一种提高淀粉酶产色链霉菌合成丰加霉素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高淀粉酶产色链霉菌合成丰加霉素的方法，属于微生物【技术领域】。该方法通过在培养淀粉酶产色链霉菌（ Streptomycesdiastatochromogenes ）D的固体培养基上添加10μg/mL的红霉素，获得对红霉素具有较强抗性的淀粉酶产色链霉菌突变株，突变株合成丰加霉素的能力比淀粉酶产色链霉菌D强。CGMCC No 206020070525
【专利说明】一种提高淀粉酶产色链霉菌合成丰加霉素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物【技术领域】,特别是涉及提高淀粉酶产色链霉菌QStr印tomycesdiastatochromogenes)合成丰加霉素的方法。
【背景技术】
[0002]目前许多自主开发的新型农用抗生素只是停留在实验室阶段，其中关键的原因就是生产菌的产素水平未达到工业化要求。所以，当前摆在研究工作者面前一个主要的问题就是提高现有和正在开发的农用抗生素生产菌的产素水平，加快农用抗生素的产业化进程。常规的微生物诱变育种费时费力、随机性高，通过基因工程手段已可实现单基因编码的酶类的定向进化并进行超量表达，但对需要成簇基因编码的抗生素等天然产物的产量提高则困难重重。大量研究表明，利用核糖体工程技术就是向微生物核糖体或RNA聚合酶中引入特定的突变，有助于次级代谢产物产量的提高，还可能诱发或激活野生菌株产生原本不产生的代谢产物生物合成途径。通常所采用的方法是使用能够作用于核糖体或RNA聚合酶的抗生素(如链霉素、利福平、庆大霉素等)处理微生物，获得高抗性菌株。核糖体工程技术简单易行、组合方便，在工业微生物育种及微生物资源潜力挖掘等方面都有良好的应用前景。利用核糖体工程技术改良淀粉酶产色链霉菌使其提高丰加霉素合成能力的研究未见有报道。
【发明内容】
[0003]本发明通过在培养淀粉酶产色链霉菌(5: OrZa1S的固体平板上添加高浓度的红霉素，获得对红霉素具有较强抗性的淀粉酶产色链霉菌突变株，该突变株产丰加霉素的能力比淀粉酶产色链霉菌D高。该发明为提高淀粉酶产色链霉菌合成丰加霉素的能力提供了一种可靠的方法。
[0004]本发明的目的是针对野生型菌株淀粉酶产色链霉菌D产素水平低的不足，提供一种提高其产素水平的方法；本发明的另一目的是提供了一株高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌突变株hi。
[0005]本发明目的通过以下技术方案来实现:
一种提高淀粉酶产色链霉菌合成丰加霉素的方法按以下步骤进行:
(I)淀粉酶产色链霉菌突变株的获得
淀粉酶产色链霉菌dias ta tochromogenes ),定名为淀粉酶产色链霉菌(5:dias ta tochromogenes )D,从浙江临安天目山采集的土壤中分离到。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期2007年5月25日，保藏登记号CGMCC N0.2060。前期研究表明用GYM固体培养基培养，红霉素抑制淀粉酶产色链霉菌D的MIC值为3 μ g/mL。
[0006]制备GYM固体平板，本发明中所述的GYM固体平板除特殊说明外均含有10 μ g/mL的红霉素；GYM固体培养基组分与浓度为葡萄糖4 g/L, Dried yeast extract 4 g/L, Dried Malt extract-S 10 g/L, N-Z-Amine A I g/L, NaCl 2 g/L, OB 溶液 600 μ L，定容后用2 mol/L NaCl溶液调节pH至7.3，琼脂20 g/L ;其中OB溶液配置方法:称取MgS04.7H20 25g, CuSO4.5H20 2.5g, FeSO4.7H20 3.75g, MnSO4.5H20 1.8g, CaCl2.2H2017.5g，ZnSO4.7H20 4.5g，加500 mL水，用前摇匀；用移液枪吸取100 μ L淀粉酶产色链霉菌D孢子悬液(I X 16个/mL)于GYM固体平板上，用无菌涂布棒涂布均匀，置28°C培养箱培养7天，分别挑取单菌落至新的GYM固体平板(一个单菌落划一个平板)，置28°C培养箱培养5天，能再次在新的GYM固体平板上长出的菌株即为淀粉酶产色链霉菌突变株。
[0007]( 2 )淀粉酶产色链霉菌突变株液体发酵
发酵培养:发酵培养液为每1000 mL中含有可溶性淀粉20 g,黄豆粉40 g, NH4Cl 3 g,CaCO3 5 g, MgSO4 2 g，余量为水；每300 mL三角瓶装60 mL发酵培养液，配制后121 °C灭菌20 min，待冷却至50 °C，无菌条件下分别挑取一钼金环淀粉酶产色链霉菌D和突变株孢子接种，28°C ±1°C，发酵培养6天；发酵液经5000 r/min离心10 min，上清液用于丰加霉素含量的测定；
(3)丰加霉素的检测
方法:采用SHIMADZU C18色谱柱(150 mmX4.6 mm, 5 μ m)，甲醇为流动相A，水为流动相 B，梯度洗脱，洗脱程序为 0-15 min，5%-37% A ； 15-30 min，37%_100% A ；30-40 min,100%-5% A ;流速 1.0 mL/min，检测波长 279 nm，柱温 30 °C。
[0008]本发明的有益效果:
一是本发明通过在培养淀粉酶产色链霉菌D的固体培养基上添加高浓度的红霉素，获得对红霉素具有较强抗性的淀粉酶产色链霉菌突变株，该突变株产丰加霉素的能力比淀粉酶产色链霉菌D高，这为淀粉酶产色链霉菌D的产素水平提高提供了一种可靠的方法；
二是本发明提供了一株高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌突变株hl，为今后丰加霉素产业化生产奠定基础。
【具体实施方式】
[0009]下面结合实施例对本发明提高淀粉酶产色链霉菌合成丰加霉素的方法做进一步描述。
[0010]实施例1:淀粉酶产色链霉菌突变株的获得
制备GYM固体平板，本发明中所述的GYM固体平板除特殊说明外均含有10 μ g/mL的红霉素，用移液枪吸取100 μ L淀粉酶产色链霉菌D孢子悬液(I X 16个/mL)于GYM固体平板上，用无菌涂布棒涂布均匀，置28°C培养箱培养7天，分别挑取单菌落至新的GYM固体平板(一个单菌落划一个平板)，置28°C培养箱培养5天，能再次在新的GYM固体平板上长出的菌株即为淀粉酶产色链霉菌突变株，总共获得3株淀粉酶产色链霉菌突变株，编号分别为 hl，h2, h3 ；
实施例2:淀粉酶产色链霉菌突变株液体发酵
发酵培养:发酵培养液为每1000 mL中含有可溶性淀粉20 g,黄豆粉40 g, NH4Cl 3 g,CaCO3 5 g，MgSO4 2 g，余量为水；每300 mL三角瓶装60 mL发酵培养液，配制后121 °C灭菌20 min，待冷却至50 °C，无菌条件下分别挑取一钼金环淀粉酶产色链霉菌D、突变株h1、突变株h2和突变株h3孢子接种，28°C ±1°C，发酵培养6天；发酵液经5000 r/min离心10min，上清液用于丰加霉素含量的测定；
实施例3:丰加霉素的检测方法:采用SHIMADZU C18色谱柱(150 mmX4.6 mm, 5 μ m)，甲醇为流动相A，水为流动相 B，梯度洗脱，洗脱程序为 0-15 min，5%-37% A ； 15-30 min，37%_100% A ；30-40 min,100%-5% A ;流速 1.0 mL/min，检测波长 279 nm，柱温 30 °C。
[0011]结果表明:淀粉酶产色链霉菌突变株hl，h2，h3发酵液中丰加霉素的含量分别为 815.63 mg/L,678.31 mg/L,436.75 mg/L，与对照 152.12 mg/L 相比分别提高了 5.36，4.46和2.87倍，其中淀粉酶产色链霉菌突变株hi合成丰加霉素的能力最强，发酵效价达到815.63 mg/L ο
【权利要求】
1.一种提高淀粉酶产色链霉菌(5?/.<9/7?ο?_7--(95.i/iasia1cAroff1gefles) D合成丰加霉素的方法，其特征在于通过在培养淀粉酶产色链霉菌D的固体培养基上添加红霉素，获得对红霉素具有较强抗性的淀粉酶产色链霉菌突变株，对突变株进行液体发酵培养，然后对发酵液进行离心。
2.权利要求1所述的提高淀粉酶产色链霉菌D合成丰加霉素的方法，其特征在于所述的液体培养基中含有可溶性淀粉、黄豆粉、NH4C1、CaC03、MgS04。
3.权利要求1所述的提高淀粉酶产色链霉菌D合成丰加霉素的方法，其特征在于所述的红霉素的浓度为?ο μ g/mL。
【文档编号】C12P19/40GK104404111SQ201410783862
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月18日 优先权日:2014年12月18日
【发明者】俞晓平, 申屠旭萍, 王正亮, 郝培应, 刘光富, 许益鹏 申请人:中国计量学院