一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子及其编码蛋白、制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的编码蛋白，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的制备方法，本发明还公开了一种上述紫花苜蓿MsWRKY33转录因子在提高拟南芥株系耐盐性中的应用。本发明在基因工程改良牧草的研究中，特别是耐盐性改良的转基因新种质创制中发挥重要作用。
【专利说明】一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子及其编码蛋白、制备方法 和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和基因工程【技术领域】，具体涉及一种紫花苜蓿MSWRKY33 转录因子，本发明还涉及一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的编码蛋白，本发明还涉及一种 紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的制备方法，本发明还涉及一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子 在提尚拟南芥株系耐盐性中的应用。
【背景技术】
[0002] WRKY转录因子是植物中一类比较大的转录因子家族，这类转录因子蛋白包括一个 或两个保守的WRKYGQK序列（由此而命名为WRKY)，C端通常有锌指结构。WRKY蛋白可以和 启动子序列中的W-box结合来调节靶标基因的表达。很多证据表明：WRKY转录因子广泛的 参与植物的生长发育以及各种生理过程，也参与植物抵抗逆境的过程。WRKY转录因子逆境 防御功能研宄取得极大进展，但大多集中在生物胁迫，如抗真菌/病原菌和虫害等生物逆 境的胁迫，关于非生物胁迫研宄较少。现有的研宄表明，许多WRKY转录因子表达受非生物 胁迫，如高盐、干旱、伤害等诱导。结构相近的WRKY基因受诱导方式基本相同，如AtWRKY25、 AtWRKY33都受NaCl、干旱、冷等诱导。超表达WRKY转录因子可以提高植物抗逆性。超表达 OsWRKY45增强了转基因拟南芥抗旱性和抗盐性。过表达AtWRKY25或AtWRKY33均提高了 转基因拟南芥耐盐性，超表达大豆（Glycine max)GmWRKY54增强转基因拟南芥抗旱性、抗盐 性；超表达GmWRKY21增强抗冷性。玉米的ZmWRKY33受高盐、干旱、冷以及外源ABA诱导，转 基因拟南芥具有更强耐盐性。
[0003] 紫花苜蓿是重要豆科牧草，不仅是家畜日粮中不可缺少组分，而且是生态恢复、土 壤改良的优选植物。近年来，苜蓿干草消费逐年增加，同时紫花苜蓿种植面积也迅猛扩大， 但干旱、高盐、冷害等非生物胁迫极大影响其产量和品质的提高。紫花苜蓿属于异花授粉的 四倍体豆科牧草，其遗传转化困难，生长周期长，基因功能的研宄比较滞后，到目前为止，对 紫花苜蓿WRKY转录因子功能深入研宄几乎是空白。因此，对这一重要豆科植物WRKY转录 因子的研宄，不仅在理论上有助于我们对其抗性机理的了解，为通过分子改良来增强其抗 逆能力提供理论基础，同时对其它豆科植物的抗逆研宄也有着积极的推动作用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种紫花苜蓿MSWRKY33转录因子，具体涉及一个紫花苜蓿 抗逆相关的MsWRKY33转录因子基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。为进一步研宄紫 花苜蓿WRKY基因的功能，以及WRKY转录因子基因改良牧草抗逆性，特别是分子改良抗盐性 的应用奠定基础。
[0005] 本发明的另一目的是提供一种紫花苜蓿盐诱导MsWRKY33转录因子的编码蛋白。
[0006] 本发明的另一目的是提供一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的制备方法。
[0007] 本发明的另一目的是提供一种上述的紫花苜蓿盐诱导MsWRKY33转录因子在创建 改良抗逆性植物基因工程株系中的应用。
[0008] 本发明所采用的第一技术方案是，一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子，其核苷酸序 列如SEQIDNO. 1所示。
[0009] 本发明所采用的第二技术方案是，一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的编码蛋白， 其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0010] 本发明所采用的第三技术方案是，一种紫花苜蓿MSWRKY33转录因子的制备方法， 具体按照以下步骤实施：
[0011] 步骤1、采用Trizol试剂法提取紫花苜蓿总RNA ;
[0012] 步骤2、对步骤1中提取的紫花苜蓿总RNA进行RACE克隆基因cDNA全长，并对PCR 产物进行胶回收；
[0013] 步骤3、构建PCR产物的重组质粒，并转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，得到菌液；
[0014] 步骤4、对得到的菌液进行PCR检测，挑选阳性菌液，送Invitrogen公司进行测序， 将序列进行拼接，得到紫花苜蓿MsWRKY33转录因子序列，紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的氨 基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0015] 上述技术方案中，
[0016] 进一步地，采用Trizol试剂法提取紫花苜蓿总RNA具体按照以下步骤实施：
[0017] 步骤1. 1、将0. 3g左右紫花苜蓿材料加入大约3000 y 1 Trizol试剂，加入液氮快 速磨碎，放在无菌环境中直至变为匀浆；
[0018] 步骤1. 2、用移液枪吸取大约lmL勾衆到1. 5mL Eppendorf离心管中，剧烈振荡混 勾，于室温放置5min，4°C，13000rpm离心10min ;
[0019] 步骤1. 3、取上清，加入200 y L氯仿，剧烈振荡，室温放置2-3min，4°C，13, OOOrpm 离心15min ;
[0020] 步骤1. 4、溶液从下到上依次分为三层：有机相、蛋白质、无色水相；取上层移入新 Eppendorf离心管，加等体积氯仿，重复第3步；
[0021] 步骤1. 5、取其上清加入等体积异丙醇，混合混勾，室温放置10min左右，4°C，13， OOOrpm离心10min，得到白色RNA沉淀；
[0022] 步骤1. 6、弃上清，加1000 y L用DEPC水配制的75%乙醇，将沉淀冲起，于4°C， 13000rpm离心10min，倒掉乙醇，留下沉淀；
[0023] 步骤1. 7、重复第6步，在无菌环境下晾干，加20?50 y 1无菌DEPC水溶解；进行 RNA电泳，检测RNA提取质量，IMPLEN微量核酸蛋白分析仪测定RNA浓度。
[0024] 进一步地，步骤1中提取的紫花苜蓿总RNA进行RACE-readycDNA合成具体按照 以下步骤实施：
[0025] 步骤 2. 1、RACE-ready cDNA 的合成；
[0026] 步骤2. 1. 1、准备缓冲液：2. 0 y 1 5X 第一链缓冲液，1. 0 y l、20mM的DTT，1. 0 y 1、 10mM 的 dNTP Mix ;
[0027] 步骤 2. 1. 2、制备用于 5' RACE 的 cDNA 反应液：2. 75y1 RNA, 1. 0y1 5' -CDS Primer A，制备用于 3' RACE 的 cDNA :3. 75 y 1 RNA，1. 0 y 1 3' -CDS PrimerA ;
[0028] 步骤2. 1. 3、将步骤2. 1. 2中制备好的液体混匀，离心，72 °C孵育3分钟，再于42 °C 冷却2分钟，离心收集反应液液体；
[0029] 步骤2. 1. 4、向5'RACE的cDNA反应液中加入1 y 1的SMARTer IIA oligo,离心收 集液体；
[0030] 步骤 2. 1. 5、制备 5' RACE 和 3' RACE-Ready cDNA 反应液：4. 0 y 1 的步骤 2. 1. 1 得 到的缓冲液，〇. 25 y 1 RNA酶抑制剂40U/ y 1，100U、1. 0 y 1 SMARTScribe逆转录酶；
[0031] 步骤2. 1. 6、向步骤2. 1. 3中得到的3' RACE和步骤2. 1. 4中得到的5' RACE反应 液中分别加入5. 25 y 1步骤2. 1. 5中得到的反应液，混合，离心收集液体；
[0032] 步骤2. 1. 7、将制备好的反应液于42°C中孵育90分钟；70°C加热10分钟，完成 Ready-cDNA 的合成；
[0033] 步骤2. 2、cDNA末端的快速合成；
[0034] 步骤2. 2. 1、制备足够的PCR混合液：每50 y 1 PCR反应体系中加入以下试剂： 34.5yl PCR 用水，5.0yl lOXAdvantage 2PCR 缓冲液，1.0yl、10mM 的 dNTP Mix，1.0yl 50 X Advantage 2聚合酶Mix，混合液体，离心收集液体；
[0035] 步骤2. 2. 2、制备用于 5'RACE 的PCR反应液：2. 5 y 1 5'RACE-ready c DNA，5. 0 y 1 UPM(10X)，1.0yl GSP1，其氨基酸序列如SEQ ID勵.3所示；41.5以1的步骤2.2.1中制 备的PCR混合液；
[0036] 制备用于 3'RACE 的 PCR 反应：2. 5 y 1 3'RACE-ready cDNA, 5. 0 y 1 UPM(IOX)， 1. 0 y 1 GSP2,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示；41. 5 y 1的步骤2. 2. 1中制备的PCR混 合液；
[0037] 步骤2. 2. 3、RACE扩增：反应体系为：94°C 30秒，72 °C 3分钟，共5个循环：94°C 30 秒，70°C 3分钟，72°C 3分钟，共5个循环；94°C 30秒，68°C 30秒，72°C 3分钟，共20个循 环；得到PCR产物；
[0038] 取PCR产物于1. 0重量％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，回收目的条带。
[0039] 步骤3中的构建PCR产物的重组质粒，并转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，得到菌 液，具体按照以下步骤实施：
[0040] 步骤3. 1、用T4DNA连接酶连接回收产物于PMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5 a 感受态细胞，DH5 a感受态细胞在冰上融化，吸取50 y 1，加入5 y 1的DNA连接产物，混合均 匀后冰浴30min ;
[0041] 步骤 3. 2、42°C热击 60sec，立即冰浴 3-5min ;
[0042] 步骤3. 3、加入700 y 1 LB液体培养基，于150r/min条件下37°C恒温振荡器上培 养 60min ;
[0043] 步骤3. 4、5000rmp离心3min收集菌体；
[0044] 步骤3. 5、LB平板上涂布2%的15-溴-4-氯-3-吲哚-0 -D-半乳糖苷和50mg/ ml的异丙基硫代-0 -D-半乳糖苷，均匀涂布平板表面，常温晾干；
[0045] 步骤3. 6、取100 y 1菌液均匀涂布于含100mg/L抗生素Amp的LB平板上，培养箱 中37°C倒置培养过夜；次日将平板放入4°C放置使之充分显色
[0046] 步骤3. 7、挑选白色单菌落于1ml LB液体培养基中，其中，Amp终浓度100mg/L， 225r/min 37°C 培养过夜。
[0047] 本发明所采用的第四技术方案是，上述紫花苜蓿MsWRKY33转录因子在提高拟南 芥株系耐盐性中的应用。
[0048] 本发明的有益效果是：本发明基于对苜蓿中抗逆性的生物学机制的研宄，一方面 提供了苜蓿MsWRKY33转录因子基因及该基因编码蛋白，另一方面还提供了含有所述苜蓿 MsWRKY33转录因子基因的表达载体和细胞，以及培育耐盐性提高的拟南芥的方法，还提供 了它们的应用。
[0049] 本发明对了解WRKY基因在牧草耐盐和其他逆境因子中的作用，对牧草抗逆分子 辅助育种具有非常重要的意义。本发明提供的苜蓿MsWRKY33基因在拟南芥中的增强表达 可以显著提高拟南芥的耐盐性。本发明的重要应用前景在于：该基因的发现为提高主要牧 草植物（特别是豆科植物，如紫花苜蓿）中耐盐性提供了基因资源，在基因工程改良牧草的 研宄中，特别是耐盐性改良的转基因新种质创制中发挥重要作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0050] 图1是对紫花苜蓿植株进行农杆菌介导的MSWRKY33基因同源转化所用的插入有 MsWRKY33基因的PBI121载体的结构；
[0051] 图2是转MsWRKY33基因的拟南芥株系（Ll，L2, L5, L6, L9, L13)与空载体对照株 系（CK)盐处理5天后的比较分析结果；
[0052] 图3是转MsWRKY33基因的拟南芥株系（Ll，L2, L5, L6, L9, L13)与空载体对照株 系（CK)盐处理处理10天后的比较分析结果。
【具体实施方式】
[0053] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0054] 实施例1紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的制备
[0055] 本发明提供的紫花苜蓿MsWRKY33转录因子基因是通过以下方法筛选得到的：
[0056] 通过发明人之前所进行的紫花苜蓿耐盐转录组测序结果（Z. Wang，G. Yu，B，Shi，et al. , Development and Characterization of Simple Sequence Repeat(SSR)Markers Based on RNA-Sequencing of Medicago sativa and In silico Mapping onto the M. truncatula Genome. PLOS one, 2014, 9 (3) : e92029)，以及 BLAST 对比分析，获得了 一段与已公布的近源物种WRKY基因高度同源的Unigene序列。利用SMARTer? RACE 〇0敵411^11;1^〇31:;[0111(;[1:((]1〇1^6(311，1134)分别对该1111186116序列进行5'狀0￡和3'狀0￡克 隆，最后获得了该基因全长序列（SEQ ID NO. 1)。其中，基因克隆的方法为分子生物学领域 的常规实验操作，具体方法如下：
[0057]1、紫花苜蓿总RNA的提取：
[0058] 紫花苜蓿总RNA的提取采用Trizol试剂法，具体步骤如下：
[0059] (1)将0. 3g左右紫花苜蓿材料加入大约3000y1Trizol试剂，加入液氮快速磨 碎，放在无菌环境中直至变为匀浆。
[0060] (2)用移液枪吸取大约lmL勾衆到1. 5mL Eppendorf离心管中，剧烈振荡混勾，于 室温放置 5min，4°C，13, OOOrpm 离心 10min。
[0061] (3)取上清，加入200 y L氯仿，剧烈振荡，室温放置2-3min，4°C，13, OOOrpm离心 15min〇
[0062] (4)溶液从下到上依次分为三层：有机相、蛋白质、无色水相；取上层移入新 Eppendorf离心管，加等体积氯仿，重复第3步。
[0063] (5)取其上清加入等体积异丙醇，混合混勾，室温放置lOmin左右，4°C，13, OOOrpm 离心lOmin，得到白色RNA沉淀。
[0064] (6)弃上清，加 1000 u L 75% 乙醇（用 DEPCDEPC (diethyl pyrocarbonate，焦碳酸 二乙酯）水配制），将沉淀冲起，于4°C，13000rpm离心10min，倒掉乙醇，留下沉淀。
[0065] (7)重复第6步，在无菌环境下晾干。加20?50 y 1无菌DEPC水溶解。
[0066] 进行RNA电泳，检测RNA提取质量，頂PLEN微量核酸蛋白分析仪测定RNA浓度。
[0067] 2、RACE克隆基因cDNA全长
[0068] RACE_ready cDNA 的合成
[0069] (1)准备缓冲液：2.0yl5X 第一链缓冲液（First-StrandBuffer)，1.0yl DTT(20mM),1. 0U1dNTPMix(lOmM)；
[0070] (2)制备用于 5'RACE 的 cDNA 反应液：2. 75y1 RNA，1. 0y1 5' -CDS Primer A，制 备用于 3' RACE 的 cDNA 反应液：3. 75 y 1 RNA，1. 0 y 1 3' -CDS Primer A ;
[0071] (3)将步骤⑵中制备好的液体混勾，短暂离心，72°C孵育3分钟，再于42°C冷却 2分钟，短暂离心收集反应液液体；
[0072] (4)向5' RACE的cDNA反应液中加入1 y 1的SMARTer IIA oligo,短暂离心收集 液体；
[0073] (5)制备 5'RACE 和 3'RACE-Ready cDNA 反应液（Master Mix) :4. 0 y 1 步骤（1)中 得到的缓冲液，〇? 25 y 1 RNA酶抑制剂（40U/ y 1)，1. 0 y 1 SMARTScribe逆转录酶（100U)， 将以上试剂混匀；
[0074] (6)向步骤（3)中得到的3'RACE和步骤⑷中得到的5'RACE反应液中分别加入 5. 25 y 1步骤（5)中得到的反应液，轻柔混合，短暂离心收集液体；
[0075] (7)将制备好的反应液于42°C中孵育90分钟；
[0076] (8)70°〇加热10分钟，完成1^&(^-〇0嫩的合成。
[0077] RACE引物的设计
[0078] (1)基因特异引物（Gene-Specific Primers，GSPs)满足以下条件：23 - 28bp ;GC 含量50 - 70% ;Tm值最好>70°C ;与3' -端通用引物（Universal Primer Mix，试剂盒提 供）不发生互补。
[0079] (2)需设计两个GSP引物，反向引物（GSP1)用于5' RACE,正向引物（GSP2)用于 3' RACE。
[0080]根据以上原则，设计GSP1 (5' -AGAGCAGTGATTAGACTCGGTGGCA-3'，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 3 所示）和 GSP2(5' -AGACCCTGGCAGAACAAGA AGCA-3'，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 4所示）两条引物。
[0081] cDNA末端的快速合成
[0082] (1)制备足够的PCR混合液（Master Mix):每50 y 1 PCR反应体系中加入以下试 剂：
[0083]34. 5 y 1 PCR 用水，5. 0 y 1 10 X Advantage 2PCR 缓冲液，1. 0 y 1 dNTP Mix(10mM)，1.0iil 50XAdvantage 2聚合酶Mix。轻轻混合液体，注意不要产生气泡，短暂 离心收集液体；
[0084] (2)制备用于 5' RACE 的 PCR 反应液：2. 5 y 1 5' RACE - ready cDNA，5. 0 y 1 UPM(IOX)，1. 0 y 1 GSP1 ;41. 5 y 1 的步骤（1)中制备的 PCR 混合液；
[0085] 制备用于 3'RACE 的 PCR 反应：2. 5 y 1 3'RACE-ready cDNA, 5. 0 y 1 UPM(IOX)， 1. 0 y 1 GSP2 ;41. 5 y 1的步骤（1)中制备的PCR混合液；
[0086] (3)1^￡扩增：反应体系为：94°0 30秒，721：3分钟，共5个循环：941：30秒，70°〇3 分钟，72 °C 3分钟，共5个循环；94°C 30秒，68 °C 30秒，72 °C 3分钟，共20个循环。
[0087] 取PCR产物于1. 0重量％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，回收目的条带，用T4DNA 连接酶（Takara)连接回收产物于PMD18_T(Takara)载体上，转化大肠杆菌DH5a感受态细 胞。
[0088] 3重组质粒的大肠杆菌转化
[0089](1)DH5 a感受态细胞在冰上融化，吸取50y1，加入5y1的DNA连接产物，混合均 匀后冰浴30min。
[0090] (2)42°C热击 60sec，立即冰浴 3-5min。
[0091] (3)加入700 y 1 LB液体培养基，37°C恒温振荡器（150r/min)上培养60min。
[0092] (4) 5000rmp离心 3min收集菌体。
[0093] (5) LB平板上（Amp)涂布X-gal (15-溴-4-氯-3-吲哚-0 -D-半乳糖苷，2% )和 IPTG (异丙基硫代--D-半乳糖苷，50mg/ml)，使其均匀涂布平板表面，常温晾干。
[0094] (6)取100 y 1菌液均匀涂布于含抗生素Amp(100mg/L)的LB平板上，培养箱中 37°C倒置培养过夜；次日将平板放入4°C放置使之充分显色。
[0095] (7)挑选白色单菌落于lml LB液体培养基中（Amp终浓度100mg/L)，225r/min 37 °C培养过夜。
[0096] 对菌液进行PCR检测，挑选阳性菌液，送Invitrogen公司进行测序。对结果进行 序列拼接，结果显示该基因具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列（1536bp)。
[0097] 实施例2农杆菌介导的MsWRKY33基因转化拟南芥植株
[0098] 1. 1、材料与试剂
[0099] 1. 1. 1、植物材料
[0100] 供试苜蓿品种为紫花苜蓿（Medicago sativa L. cv. Zhongmu No. 1，中苜一号）。
[0101] 1. 1. 2、农杆菌菌株和质粒载体
[0102] 所用的农杆菌菌株为根癌农杆菌：LBA4404(北京天恩泽基因科技有限公司）
[0103] 农杆菌培养基：
[0104]
【权利要求】
1. 一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. -种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的编码蛋白，其特征在于，其编码蛋白的氨基酸序 列如SEQ ID NO. 2所示。
3. -种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实 施： 步骤1、采用Trizol试剂法提取紫花苜蓿总RNA ; 步骤2、对步骤1中提取的紫花苜蓿总RNA进行RACE克隆基因 cDNA全长，并对PCR进 行胶回收； 步骤3、构建PCR产物的重组质粒，并转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，得到菌液； 步骤4、对得到的菌液进行PCR检测，挑选阳性菌液，送Invitrogen公司进行测序，将测 序结果进行拼接，得到紫花苜蓿MsWRKY33转录因子全长序列，紫花苜蓿MsWRKY33转录因子 的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
4. 根据权利要求3所述的紫花苜蓿WRKY转录因子的克隆方法，其特征在于，所述采用 Trizol试剂法提取紫花苜蓿总RNA具体按照以下步骤实施： 步骤1. 1、将0. 3g左右紫花苜蓿材料加入大约3000 y 1 Trizol试剂，加入液氮快速磨 碎，放在无菌环境中直至变为匀浆； 步骤1. 2、用移液枪吸取大约lmL勾衆到1. 5mL Eppendorf离心管中，剧烈振荡混勾，于 室温放置 5min，4°C，13000rpm 离心 lOmin ; 步骤1. 3、取上清，加入200 y L氯仿，剧烈振荡，室温放置2-3min，4°C，13, OOOrpm离心 15min ； 步骤1.4、溶液从下到上依次分为三层：有机相、蛋白质、无色水相；取上层移入新 Eppendorf离心管，加等体积氯仿，重复第3步； 步骤1. 5、取其上清加入等体积异丙醇，混合混勾，室温放置lOmin左右，4 °C，13， OOOrpm离心10min，得到白色RNA沉淀； 步骤1.6、弃上清，加 lOOOyL用DEPC水配制的75%乙醇，将沉淀冲起，于4°C， 13000rpm离心10min，倒掉乙醇，留下沉淀； 步骤1. 7、重复第6步，在无菌环境下晾干，加20?50 y 1无菌DEPC水溶解；进行RNA 电泳，检测RNA提取质量，IMPLEN微量核酸蛋白分析仪测定RNA浓度。
5. 根据权利要求3所述的紫花苜蓿WRKY转录因子的克隆方法，其特征在于，所述对步 骤1中提取的紫花苜蓿总RNA进行RACE-ready cDNA合成具体按照以下步骤实施： 步骤 2. 1、RACE-ready cDNA 的合成； 步骤 2. 1. 1、准备缓冲液：2. 0 y 1 5X 第一链缓冲液，1. 0 y l、20mM 的DTT，1. 0 y l、10mM 的 dNTP Mix ; 步骤 2. 1. 2、制备用于 5'RACE 的 cDNA 反应液：2. 75 y 1 RNA, 1. 0 y 15' -CDS Primer A， 制备用于 3' RACE 的 cDNA :3. 75 y 1 RNA，1. 0 y 1 3' -CDS Primer A ; 步骤2. 1. 3、将步骤2. 1. 2中制备好的液体混勾，离心，72°C孵育3分钟，再于42°C冷却 2分钟，离心收集反应液液体； 步骤2. 1. 4、向5'RACE的cDNA反应液中加入1 y 1的SMARTer IIA oligo,离心收集液 体； 步骤2. 1. 5、制备5' RACE和3' RACE-Ready cDNA反应液：4. 0 y 1的步骤2. 1. 1得到的 缓冲液，〇? 25 y 1 RNA 酶抑制剂 40U/ y 1，100U、1. 0 y 1 SMARTScribe 逆转录酶； 步骤2. 1. 6、向步骤2. 1. 3中得到的3' RACE和步骤2. 1. 4中得到的5' RACE反应液中 分别加入5. 25 y 1步骤2. 1. 5中得到的反应液，混合，离心收集液体； 步骤2. 1. 7、将制备好的反应液于42 °C中孵育90分钟；70 °C加热10分钟，完成 Ready-cDNA 的合成； 步骤2. 2、cDNA末端的快速合成； 步骤2.2. 1、制备足够的PCR混合液：每50 yl PCR反应体系中加入以下试剂： 34.5yl PCR 用水，5.0yl lOXAdvantage 2PCR 缓冲液，1.0yl、10mM 的 dNTP Mix，1.0yl 50 X Advantage 2聚合酶Mix，混合液体，离心收集液体； 步骤2.2.2、制备用于5'狀0￡的？〇?反应液：2.51115'狀0￡-代3(^〇0嫩，5.0111 UPM(10X)，1.0yl GSP1，其氨基酸序列如SEQ ID勵.3所示；41.5以1的步骤2.2.1中制 备的PCR混合液； 制备用于3'狀〇￡的？0?反应：2.51113'狀〇￡-代&(^〇0嫩，5.〇111即]\1(10\)， 1. 0 y 1 GSP2,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示；41. 5 y 1的步骤2. 2. 1中制备的PCR混 合液； 步骤2. 2. 3、RACE扩增：反应体系为：94°C 30秒，72°C 3分钟，共5个循环：94°C 30秒， 70°C 3分钟，72°C 3分钟，共5个循环；94°C 30秒，68°C 30秒，72°C 3分钟，共20个循环；得 到PCR产物； 取PCR产物于1. 0重量％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，回收目的条带。
6. 根据权利要求3所述的紫花苜蓿WRKY转录因子的克隆方法，其特征在于，所述步骤 3中的构建PCR产物的重组质粒，并转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，得到菌液，具体按照以 下步骤实施： 步骤3. 1、用T4DNA连接酶连接回收产物于PMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5 a感受 态细胞，DH5 a感受态细胞在冰上融化，吸取50 y 1，加入5 y 1的DNA连接产物，混合均匀后 冰浴30min ; 步骤3. 2、42°C热击60sec，立即冰浴3-5min ; 步骤3. 3、加入700 y 1 LB液体培养基，于150r/min条件下37°C恒温振荡器上培养 60min ； 步骤3. 4、5000rmp离心3min收集菌体； 步骤3. 5、LB平板上涂布2%的15-溴-4-氯-3-吲哚-0 -D-半乳糖苷和50mg/ml的 异丙基硫代-e -D-半乳糖苷，均匀涂布平板表面，常温晾干； 步骤3. 6、取100 y 1菌液均匀涂布于含100mg/L抗生素 Amp的LB平板上，培养箱中 37°C倒置培养过夜；次日将平板放入4°C放置使之充分显色 步骤3. 7、挑选白色单菌落于lml LB液体培养基中，其中，Amp终浓度100mg/L，225r/ min 37 °C培养过夜。
7. -种权利要求1所述的紫花苜蓿MsWRKY33转录因子在提高拟南芥株系耐盐性中的 应用。
【文档编号】C12N15/29GK104450740SQ201410783876
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月16日 优先权日:2014年12月16日
【发明者】王学敏, 王赞, 高洪文, 冯光燕, 付媛媛 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所