一种人外周血单个核细胞的分离方法
【专利摘要】本发明公开了一种人外周血单个核细胞的分离方法，结合了羟乙基淀粉沉淀法和Ficoll密度梯度离心法两种方法的优点，针对大容量血液样本的分离特点，先用羟乙基淀粉沉淀法去除大部分的红细胞，然后在空气中自然沉降，再用Ficoll密度梯度离心法对单个核细胞进行进一步纯化，从而得到纯度超过95％，活力超过85％的PBMC。相比没有在空气中自然沉降的方法，获得的细胞活力和纯度更高。
【专利说明】一种人外周血单个核细胞的分离方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种细胞分离方法，具体地涉及一种人外周血单个核细胞的分离方法。
【背景技术】
[0002]细胞治疗是近几年兴起的疾病治疗新技术，是指利用某些具有特定功能的细胞的特性，采用生物工程方法获取和/或通过体外扩增、特殊培养等处理后，使这些细胞具有增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等治疗功效，从而达到治疗疾病的目的。
[0003]细胞治疗以其良好的疗效，副作用小，更个体化、个性化等独特的优势，为一些难治性疾病的治疗，提供了一种选择，有时甚至是最后的选择。在当前和今后很长的历史阶段，细胞治疗都将在临床治疗中担当重要的角色，二十一世纪将是细胞治疗发挥重要作用的时代。
[0004]在免疫细胞治疗中，一般采用轻乙基淀粉(hydroxyethyl starch，HES)离心沉淀法或Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)。采用羟乙基淀粉离心沉淀法虽然在操作上比较简便，但是细胞分离的效果不佳，得到的细胞纯度难以满足要求，有较多的血小板、红细胞及粒细胞等。而采用Ficoll密度梯度离心法，红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的白膜层细胞，就可从外周血中分离得到单个核细胞。这个方法所得到的细胞纯度较好，但是对操作上的要求比较高，如果操作不够谨慎，分离得到的细胞在数量和纯度上都会有较大影响。
【发明内容】
[0005]现有技术中采用羟乙基淀粉离心沉淀法虽然在操作上比较简便，但是细胞分离的效果不佳，得到的细胞纯度难以满足要求，有较多的血小板、粒细胞及红细胞等。而Ficoll密度梯度离心法所得到的细胞纯度较好，但是对样本体积上的要求有一定的限制，如果样本体积超过50ml，分离的效果会大大降低。此外，不同的离心力与离心时间对细胞分离的效果也有较大影响，采用不同的离心参数分离出来的细胞，纯度和活力都有很大的差异。
[0006]本发明的目的是结合羟乙基淀粉沉淀以及Ficoll密度梯度离心法，对PBMC的分离方法进行改进，尤其对于大体积(>50ml)的血液样本分离更具优势。
[0007]本发明目的通过以下技术方案来实现:
[0008]本发明的发明人通过研宄发现:提高PBMC分离效果的关键之一是在保证分离得到的PBMC细胞的活力及数量的前提下，减少血小板、红细胞及粒细胞等杂细胞的比例，提高PBMC细胞的纯度。本发明通过不断地摸索及验证，首先使用羟乙基淀粉沉淀，在空气中自然沉降后，再采用Ficoll密度梯度离心的分离方法，得到纯度和活力都较高的PBMC。
[0009]现有技术中一般采用羟乙基淀粉沉淀法或者Ficoll密度梯度离心法。本发明结合了羟乙基淀粉沉淀法和Ficoll密度梯度离心法两种方法的优点，针对大容量血液样本的分离特点，先用羟乙基淀粉沉淀法去除大部分的红细胞，然后在空气中自然沉降，再用Ficoll密度梯度离心法对单个核细胞进行进一步纯化，从而得到纯度超过95%，活力超过85%的PBMC。相比没有在空气中自然沉降的方法，获得的细胞活力和纯度更高。
[0010]本发明目的通过以下技术方案来实现:
[0011]一种人外周血单个核细胞的分离方法，包括以下步骤:
[0012](I)将外周血离心后，上层为血浆，下层为血细胞沉淀；
[0013](2)在下层血细胞沉淀中加入等体积的羟乙基淀粉溶液，羟乙基淀粉溶液的浓度为4% -10% g/mL,混合均勾后在空气中自然沉降15?35min ；
[0014](3)将上清液缓慢转移至Ficoll淋巴细胞分离液表面，离心力为600g?800g，离心 20 ?30min ；
[0015](4)离心后从下到上分为4层，依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、白膜层和血楽层；吸取白膜层，重悬，离心；
[0016](5)离心后弃上清液，用1640培养基重悬细胞，调整细胞密度为5X105?1X 105cells/mL,得到人外周血单个核细胞。
[0017]优选，所述羟乙基淀粉溶液的浓度为6% g/mL。
[0018]步骤(4)所述重悬是加入生理盐水。
[0019]步骤(4)和(5)所述离心的转速为1000?2000rpm/min，离心5?1min0
[0020]步骤(I)所述离心的转速为1500?3000rpm，离心时间为8?12min。
[0021]与现有技术相比，本发明具有的优点及有益效果:
[0022](I)本发明技术结合了羟乙基淀粉沉淀法和Ficoll密度梯度离心法两种方法的优点，克服了目前技术在大容量血液样本中的缺点，得到高纯度的PBMC ；
[0023](2)分离得到的PBMC细胞的分化能力好，体外扩增倍数高，能更快的达到临床应用所需的细胞数量。
[0024](3)先用羟乙基淀粉沉淀法去除大部分的红细胞，然后在空气中自然沉降，再用Ficoll密度梯度离心法对单个核细胞进行进一步纯化，从而得到纯度超过95%，活力超过85%的PBMC。相比没有在空气中自然沉降的方法，获得的细胞活力和纯度更高。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为PBMC的分离纯度对比；
[0026]图2为PBMC的分离活力对比；
[0027]图3为NK细胞的生长曲线；
[0028]图4为NK细胞的流式鉴定结果；
[0029]图5为NKT细胞的生长曲线；
[0030]图6为NKT细胞的流式鉴定结果；
[0031]图7为CIK细胞的生长曲线；
[0032]图8为CIK细胞的流式鉴定。
【具体实施方式】
[0033]实施例1
[0034]1、用75%乙醇擦试生物安全柜工作台面消毒，将装有外周血的抗凝管放入超净台中。
[0035]2、将抗凝管中的外周血转移到离心管中，2000rpm离心lOmin，离心结束后共分为两层，上层为血浆，下层为血细胞沉淀。将上层血浆收集于另一支离心管中，标记后置于4°C冰箱，备用。
[0036]3、将下层血细胞转移到50mL离心管中，加入等体积的6% g/mL羟乙基淀粉溶液，混合均匀后使其自然沉降20min。
[0037]4、另取一支新的50mL离心管，每管加入Ficoll淋巴细胞分离液(品牌:Axis-shield ;供货商:深圳市达科为生物技术有限公司；货号:AS1114546)，将自然沉降后的上清液缓慢转移至淋巴细胞分离液的表面，使二者之间形成清晰的界面。
[0038]5、用封口膜将离心管封口后转移至离心机，700g离心30min，离心升降速率改为O ；
[0039]6、离心后从管底到液面分为4层，依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、白膜层(即PBMC层)、血浆层。用巴氏吸管将中间的白膜层PBMC直接吸取出来，转移至另一支50mL离心管中。
[0040]7、加生理盐水至 40mL，重悬 PBMC，1500rpm/min 离心 5min。
[0041]8、离心结束后弃上清，加入40mL生理盐水充分重悬细胞后，取20 μ L细胞悬液于EP管中，用细胞计数仪进行细胞计数及活力检测，其余细胞悬液1500rpm/min离心5min。
[0042]9、离心结束后弃上清，用1640培养基(含10% FBS)重悬细胞，调整细胞密度为5X 15ceIlsAiL后置于37°C、5% CO2培养箱中扩增培养。定期进行细胞计数并绘制细胞生长曲线。生长曲线图见实例中NK，NKT, CIK诱导分化结果。
[0043]实施例2
[0044]1、用75%乙醇擦试生物安全柜工作台面消毒，将装有外周血的抗凝管放入超净台中。
[0045]2、将抗凝管中的外周血转移到离心管中，1500rpm离心8min，离心结束后共分为两层，上层为血浆，下层为血细胞沉淀。将上层血浆收集于另一支离心管中，标记后置于4°C冰箱，备用。
[0046]3、将下层血细胞转移到50mL离心管中，加入等体积的4% g/mL羟乙基淀粉溶液，混合均勾后使其自然沉降15min。
[0047]4、另取一支新的50mL离心管，每管加入Ficoll淋巴细胞分离液(品牌:Axis-shield ;供货商:深圳市达科为生物技术有限公司；货号:AS1114546)，将自然沉降后的上清液缓慢转移至淋巴细胞分离液的表面，使二者之间形成清晰的界面。
[0048]5、用封口膜将离心管封口后转移至离心机，600g离心20min，离心升降速率改为O ；
[0049]6、离心后从管底到液面分为4层，依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、白膜层(即PBMC层)、血浆层。用巴氏吸管将中间的白膜层PBMC直接吸取出来，转移至另一支50mL离心管中。
[0050]7、加生理盐水至 40mL，重悬 PBMC，1000rpm/min 离心 5min。
[0051]8、离心结束后弃上清，加入40mL生理盐水充分重悬细胞后，取20 μ L细胞悬液于EP管中，用细胞计数仪进行细胞计数及活力检测，其余细胞悬液1000rpm/min离心5min。
[0052]9、离心结束后弃上清，用1640培养基(含10% FBS)重悬细胞，调整细胞密度为1X 15后置于37°C、5% CO 2培养箱中扩增培养。
[0053]实施例3
[0054]1、用75%乙醇擦试生物安全柜工作台面消毒，将装有外周血的抗凝管放入超净台中。
[0055]2、将抗凝管中的外周血转移到离心管中，3000rpm离心12min，离心结束后共分为两层，上层为血浆，下层为血细胞沉淀。将上层血浆收集于另一支离心管中，标记后置于4°C冰箱，备用。
[0056]3、将下层血细胞转移到50mL离心管中，加入等体积的10% g/mL羟乙基淀粉溶液，混合均勾后使其自然沉降35min。
[0057]4、另取一支新的50mL离心管，每管加入Ficoll淋巴细胞分离液(品牌:Axis-shield ;供货商:深圳市达科为生物技术有限公司；货号:AS1114546)，将自然沉降后的上清液缓慢转移至淋巴细胞分离液的表面，使二者之间形成清晰的界面。
[0058]5、用封口膜将离心管封口后转移至离心机，800g离心30min，离心升降速率改为O ；
[0059]6、离心后从管底到液面分为4层，依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、白膜层(即PBMC层)、血浆层。用巴氏吸管将中间的白膜层PBMC直接吸取出来，转移至另一支50mL离心管中。
[0060]7、加生理盐水至 40mL，重悬 PBMC，2000rpm/min 离心 1min。
[0061]8、离心结束后弃上清，加入40mL生理盐水充分重悬细胞后，取20 μ L细胞悬液于EP管中，用细胞计数仪进行细胞计数及活力检测，其余细胞悬液2000rpm/min离心lOmin。
[0062]9、离心结束后弃上清，用1640培养基(含10% FBS)重悬细胞，调整细胞密度为8X 15后置于37°C、5% CO 2培养箱中扩增培养。
[0063]分离大容量血液样本PBMC的纯度对比试验:
[0064]根据现有技术中的Ficoll密度梯度离心法跟本发明技术的方法进行PBMC分离后的纯度对比实验。如图1所示，采用单一的羟乙基淀粉沉淀法得到的PBMC存在大量的红细胞，纯度仅为43% ;采用单一的Ficoll密度梯度离心法有少量的红细胞及血小板，纯度为87% ;而采用本发明方法得到的PBMC的纯度高达96%。结果显示，采用本发明实施例1方法，即结合羟乙基淀粉沉淀法跟Ficoll密度梯度离心法两种方法分离所得到的PBMC，在纯度上明显优于其他两种单一的处理方法。
[0065]对比例2:PBMC的活力鉴定
[0066]将采用三种方法分离所得到的PBMC进行台盼蓝染色，并用细胞计数仪进行细胞的计数及活力鉴定。鉴定结果如图2所示，I为羟乙基淀粉沉淀法；2为Ficoll密度梯度离心法；3为本发明实施例1的方法，本发明技术分离的PBMC的活力为95%。而采用羟乙基淀粉沉淀法PBMC活力为85%，Ficoll密度梯度离心法则为83%。可见，本发明得到的PBMC活力均高于其他两种方法。
[0067]对比例3:PBMC的NK分化扩增试验
[0068]利用本发明实施例1分离得到了纯度及活力都较高的PBMC后，利用NK细胞分选试剂盒将其进行NK细胞的分选及诱导培养，培养两周后绘制NK细胞的生长曲线，并取一部分细胞进行流式检测(主要检测CD3_CD56+亚群，即NK细胞)。其生长曲线及流式检测结果分别见下图3和图4。
[0069]由图3可见，利用本技术分离得到的PBMC进一步分选NK细胞，细胞的增殖能力很强，在第6天之后进入对数生长期，第13天增殖速度开始变慢，到第15天收集细胞时，细胞增殖倍数高达825倍。
[0070]由图4可见，⑶3TD56+亚群细胞，即右图第四象限中的细胞，流式检测结果显示NK细胞的比例为95.4 %，细胞纯度较高。
[0071 ] 对比例4:PBMC的NKT分化扩增试验
[0072]利用本发明实施例2分离得到了纯度及活力都较高的PBMC后，将其进行NKT细胞的诱导培养，培养两周后绘制MT细胞的生长曲线，并取一部分细胞进行流式细胞检测(主要检测CD3+CD56+及CD161 +两个亚群的细胞，即NKT细胞)。其生长曲线及流式检测结果分别见下图5和图6。
[0073]由图5可见，利用本技术分离得到的PBMC进一步诱导培养NKT细胞，细胞的增殖能力较好，在第5天之后细胞开始出现明显增殖，第14天增殖速度开始变慢，收集细胞时，细胞增殖倍数高达200倍以上。
[0074]由图6可见，⑶3+⑶56+及⑶161 +两个亚群的细胞，即NKT细胞，流式检测结果显示NKT细胞两个亚群的比例合计为61.9%，细胞诱导分化培养效果很好。
[0075]对比例5:PBMC的CIK分化扩增试验
[0076]利用本发明实施例3方法分离得到了纯度及活力都较高的PBMC后，将其进行CIK细胞的诱导培养，培养两周后绘制CIK细胞的生长曲线，并取一部分细胞进行流式细胞检测(主要检测CD3+CD56+效应细胞，即CIK细胞)。其生长曲线及流式检测结果分别见下图7和图8。
[0077]由图7可见，利用本技术分离得到的PBMC进一步诱导培养CIK细胞，细胞的增殖能力较好，在第5天之后细胞开始出现明显增殖，第12天增殖速度开始变慢，第14天收集细胞时，细胞增殖倍数高达200倍以上。
[0078]由图8可见，⑶3+CD56+亚群的细胞，即CIK细胞，流式检测结果显示CIK细胞比例为24.9%，细胞诱导分化培养效果较好。
【权利要求】
1.一种人外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将外周血离心后，上层为血浆，下层为血细胞沉淀； (2)在下层血细胞沉淀中加入等体积的羟乙基淀粉溶液，羟乙基淀粉溶液的浓度为4% -10% ^/^1,混合均勾后在空气中自然沉降15?35111111 ； (3)将上清液缓慢转移至？化011淋巴细胞分离液表面，离心力为6008?8008，离心20 ?30111111 ； (4)离心后从下到上分为4层，依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、白膜层和血楽层；吸取白膜层，重悬，离心； (5)离心后弃上清液，用1640培养基重悬细胞，调整细胞密度为〖X105?10X 10^06118/1111,得到人外周血单个核细胞。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述羟乙基淀粉溶液的浓度为6%⑴匕
3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤(4)所述重悬是加入生理盐水。
4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤⑷和(5)所述离心的转速为1000 ?200011)111/111111，离心 5 ?101111110
5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤(1)所述离心的转速为1500?300011)111，离心时间为 8 ?12111111。
【文档编号】C12N5/078GK104480070SQ201410718871
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】陈海佳, 王一飞, 葛啸虎, 陈洁鸿, 王小燕, 罗二梅 申请人:广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司