一种纤维素酶突变体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种纤维素酶突变体及其应用。该纤维素酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，最适作用温度为65℃，在70℃条件下能保持96％的酶活，在80℃条件下，仍能保持48％以上的酶活；而野生型的最适作用温度为60℃，在70℃时仅能保持51％的酶活，在80℃条件下，仅剩11％的酶活。本发明的纤维素酶突变体的最适作用pH为5.5，且在pH4.5-8.0范围内均能保持60％以上的酶活水平，而野生型仅在pH4.5-7.0范围内维持60％以上的酶活，至pH8.0时，酶活降为30％，从而说明本发明提供的纤维素酶突变体在碱性条件下的适用范围更加宽泛，比野生型更适合应用于纺织工业领域。
【专利说明】一种纤维素酶突变体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶工程【技术领域】，具体涉及一种纤维素酶突变体及其应用。
【背景技术】
[0002] 纤维素酶是由多种水解酶组成的一个复杂酶系，主要来源于真菌和细菌，如丝状 真菌Trichoderma reesei等可大量合成和分泌胞外纤维素酶。其中根据其催化反应的功 能不同，主要分为：外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶，纤维素酶对纤 维素的降解，是在多种酶组分的协同作用下完成的。纤维素酶是在工业中应用最广泛的酶 之一，一般应用于纺织工业、去污剂工业、纸浆和造纸工业、饲料和食品工业、在采油、医药 等方面也有巨大的潜在市场。
[0003] 纤维素酶可以按照其一级序列分类成各种糖基水解酶家族，这得到了家族一些成 员的三维结构分析的支持（Henrissat 1991，Henrissat和Bairoch 1993,1996)。例如，糖 基水解酶家族5、7、12和45含有内切葡聚糖酶。大多数纺织用酸性纤维素酶属于家族5,而 大多数纺织用中性纤维素酶为家族12或45。
[0004] 目前，利用纤维素酶对纤维素织物进行生物整理即酶降解整理，由于其环保、节能 和高效的效果而得到广泛应用。织物经整理蓬松、丰满、柔软、滑爽、布面清晰、悬垂性好、吸 湿性强，并具有一定的"丝光"效果，纤维素酶的用量在0. 5%-3%，即可达到满意的整理 效果。酸性纤维素酶在处理纤维织物时，在较短的时间内就产生有效的化学磨损效果，但它 对织物的剥蚀作用强，返沾染效果差，中性纤维素酶对织物的剥蚀作用比酸性纤维素酶弱， 需要较长的作用时间，但沾色较少，处理后可获得更加丰满的手感，因此在纺织工业应用广 泛，需求更为迫切，为了降低成本，节约能源，急需提高纤维素酶在中性偏碱性条件下的酶 活力水平。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种纤维素酶突变体及其应用。本发明通过对纤维素酶进 行蛋白质工程改造，获得了突变体蛋白，在碱性条件下的酶活力得到显著提高，且耐热性更 强，更适合应用于纺织工业领域。
[0006] 本发明一方面提供了一种纤维素酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID N0 :1的纤维 素酶第10位氨基酸由Cys变为Trp，第29位氨基酸由Ala变为Arg，第61位氨基酸由Thr 变为Ser，第141位氨基酸由Asp变为Lys，第216位氨基酸由Val变为His。
[0007] 上述纤维素酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO :3,其一种编码基因的核酸序列 为 SEQ ID N0 :4。
[0008] 本发明另一方面提供了携带有编码序列为SEQ ID NO :3的纤维素酶突变体基因的 质粒。
[0009] 将上述质粒转入里氏木霉中进行重组表达。
[0010] 本发明还提供了上述纤维素酶突变体在纺织领域中的应用。
[0011] 本发明所述纤维素酶突变体的最适作用温度为65°c，在70°C条件下能保持96% 的酶活，在80°C条件下，仍能保持48%以上的酶活；而野生型的最适作用温度为60°C，在 70°C时仅能保持51 %的酶活，在80°C条件下，仅剩11 %的酶活；从而说明纤维素酶突变体 的耐热性明显高于野生型。所述纤维素酶突变体的最适作用pH为5. 5,且在pH4. 5-8. 0范 围内均能保持60%以上的酶活水平，而野生型仅在pH4. 5-7. 0范围内维持60%以上的酶 活，至pH8. 0时，酶活降为30%，从而说明本发明提供的纤维素酶突变体在碱性条件下的适 用范围更加宽泛，比野生型更适合应用于纺织工业领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1为发酵上清液SDS-PAGE电泳分析图，
[0013] 其中M所示为蛋白Marker ;泳道1所示为里氏木霉工程菌McE发酵上清液中蛋白 表达情况；泳道2所示为里氏木霉工程菌McE5发酵上清液中蛋白表达情况；泳道3所示为 宿主菌里氏木霉SCHD4发酵上清液中蛋白表达情况；箭头所指处为分子量为48KDa的蛋白 条带；
[0014] 图2为纤维素酶突变体与野生型相对酶活-温度曲线图；
[0015] 图3为纤维素酶突变体与野生型相对酶活-pH曲线图。
【具体实施方式】
[0016] 本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如 MOLECULARCL0NING:ALABORATORYMANUAL, 3ndEd. (Sambrook,2001)和CURRENT PROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献 提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是本发明不限定于所述的任何具体方法、实 验方案和试剂。
[0017] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细描述。
[0018] 实施例1 :纤维素酶突变体基因的合成
[0019] 为了提高纤维素酶（野生型氨基酸序列为SEQIDN0:1，编码核苷酸序列为SEQ IDN0 :2,由上海生工生物工程股份有限公司合成）在中性偏碱性条件下的酶活力，通过定 向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选，设计PCR引物McE-Fl、McE-Rl如下：
[0020] McE-Fl:GGCGAATTCGCCAGCTGCTCCTCCGTCTA(下划线为限制件内切酶 EcoRI 识别位 点）
[0021] McE-Rl:ATAGCGGCCGCCTACAGGCACTGATGATACCAG(下划线为限制件内切酶 Notl 识 别位点）
[0022] 以SEQ ID N0:2基因为模板，以上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒 (Stratagene)进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、Notl进行酶切处理后与经同样酶 切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37°C倒置培 养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150iiL含有0. ImM IPTG的 LB+Amp培养基，37°C 220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁， 获得含有纤维素酶的大肠杆菌细胞裂解液。
[0023]分别取出50 ii L裂解液至两块新的96孔板，分别在pH 6. 0和pH 8. 0的条件下测 定其纤维素酶活，结果发现，有些突变子在碱性条件的酶活力没有变化，有些突变甚至使其 碱性耐受性降低了，对在pH 8. 0条件下依然保持高活性的突变子进行DNA测序，最终获得 了能显著提高纤维素酶碱性耐受性的突变位点组合C10W、A29R、T61S、D141K和V216H。
[0024] 含C10W、A29R、T61S、D141K和V216H五点突变的纤维素酶突变体，其氨基酸序列 为SEQ ID N0 :3,编码核苷酸序列为SEQ ID N0 :4, SEQ ID N0 :4由上海生工生物工程股份 有限公司合成完成，并且在合成序列5'和3'两端分别加上Kpnl和Xbal两个酶切位点。
[0025] 合成后的质粒用限制性内切酶Kpnl和Xbal (Fermentas)进行酶切；同时，用限制 性内切酶Kpnl和Xbal对载体pTG进行酶切；凝胶回收目的基因片段和载体；并用T4DNA连 接酶将上述两片段连接，转化Trans5 a大肠杆菌，用氨苄青霉素进行筛选。为确保准确，对 若干克隆进行测序（Invitrogen)。
[0026] 使用质粒中量制备试剂盒（Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质 粒，纤维素酶重组表达质粒命名为pTG_McE5。
[0027] 实施例2 :纤维素酶突变体木霉重组菌株的构建及验证
[0028] (1)原生质体制备
[0029] 取纤维素酶基因缺陷型的宿主菌里氏木霉SCHD4孢子悬液，接种于PDA平板上， 30°〇培养6天；待其产孢丰富后，切取约1〇1^1〇11的菌落置于含1201^￥￡6+以0.5%酵母 粉、1%葡萄糖、0. 1%尿苷）的液体培养基中，30°C，220rpm振荡培养14?16h;
[0030] 用无菌纱布过滤收集菌丝体，并用无菌水清洗一次；将菌丝体置于含有20mL 10mg/mL裂解酶液（Sigma L1412)的三角瓶中，30°C，90rpm作用l-2h;用显微镜观察检测 原生质体转化进展；
[0031] 将预冷的20mL 1. 2M山梨醇（1. 2M山梨醇，50mM Tris-Cl，50mM CaCl2)加入上述 三角瓶中，轻轻摇勻，用无菌Miracloth滤布过滤收集滤液，3000rpm，4°C离心10min ;弃上 清，加入预冷的5mL 1. 2M山梨醇溶液悬浮菌体，3000rpm，4°C离心10min ;弃上清，加入适量 预冷的1. 2M山梨醇悬浮分装（200 ii L/管，原生质体浓度为108个/mL)。
[0032] (2)表达载体转化与菌株验证
[0033] 以下操作均在冰上进行，取10 U g重组质粒加入到含有200 ii L原生质体溶液的 无菌 7mL 离心管中，然后加入 50iiL 25%PEG(25%PEG，50mM Tris-Cl，50mM CaCl2)，轻弹 管底混匀，冰上放置20min ;加入2mL 25% PEG，混匀后室温放置5min ;加入4mL 1. 2M山 梨醇，轻轻混匀后倒入熔化并保持在55°C的上层培养基中（0. 1 % MgS04, 1 % KH2P04, 0. 6% (NH4)2S04, 1%葡萄糖，18. 3%山梨醇，0. 35%琼脂糖）；轻轻混匀后铺在制备好的下层培养 基平板上（2%葡萄糖，0.5%(順4)2504，1.5%腿 2卩04,0.06%]\%504,0.06%〇3(：12，1.5%琼 脂），30°C培养5?7d至有转化子长出。
[0034] 挑取转化子至下层培养基平板，30°C培养2d;取适量菌丝体置于2mL离心管中，力口 入 100mg无菌石英砂和 400ii L抽提缓冲液（100mM Tris-HCl, 100mM EDTA, 250mM NaCl, 1% SDS);用珠打仪剧烈振荡2min ;65°C水浴20min后，加入200 ii L 10M NH4AC，冰浴lOmin ; 13000rpm离心lOmin ;取上清，加入2倍体积的无水乙醇，-20°C放置30min ;13000rpm离心 10min，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加水溶解，于-20°C保存。
[0035] 以上述提取转化子基因组DNA为模板，利用引物McE-F和McE-R进行PCR扩增目 的基因进行验证。
[0036] McE-F：GCCAGCTGCTCCTCCGTCTA
[0037] McE-R ：CTACAGGCACTGATGATACCAG ；
[0038] PCR 扩增条件为 94°C 4min ;94°C 40s ;58°C 40s，72°C lmin，30 个循环；72°C 7min， 16°C;利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物并进行测序分析，构建得到了含纤维素酶突变 体基因的里氏木霉工程菌，将其命名为里氏木霉McE5(Trichoderma reesei McE5)。
[0039] 采用上述同样的方法构建得到重组表达野生型纤维素酶的里氏木霉工程菌，命名 为里氏木霉McE(TrichodermareeseiMcE)。
[0040] 实施例3发酵验证和酶活检测
[0041] 将上述里氏木霉工程菌McE与里氏木霉工程菌McE5接种于PDA平板，30°C培养 6d，待孢子丰富后，取两块直径lcm的菌丝块接种于含有50mL发酵培养基的250mL三角 瓶中（1.5%葡萄糖，1.7%乳糖，2.5%玉米浆，0.44%(順4)2504,0 . 09%]\%504,2%腿2?04， 0.04%0&(：1 2,0.018%吐温-80,0.018%微量元素），301：培养48小时，然后251：培养48小 时，将发酵液离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图1所示，泳道1，2所述里氏 木霉工程菌McE和里氏木霉工程菌McE5发酵上清液在48KDa处均有一明显蛋白条带，与本 发明重组表达的纤维素酶的理论分子量大小一致，而泳道3所述宿主菌里氏木霉SCHD4发 酵上清液在48KDa处无明显蛋白条带，从而说明本发明构建得到的里氏木霉工程菌McE能 有效重组表达野生型纤维素酶，里氏木霉工程菌McE5能有效重组表达纤维素酶突变体。 [0042] (1)酶活测定方法
[0043] 在50°C、pH值为4. 8(中性为pH6. 0)的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的轻甲基 纤维素钠溶液中降解释放1 U mol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U，还原糖以葡萄 糖等量。
[0044] 取三支试管各加入0. 5mL CMC底物，与待测酶液一起50°C水浴预热5min。在第 一、二试管中各加入0. 5mL待测液，并计时，50°C水浴中反应15min。反应完后在三支试管 中各加入1. 5mLDNS试剂，并在第三支试管总补加0. 5mL的待测酶液。取出并摇匀三支试管 后，在沸水浴中反应5min。迅速冷却至室温，用水定到5. OmL。以第三支试管试液为对照在 540nm波长条件下测第一、二试管试液的吸光度，吸光度在0. 25-0. 35之间为宜。待测酶液 反应液的吸光度与水平控制酶液反应液吸光度之差的绝对值不超过0. 015。
[0045] 酶活X =(葡萄糖等量值/180/15/0. 5) X n
[0046] 其中：X-酶活力单位，IU/g(mL);
[0047] 180--葡萄糖从微克换算成微摩尔；
[0048] 15--待测液与底物的反应时间；
[0049] 0. 5-加入反应的待测酶液量；
[0050] n--稀释倍数；
[0051] (2)酶活测定结果
[0052] 采用上述方法检测上述发酵上清液的酶活，结果显示：宿主菌里氏木霉SCHD4发 酵上清液中几乎检测不出纤维素酶酶活，重组表达野生型纤维素酶的里氏木霉工程菌McE 发酵上清液酶活为115U/mL，而重组表达纤维素酶突变体的里氏木霉工程菌McE5发酵上清 液酶活为140U/mL。酶活检测结果进一步证实，本发明所选用的宿主菌本身不产纤维素酶， 而本发明构建的里氏木霉工程菌McE能高效表达野生型纤维素酶，里氏木霉工程菌McE5能 高效表达纤维素酶突变体。
[0053] 实施例4酶学性质分析
[0054] 1、最适作用温度
[0055] 分别在 2(TC、3(TC、35t：、4(rC、45t：、5(rC、55t：、6(rC、65t：、7(rC、8(rC，pH6. 0 条 件下测定里氏木霉工程菌McE和里氏木霉工程菌McE5的发酵上清液酶活，以最高酶活为 100 %，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果如图2所示，本发明所述纤维素酶突变 体的最适作用温度为65°C ;在70°C条件下能保持96%的纤维素酶酶活，在80°C条件下，仍 能保持48%以上的纤维素酶酶活；而野生型纤维素酶的最适作用温度为60°C，在70°C时仅 能保持51 %的酶活，在80°C条件下，仅剩11 %的纤维素酶酶活。与野生型相比，本发明所述 纤维素酶突变体具有更高的耐热性。
[0056] 2、最适作用pH值
[0057] 分别用 pH 值为 3. 0、4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0 的缓冲液稀释里氏 木霉工程菌McE和里氏木霉工程菌McE5的发酵上清液，在50°C条件下测定其酶活，以最高 酶活为1〇〇%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果如图3所示，纤维素酶突变体的 最适作用pH为5. 5,在pH4. 5-8. 0范围内，均能保持60%以上的酶活水平，且在pH6. 0-8. 0 范围内，酶活水平保持稳定；而野生型纤维素酶的最适作用pH为6. 0,仅在pH4. 5-7. 0范围 内能维持60%以上的酶活，且在pH6. 0-8. 0范围内，酶活下降明显，至pH8. 0时，酶活仅剩 30%。与野生型相比，本发明所述纤维素酶突变体在碱性条件下的适用范围更加宽泛，具有 更大的应用空间。
[0058] 综上所述，本发明突变后的纤维素酶具有更强的耐热性，且在碱性条件下的适用 范围更加宽泛，因此更适合其在纺织工业中的应用，前景广阔。
【权利要求】
1. 一种纤维素酶，其特征在于，所述纤维素酶氨基酸序列为SEQ ID NO :3。
2. -种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的纤维素酶。
3. 如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核酸序列为SEQ ID NO :4。
4. 一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒为携带有权利要求2所述的基因的质 粒。
5. -种重组菌株，其特征在于，所述的重组菌株为转化/转染有权利要求4所述的重组 质粒的菌株。
6. 如权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，所述的菌株为里氏木霉。
7. 权利要求1所述的纤维素酶在纺织领域中的应用。
【文档编号】C12N1/15GK104450653SQ201410783788
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月16日 优先权日:2014年12月16日
【发明者】张青, 李宾, 曹体爽, 董计巧, 唐波, 黄亦钧, 王华明 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司, 潍坊康地恩生物科技有限公司