一种人脐带间充质干细胞的分离培养及超微结构特点研究方法
【专利摘要】本发明公开了一种人脐带间充质干细胞的分离培养及超微结构特点研究方法，该方法采用组织块植入法培养原代 ｈＵＣＭＳＣｓ，绘制细胞生长曲线，根据细胞生长状态选第 ３代 ｈＵＣＭＳＣｓ进行实验，流式细胞术、透射电镜和免疫细胞化学等技术研究 ｈＵＣＭＳＣｓ的生物学特性，本发明所培养的细胞基本符合ＭＳＣｓ委员会制定的鉴定 ＭＳＣｓ的标准，可确认为人脐带间充质干细胞，这一结果将为后续试验提供具有较强增殖能力及诱导分化潜能的种子细胞。
【专利说明】一种人脐带间充质干细胞的分离培养及超微结构特点研究方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种人脐带间充质干细胞的分离培养及超微结构特点研宄方法，属于生物医药【技术领域】。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞(mesenchymalstem cells，MSC
s )是目前倍受关注的一类具有多向分化潜能的组织干细胞，可来源于多种组织，如骨髓、脂肪、脐带等，最近资料表明，人脐带间充质干细胞(h u - m a n u m b i I i c a I c
0rdme s enchyma I s t emc e I I s，hUCM-SCs )存在于新生儿脐带中，富含于羊膜被覆上皮与脐带血管之间的华通胶(即Wh a r t ο n j e
1I y)内，脐带属于废弃物，取材方便，且无伦理学限制，从脐带内提取干细胞成本较低。hUCMSCs具有MSCs的一般特性:处于未分化状态，表达间充质干细胞膜标记分子，不表达或低表达造血干细胞标记分子；体外可向成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、内皮细胞等方向分化，h UMS C s具有高增殖性、低免疫原性、细胞替代治疗效果显著等特点，已被广泛地应用于临床基因和细胞治疗中，尽管如此，h UCMS C s基础方面的研宄仍然面临较多问题。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是:提供一种人脐带间充质干细胞的分离培养及超微结构特点研宄方法，该方法采用组织块植入法获得的h U CM S C s具有较强的增殖能力，在体外诱导培养下可向成骨和成脂细胞分化，以克服现有技术的不足。
[0004]本发明的技术方案
一种人脐带间充质干细胞的分离培养及超微结构特点研宄方法，该方法采用组织块植入法培养原代h U C M S C s，绘制细胞生长曲线，根据细胞生长状态选第3代hUCMSCs进行实验，流式细胞术、透射电镜和免疫细胞化学等技术研宄h U C M S C s的生物学特性。
[0005]由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明所培养的细胞基本符合M SC s委员会制定的鉴定MSCs的标准，可确认为人脐带间充质干细胞，这一结果将为后续试验提供具有较强增殖能力及诱导分化潜能的种子细胞。
【专利附图】
【附图说明】
[0006]附图1为h UCMS C s生长曲线图。
【具体实施方式】
[0007]下面对本发明进一步的详细说明，但不作为对本发明的任何限制。
[0008]本发明的实施例:
I材料与方法
1.1实验材料
足月剖腹产手术的健康胎儿脐带组织(家属知情同意，贵阳医学院附属医院产科提供)。脐带米集之前产妇需做艾滋病病毒抗体、乙型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、支原体等病原检测。脐带采集后4°c保存，在6 h内完成组织分离处理。
[0009]1.2 hUCMSCs 的体外培养
预冷P B S反复冲洗脐带后，将其剪成约2 cm长的小段，剔除脐静脉内膜、脐动脉和脐带外膜后，剪成约I mm3大小的组织块，用钩针将组织块点兵式间距I cm摆放于5 0ml培养瓶底壁(培养基预湿润)，将培养瓶底壁朝上置入C O 2培养箱中，3 7 °C、5 % C O 2以及饱和湿度下进行培养；次日翻转培养瓶，每隔24h加入Iml DMEMF I 2培养基；3 d后换液，以后每3 d换液I次，待细胞长到8 O %融合时弃去组织块，O 2 5 %的胰蛋白酶(约5 m i η)消化收集贴壁细胞并进行传代培养。
[0010]1.3 hUCMSCs的形态学观察及生长曲线绘制
取生长状态良好的第3、5、6代hUCMSCs，待细胞生长到8 O %?9 O %汇合时，O 2 5 %胰蛋白酶消化收获细胞，以每孔5X10 5细胞的密度将细胞接种六孔板中，常规培养细胞。接种后，每天取各代细胞(各4孔)进行计数，连续计数7d，并绘制细胞生长曲线。
[0011]I 4 hUCMSCs的透射电镜观察
取生长状态良好的第3代h UMS C s，预冷的2 %戊二醛于4°C固定2h2次，I %锇酸于4 °C固定2 h后，5 O %?I O O %丙酮酸逐级脱水，E P ON 8 I 2包埋剂包埋，醋酸铀和枸橼酸铅染色，P B S洗涤后滤纸吸干，透射电镜(J E O L，日本)下观察并照相。
[0012]1.5 hUCMSCs表面抗原及细胞周期的检测取生长状态良好的第3代hUMSCs，PBS洗涤2次，I % B S A 4 °C下封闭3 O m i η，将细胞以I X
IO 6 / m I浓度悬浮于含鼠抗人CD29 F I T C, C D 3 4 PE的1%BSA中及鼠抗人CD105 P E, C D 4 5 FITC的I % B S A中，室温下避光孵育3 O m i η。PB S洗涤细胞2次后，将细胞悬浮于4 O O μ IPBS中，吹打混匀后过2 O O目细胞筛，上流式细胞仪(B D公司，美国)检测，C e I I Qu e s t软件分析数据。细胞周期检测操作利用7 O %酒精固定细胞和P I染色。
[0013]1.6 免疫细胞化学法检测h UM S C s表面分子将第3代h UM S C s细胞接种于事先置入经多聚赖氨酸处理盖玻片的6孔板(5 X I O5/孔)中，待细胞生长到6 O %汇合时取出盖玻片。用4 %的多聚甲醛固定细胞(室温，3 Omi n)，P B S洗涤 3 次，0.I % T r i t ο η X I O O 处理细胞 20min，H202 处理 20m i η，P B S洗涤2次，山羊血清封闭细胞2 O m i η，弃掉羊血清不洗，兔抗人C D44、CD9 O ,C D 3 4单克隆抗体常温孵育3 Q m i η (具体操作按SABC免疫组织化学试剂盒说明进行)。PBS洗涤3次后，封片，显微镜(C-SHG，Ki kon，日本)下观察并照相。
[0014]1.7 h UMS C s的成骨和成脂诱导将第3代h U M S C s分别接种于(置入多聚赖氨酸处理盖玻片)含成骨诱导培养基(含0.1ymol / L地塞米松、0.0 5 g / L维生素C和I Ommo I / L β甘油磷酸钠)和成脂诱导培养基(含Q.1umol/ L地塞米松、1yg/ L胰岛素、0.1 mmo I / L 1-甲基-3异丁-基黄嘌呤和0.5 mm ο I / L吲哚美辛)的6孔培养板中常规培养3 O d.。
[0015]1.7.1 成骨诱导后碱性磷酸酶染色取出经成骨诱导剂培养的hUMSC s，P B S洗涤2次，4 %多聚甲醛固定细胞3 O m i η，常规0.I % Tritο η I O O室温下处理细胞5min，PBS洗涤2次，H2O2处理20miη，P B S洗涤2次，山羊血清室温下封闭细胞3 O m i η，弃掉羊血清不洗，加入1:
2O O兔抗人碱性磷酸酶抗体(按照SAB C法免疫组织化学试剂盒说明书操作)。P BS洗涤3次后，封片，显微镜下观察并照相。
[0016]1.7.2 成脂诱导后油红O染色取出经成脂诱导剂培养的hUMSCs，PBS洗涤2次，9 5 %酒精固定3 Q m i n，弃掉酒精，加入油红O稀释液ImI，室温下染色2 Q m i η ;双蒸水漂洗细胞2次，倒置相差显微镜(C - S H G，K i k οη，日本)下观察细胞染色情况并照相。
[0017]1.8 统计学分析
数据以X 土 s表示，采用SPSSl 1- 5统计软件进行方差分析及均数间比较。
[0018]2 结果
2.1 h UMS C s的形态及生长曲线
脐带组织块于接种后第2天其周围即有大量圆形细胞游出并贴壁生长，在第5天多数细胞贴壁生长并变为三角形或短梭形，第8天绝大部分细胞变为长梭形或杆状，且局部细胞开始逐渐汇合生长。传代的细胞多呈长梭形或分支状，在接种后第4天即大量汇合且呈漩涡状生长，部分传代的细胞出现集落样生长，传到I 5代细胞形态基本不变。细胞生长曲线表明，第I?2天为h UMS C s潜伏期，第3?5天为对数生长期；第6天后细胞生长明显减慢，进入平台期。各组之间比较显示，第3代h UMS C s增殖能力相对较强(附图1)。
[0019]2.2 hUCMSCs 超微结构
超微结构所示，h U C M S C形态不规则，核大不规则，核质比大，有2?3个明显核仁、核内染色质稀疏且弥散分布于细胞核内，胞质较少且分布于核周，细胞器较少见。
[0020]2.3 hUCMSCs表面分子表达
流式细胞仪检测显示细胞阳性表达C D 2 9，极弱阳性表达C D 3 4 ;阳性表达CD I O 5，极弱阳性表达C D 4 5。
[0021]2.4 免疫细胞化学检测结果
免疫细胞化学检测显示，h U CMS C s强阳性表达C D 4 4、C D 9 O分子，弱阳性表达C D 3 4分子，
2.5 hUCMSCs向成骨和成脂细胞诱导分化
成骨诱导剂诱导培养3 O d后，大部分h U C M S C s碱性磷酸酶染色呈阳性表达，多数细胞胞质出现较多的棕黄色颗粒；经成脂肪细胞诱导剂诱导培养3 O d后，多数细胞胞质内出现大量脂滴，被油红O染为棕红色。
[0022]3 讨论
MSC s是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。在体内或体外特定的诱导条件下，MS C s可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉等多种成体细胞，是组织再生医学的一种较为理想的种子细胞，以往临床MS C s移植的研宄多是采用骨髓来源MSC s和脐带血来源的MSCs，但二者均有不同程度的缺点，骨髓取材是创伤性手术，会给骨髓供者造成身体上和心理上的伤害，同时还会给供者带来传染性及感染性疾病，而脐带血MSCs的增殖性较低，数量不能充分满足临床对MSCs的需求，hUMSC s是新近发现的一种具有较好应用前景的间充质干细胞，其来源材料充足。若脐带来源的MS C s也具有很强的增殖和分化能力，将可作为干细胞移植治疗和再生医学的理想选择。目前，国际细胞治疗协会(I S C T) M S C s委员会已经制定出了一系列标准来鉴定间充质干细胞[，包括三方面:细胞形态学鉴定、细胞表面抗原表型分析以及多向分化潜能，本课题组除了按照ISCT的标准对培养细胞进行基本形态学观察及生长曲线检测、流式细胞仪分析细胞表面标记分子和向成骨、成脂诱导分化能力三方面鉴定外，还较系统的研宄了培养细胞的超微结构特点。本实验采取组织块培养法从脐带中分离培养h U C M SC s，分离的细胞传代培养后呈长梭形，形态与骨髓间充质干细胞相似，呈漩涡状生长，与国内外研宄报道基本一致；通过传统计数法绘制第3、5、6代细胞生长曲线发现，细胞第I?2天为潜伏期，第3?5天为对数生长期，6 d后进入平台期，以第3代细胞的增殖能力较强，细胞群体倍增时间约为6 9 h，且细胞可稳定传到I 5代左右，其形态及增殖分化能力基本不变。所以后续实验所用的细胞均为培养的第3代hUCMSCs。迄今为止，间充质干细胞尚未发现特异性的膜表面相关抗原分子。以往的研宄表明成熟MSC s稳定且高表达CD29、CD44、CD9Q、CD1Q5等膜表面标记分子，不表达或较低表达CD14、CD34、CD45等内皮细胞和造血细胞特异性分子，荧光标记抗体染色流式细胞仪检测及免疫细胞化学染色法是一种鉴定细胞膜表面标记分子表达的重要方法，本实验结果显示，细胞阳性表达CD44、CD90、CD29和CDlO 5等膜表面标记分子，阴性表达CD34和CD4 5分子，与以往研宄结果一致，为进一步确定所培养的细胞是否具有间充质干细胞的多向分化能力，本实验采取分别添加成骨、成脂诱导因子对培养的细胞进行诱导分化，于诱导的第3 O天，分别给予碱性磷酸酶染色和油红O染色显示诱导分化情况，结果显示胞浆内碱性磷酸酶及油红O均呈阳性表达，提示所诱导的细胞已向成骨、成脂方向分化。表明培养的细胞符合间充质干细胞的多向分化特性。近年来，国内外学者对间充质干细胞的研宄主要体现在细胞形态学、表面标记分子、诱导分化潜能方面，但对其超微结构特点的研宄少见。本实验用透射电镜观察培养的细胞，发现h UCMS C胞核大，核质比较大，可见明显核仁，核内常染色质比较疏松，胞质量少，细胞器较少见。核质比大提示细胞处于幼稚状态，核仁明显、常染色质疏松、弥散于核内提示细胞处于分裂间期。以上研宄结果表明，所培养的细胞基本符合M S C s委员会制定的鉴定MSCs的标准，可确认为人脐带间充质干细胞，这一结果将为后续试验提供具有较强增殖能力及诱导分化潜能的种子细胞。
【权利要求】
1.一种人脐带间充质干细胞的分离培养及超微结构特点研宄方法，其特征在于:该方法采用组织块植入法培养原代h U C M S C s，绘制细胞生长曲线，根据细胞生长状态选第3代h U CMS C s进行实验，流式细胞术、透射电镜和免疫细胞化学等技术研宄hUCMSCs的生物学特性。
【文档编号】C12N5/0775GK104480067SQ201410751410
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月10日 优先权日:2014年12月10日
【发明者】敖云霞 申请人:敖云霞