉血浆层，获得有核细胞悬液。
[0018] 其中，所有的参数均是经过长时间摸索得出的最佳值，以第一次离心的离心力和 离心时间为例,离心力太大或太小,或者离心时间太长或太短,都会导致红细胞和有核细胞 难以有效分离，表现为有核细胞回收率和红细胞去除率均较低。
[0019] 据统计，一份脐血的体积的数值范围为60ml-160ml，体积的平均值为110±50ml。 目前在对脐血进行分离时，统一都采用前述分离方法。
[0020] 然而，本发明人在长期的实践中发现，脐血体积在130ml以上时，第一次离心采用 本发明特定的离心力和离心时间的组合，可以有效提高有核细胞回收率和红细胞去除率， 取得了意料不到的技术效果。
[0021] 综上，本发明分离方法通过改变离心力和离心时间，有效提高了体积在130ml以 上的脐血的有核细胞回收率和红细胞去除率，优于传统方法；本发明脐血的制备分离方法 根据脐血体积不同，采用不同的离心方法，可以有效地对不同体积脐血进行有效处理，应用 iu景良好。
[0022] 下面通过【具体实施方式】对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限 制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述 基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
【具体实施方式】
[0023] 实施例1本发明分离方法
[0024] (1)取体积不低于130ml的脐带血，加入脐带血体积的五分之一的羟乙基淀粉，充 分混匀。
[0025] (2)第一次离心：将脐带血放入离心机中，用90g，6min进行离心。正置离心：血袋 正置，离心后用夹板将血浆和白膜层挤入空的200ml血袋中，白膜层和血浆进入下一步离 心。
[0026] (3)第二次离心：离心条件为400g，Ilmin正向离心。离心完成后，去除血浆层，得 到悬液，即为有核细胞悬液。
[0027] 实施例2本发明处理方法
[0028] a、取脐血，检测其体积；
[0029] b，若脐血体积大于等于130ml，按照实施例1的方法分离有核细胞；
[0030] C、若脐血体积小于130ml，按照如下步骤分离有核细胞：
[0031] (1)取脐带血，加入脐带血体积的五分之一的羟乙基淀粉，充分混匀。
[0032] (2)第一次离心：将脐带血放入离心机中，用50g，7min离心。脐血体积大于等于 IOOml时，正置离心；脐血体积小于IOOml时，离心采用倒置离心。
[0033] 正置离心：血袋正置，离心后用夹板将血浆和白膜层挤入空的200ml血袋中，白膜 层和血楽进入下一步离心。
[0034] 倒置离心：血袋倒置，离心后血袋悬挂在挂钩上，下层的红细胞通过重力流入空的 200ml血袋废弃，白膜层和血楽进入下一步离心。
[0035] (3)第二次离心：离心条件为400g，Ilmin正向离心。离心完成后，去除血浆层，得 到悬液，即为有核细胞悬液。
[0036] 以下用实验例的方式来说明本发明的有益效果：
[0037] 实验例1本发明分离方法与传统分离的比较
[0038] 1、试验材料
[0039] 将256份体积为146. Oml± 14. 6ml的脐血按照本发明方法分离纯化；将305份体 积为148. 6ml± 16. 8ml的脐血按照传统方法分离纯化。
[0040] 2、试验方法
[0041] 本发明方法：如实施例1所示。
[0042] 传统方法：除了将步骤⑵中离心的条件变为50g，7min，其余条件不变。
[0043] 使用全自动血细胞分析仪对脐带血分离前与分离后的样本进行计数，得到分离前 后的TNC(总的有核细胞）、红细胞计数，算出TNC回收率和红细胞去除率。
[0044] TNC回收率=分离后总的有核细胞数/分离前总的有核细胞数*100% ;
[0045] 红细胞去除率=(分离前红细胞数-分离后红细胞数）/分离前红细胞数*100 %。
[0046] 获得的数据用spss数据软件分析。
[0047] 3、试验结果
[0048] 结果如下表所示1所示：
[0049] 表1本发明方法与传统方法的比较
【权利要求】
1. 一种从脐血中分离有核细胞的方法，其特征在于：它包括如下步骤： (1) 取脐血，加入脐血1/5体积的羟乙基淀粉，混勻，离心，去除红细胞层，所述离心的 离心力为90g，离心时间为6min ; (2) 再次离心，离心力为400g，离心时间为llmin，去除血浆层，即得有核细胞悬液。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1)中，所述脐血的体积不低于 130ml。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1)在，所述离心是正置离心。
4. 一种脐血的制备分离方法，其特征在于：包括如下步骤： a、取脐血，检测其体积； b，若脐血体积大于等于130ml，按照权利要求1?3任意一项所述方法分离有核细胞； c、若脐血体积小于130ml，按照如下步骤分离有核细胞：取脐血，加入脐血1/5体积的 羟乙基淀粉，混匀，离心，去除红细胞层，所述离心的离心力为50g，离心时间为7min ;再次 离心，离心力为400g，离心时间为llmin，去除血浆层，即可。
5. 根据权利要求4所述的处理方法，其特征在于：步骤c中，脐血体积大于等于100ml 时，离心采用正置离心；脐血体积小于100ml时，离心采用倒置离心。
【文档编号】C12N5/078GK104403995SQ201410719100
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月1日 优先权日:2014年12月1日
【发明者】胥珊, 王锐锋, 吴春燕, 王自波, 吴永琴, 赖真阳, 陈强 申请人:四川新生命干细胞科技股份有限公司