一种三叶青基因组dna提取纯化的方法
【专利摘要】本发明公开了一种三叶青基因组DNA提取纯化的方法，包括如下步骤：将三叶青叶片纯化后加入细胞核裂解缓冲液，于65℃水浴后采用萃取液进行萃取，取上清液，加入等体积的异丙醇沉淀，得到DNA沉淀物；依次用70％乙醇、75％乙醇洗涤DNA沉淀物，干燥，加入TE缓冲液，待DNA沉淀物溶解后加入RNA消化酶、于37℃水浴消化，得到三叶青基因组DNA。本发明制备得到的三叶青基因组DNA的质量好，其叶绿素DNA和线粒体DNA含量低，所含多糖、多酚、色素、蛋白质等杂质少，纯化后DNA的OD260/OD280达到了1.954，浓度为866ng/μL，可以用于构建遗传图谱和基因组测序等方面研究。
【专利说明】一种三叶青基因组DNA提取纯化的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于DNA提取纯化【技术领域】，特别涉及一种三叶青基因组DNA提取纯化的方法。
【背景技术】
[0002]三叶青又名金线吊葫芦、丝线吊金钟、三叶扁藤、石老鼠等，系葡萄科崖爬藤属植物三叶青Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg.，以块根或全草入药，具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛等功效，主治小儿高热惊厥、百日咳、疔疮痈疽、淋巴结结核、痢疾、支气管炎、肺炎、咽喉炎、肝炎及病毒性脑膜炎，外用治毒蛇咬伤，扁桃体炎，蜂窝织炎，跌打损伤，主要分布于浙江、江西、福建、湖北、湖南、广东、四川等地区。
[0003]二叶青的提取制剂对食道癌、胃癌、肺癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、胆囊癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病、淋巴癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌等多种原发癌、转移癌等均具有很好的治疗作用。对肿瘤化疗带来的种种不良反应，如食欲低下、呕吐、恶心、头发脱落以及白细胞减少等都有明显的改善作用，对晚期患者有缓解疼痛作用，还能有效地提高人体的免疫功能。三十年前，中国的三叶青资源极为丰富，野生三叶青除作药用外，还常做菜肴食用。随着社会的发展、自然环境的恶化、以及人们无节制地乱采滥挖，致使野生三叶青野生资源枯竭，濒临灭绝。三叶青为多年生植物，次生代谢产物多，DNA提取纯化难，如何有效地利用三叶青资源，提取纯化其DNA，成为大家关注的一个难题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点与不足，提供一种三叶青基因组DNA提取纯化的方法。
[0005]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种三叶青基因组DNA提取纯化的方法，包括如下步骤:将三叶青叶片纯化后加入细胞核裂解缓冲液，于65°C水浴40min后采用萃取液进行萃取，取上清液，加入等体积的异丙醇沉淀，得到DNA沉淀物；依次用70%乙醇、75%乙醇洗涤DNA沉淀物，干燥，加入TE缓冲液(Tris-EDTA缓冲液)，待DNA沉淀物溶解后加入RNA消化酶、于37°C水浴消化30min，得到三叶青基因组DNA，于_20°C保存备用。
[0006]所述的三叶青叶片优选为研磨成颗粒状的三叶青叶片；
[0007]所述的三叶青叶片优选采用如下方法研磨成颗粒状的三叶青叶片:剪取三叶青当年生新鲜叶片，去离子水清洗三遍，晾干后放入研钵中，加入pvp (聚乙烯吡咯烷酮)，液氮中研磨至颗粒状的三叶青叶片。
[0008]所述的纯化优选采用如下方法进行:将三叶青叶片置于盛有细胞核纯化液的离心管中进行纯化，离心，取沉淀，得到纯化后的三叶青叶片；
[0009]所述的细胞核纯化液由如下成分组成:100mM Tris-HCl pH 8.0、20mM EDTA、0.25MNaCl以及2wt% β -巯基乙醇。
[0010]所述的细胞核裂解缓冲液由如下成分组成:2wt % CTAB、2wt % PVP, 10mMTris-HCl pH8.0、25mM EDTA 及 2.0M NaCl。
[0011]所述的萃取液为体积比为24:1的氯仿-异戊醇。
[0012]所述的萃取的次数优选为两次。
[0013]所述的沉淀采用如下方法进行:-20°C冰箱放置30min。
[0014]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:本发明通过将三叶青叶片纯化后加入细胞核裂解缓冲液进行裂解，然后通过TE缓冲液溶解和RNA消化酶消化，得到三叶青基因组DNA。该三叶青基因组DNA的质量好，其叶绿素DNA和线粒体DNA含量低，所含多糖、多酚、色素、蛋白质等杂质少，纯化后DNA的0D260/0D280达到了 1.954，浓度为866ng/ μ L，可以用于构建遗传图谱和基因组测序等方面研宄。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为实施例1的三叶青基因组DNA提取纯化的流程示意图。
【具体实施方式】
[0016]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0017]实施例1
[0018]如图1所示，本发明提供了一种三叶青基因组DNA提取纯化的方法，包括如下步骤:
[0019]剪取三叶青当年生新鲜叶片，去离子水清洗三遍，瞭干后放入研钵中，加入pvp，液氮中研磨至粉末；将粉末转入盛有细胞核纯化液的离心管中进行纯化(细胞核纯化液由如下成分组成:100mMTris-HCl pH 8.0、20mM EDTA、0.25M NaCl 以及 2wt% β-巯基乙醇)，将得到的细胞核纯化液离心，取沉淀，加入预热好的细胞核裂解缓冲液，65°C水浴进行裂解消化60min(细胞核裂解缓冲液由如下成分组成:2wt% CTAB,2wt% PVPUOOmMTris-HCl (pH8.0)、25mM EDTA、2.0M NaCl)，取上清，加入等体积的氯仿-异戊醇(V:V =24:1)进行萃取，离心，取上清，重复萃取I次，合并上清，加入等体积的异丙醇，轻缓颠倒混匀，-20°C冰箱放置30min，离心，取沉淀，依次用70%与75%乙醇漂洗各I次，室温微干，加入Tris-EDTA缓冲液溶解，再加入RNA消化酶，37°C水浴消化RNA 30min，得到三叶青基因组DNA，于-20°C保存备用。
[0020]得到的三叶青基因组DNA的质量好，其叶绿素DNA和线粒体DNA含量低，所含多糖、多酚、色素、蛋白质等杂质少，纯化后DNA的0D260/0D280达到了 1.954，浓度为866ng/μ L，可以用于构建遗传图谱和基因组测序等方面。
[0021]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护。
【权利要求】
1.一种三叶青基因组DNA提取纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤:将三叶青叶片纯化后加入细胞核裂解缓冲液，于65°C水浴40min后采用萃取液进行萃取，取上清液，加入等体积的异丙醇沉淀，得到DNA沉淀物；依次用70%乙醇、75%乙醇洗涤DNA沉淀物，干燥，加入TE缓冲液，待DNA沉淀物溶解后加入RNA消化酶、于37°C水浴消化30min，得到三叶青基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的三叶青基因组DNA提取纯化的方法，其特征在于，所述的三叶青叶片为研磨成颗粒状的三叶青叶片。
3.根据权利要求2所述的三叶青基因组DNA提取纯化的方法，其特征在于，所述的三叶青叶片采用如下方法研磨成颗粒状的三叶青叶片:剪取三叶青当年生新鲜叶片，去离子水清洗三遍，瞭干后放入研钵中，加入pvp，液氮中研磨至颗粒状的三叶青叶片。
4.根据权利要求1所述的三叶青基因组DNA提取纯化的方法，其特征在于，所述的纯化采用如下方法进行:将三叶青叶片置于盛有细胞核纯化液的离心管中进行纯化，离心，取沉淀，得到纯化后的三叶青叶片。
5.根据权利要求4所述的三叶青基因组DNA提取纯化的方法，其特征在于，所述的细胞核纯化液由如下成分组成:10mM Tris-HCl pH 8.0、20mM EDTA、0.25MNaCl以及2wt%β-巯基乙醇。
6.根据权利要求1所述的三叶青基因组DNA提取纯化的方法，其特征在于，所述的细胞核裂解缓冲液由如下成分组成:2wt% CTAB、2wt% PVP、100mM Tris-HCl ρΗ8.0、25mM EDTA及 2.0M NaCl。
7.根据权利要求1所述的三叶青基因组DNA提取纯化的方法，其特征在于，所述的萃取液为体积比为24:1的氯仿-异戊醇。
8.根据权利要求1所述的三叶青基因组DNA提取纯化的方法，其特征在于，所述的沉淀采用如下方法进行:-20°C冰箱放置30min。
【文档编号】C12N15/10GK104450681SQ201410763362
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月11日 优先权日:2014年12月11日
【发明者】华金渭, 朱波, 吉庆勇, 程文亮 申请人:丽水市农业科学研究院