一种菌核侧耳新菌种及其栽培方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种菌核侧耳新菌种及其栽培方法和应用。所述菌核侧耳新菌种为菌核侧耳(Lentinus tuber-regium)GIM-L-001，保藏编号为CCTCC NO.M2014392。菌核侧耳CCTCC M2014392的栽培方法包括将菌种菌核侧耳CCTCC NO.M2014392的栽培种接入栽培袋中，栽培培养并管理采收。本发明的有益效果是：本发明提供一种菌核侧耳新菌种，该菌种来自于广州帽峰山阔叶林中腐木上，并且还提供了相应的人工栽培方法及相应的应用。该菌核侧耳新菌种具有抑菌活性，丰富了菌种品种，具有很好的社会效益。CCTCC NO:M201439220140826
【专利说明】-种菌核侧耳新菌种及其栽培方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种菌核侧耳新菌种及其栽培方法和应用。
【背景技术】
[0002] 菌核侧耳，又称虎奶菇，核耳菇，茯苓侧耳，日本人称南洋茯苓，为药食 兼用菇，典型的高温型食药用菌，按照最新的分类系统，其拉丁学名为Lentinus tuber_regium(Fr· )Fr.，隶属于 Basidiomycota(担子菌门），Agaricomycotina(伞菌亚 门），Agaricomycetes (伞菌纲），Polyporales (多孔菌目），Polyporaceae (多孔菌科）， Lentinus(香菇属），为具菌核真菌，与茯苓（子实体不可食）、猪苓（菌核不可食）不同，其 子实体与菌核都可食用。菌核侧耳为热带真菌，主要分布在热带和亚热带地区，云南，海南， 广东等地,生长于倒木或腐木桩或树根处。
[0003] 据相关记载，民间多使用菌核侧耳的菌核治疗胃病、便秘、发烧、感冒、水肿、胸痛、 痔疮、神经系统疾病、天花、哮喘、糖尿病、冠心病、高血压、肿瘤等疾病,及用于营养失调的 婴孩。目前，关于菌核侧耳菌种方面的研究多为虎奶菇菌核，而关于菌核侧耳专利申请主要 是关于以菌核侧耳为材料或添加剂制成的保健品及药品，或者已有菌核侧耳菌种（如虎奶 菇）的栽培方法。本申请是在广州帽峰山阔叶林中腐木上发现并分离的新菌种，经研究，未 见关于该菌种的研究报道。
【发明内容】
[0004] 针对以上不足，本发明提供一种新的菌核侧耳菌种。
[0005] 本发明的菌核侧耳新菌种分离自广州帽峰山阔叶林中腐木上，经形态学和分子生 物学鉴定为菌核侧耳新菌种，并通过对子实体部分进行组织分离获得原始菌株，命名为菌 核侧耳（Lentinus tuber-regium)GIM_L-〇01，已于2014年8月26日保藏于中国典型培 养物保藏中心（简称CCTCC，地址为：武汉市洪山区八一路武汉大学），保藏编号为CCTCC NO. M2014392。
[0006] 本发明还提供了上述的菌核侧耳CCTCC M2014392的栽培方法，包括将菌种菌核侧 耳CCTCC NO. M2014392的栽培种接入栽培袋中，栽培培养并管理采收。
[0007] 进一步的，上述菌核侧耳新菌种的栽培方法具体包括：
[0008] -种菌核侧耳新菌种的栽培方法，将栽培料装入聚乙烯折角袋中得到栽培袋，套 上塑料颈圈和盖子，灭菌，待栽培料温度下降至30°C以时下接入栽培种，转移至28°C -30°C 室内培养，培养至菌丝长满栽培袋时（此过程约50天左右），去掉塑料颈圈和盖子，调节 湿度至88% -85%，光照100-2001ux，通气，至长出子实体（此过程约需要30天左右），所 述栽培料的原料组成按质量百分比计为木屑78-80%、麸皮18-20%、CaC0 3l-2%，含水量 70-75%。
[0009] 进一步的，上述菌核侧耳菌种CCTCC NO. M2014392的栽培种的制备步骤包括：组 织分离菌种后制作母种，制作原种，制作栽培种。
[0010] 进一步的，上述菌核侧耳菌种CCTCC NO. M2014392的栽培种的制备步骤具体包 括：
[0011] (1)制作母种：采集组织分离的菌种菌核侧耳CCTCC NO. M2014392,将菌种无菌接 至改良PDA斜面，置于28°C培养箱中恒温培养，直至菌丝长满斜面即得母种，其中所述改良 PDA斜面的配方按质量百分比计为马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂2%、磷酸二氢钾0. 15%、 硫酸镁0.05%、维生素 Bl微量、酸水解酪蛋白1%，其余为水；
[0012] (2)制作原种：将母种无菌接入原种瓶中，置于28°C培养箱中恒温培养，至菌丝吃 满料后即得原种，其中原种料的原料组成按质量百分比计为高粱98%、CaC0 32%、含水量 60 %，将所述原种料装入玻璃瓶中，制得原种瓶；
[0013] (3)制作栽培种：将原种无菌接入栽培种袋中，置于28°C培养箱中恒温培养，至 菌丝吃满料后即得栽培种，其中栽培种料的原料组成按质量百分比计为棉籽壳73%、麸皮 25 %、CaC032 %，含水量65 %，将所述栽培种料装入折角袋中，盖上食用菌套环，制得栽培种 袋。
[0014] 该菌核侧耳CCTCC M2014392的子实体具有以下的形态特征：
[0015] 子实体群生于腐木上，革质，干后易碎，菌盖漏斗状，直径7-13cm，表面黄褐色， 被有密生短绒毛，中部颜色稍淡，老熟后盖缘成波浪状，部分裂开，菌肉白色，坚硬，极薄， l-2mm，菌褶茶褐色，延生，极密，褶幅窄，菌柄中生，长8-15cm，下粗上细，上部1-1. 5cm，下 部l-2cm，黄褐色，密生短绒毛。孢子印白色，孢子在光学显微镜下无色，透明，孢子椭圆形， 3. 1-5. 83 X 6. 57-8. 93 μ m〇
[0016] 经分子生物学测定其ITS分子序列（Genbank登记号：KM405793)的分析结果为 Lentinustuber-regium(Fr.)Fr.。结合ITS分子序列比对结果和形态学观察，与现有的菌 核侧耳菌种相似度最高达到99%，但是仍存在差异，且该菌种野外分离子实体和人工驯化 得到的子实体都与已有文献记载的子实体存在差异，此菌种的野外子实体老熟后盖缘波浪 状，有裂纹，且担孢子稍大，出菇子实体菌柄和菌盖有部分颗粒状鳞片，与现有文献记载的 所有菌核侧耳的子实体性状都不同，因而为菌核侧耳新菌种。
[0017] 本发明还提供上述菌核侧耳新菌种（菌核侧耳CCTCC M2014392)在制备抑菌药物 中的应用。
[0018] 本发明的有益效果是：本发明提供一种菌核侧耳新菌种，该菌种来自于广州帽峰 山阔叶林中腐木上，并且还提供了相应的人工栽培方法及相应的应用。该菌核侧耳新菌种 具有抑菌活性，丰富了菌种品种，具有很好的社会效益。
【具体实施方式】
[0019] 以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
[0020] 实施例1 :
[0021] 菌核侧耳新菌种，分离自广州帽峰山阔叶林中腐木上，经形态学和分子生物学鉴 定为菌核侧耳新菌种，通过对子实体部分进行组织分离获得原始菌株，命名为菌核侧耳 (Lentinus tuber-regium)GM-L-001，已于2014年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中 心（简称CCTCC，地址为：武汉市洪山区八一路武汉大学），保藏编号为CCTCC N0.M2014392。
[0022] 该菌核侧耳菌种CCTCC M2014392的特点是：生长速度快，12天左右菌丝即可覆满 试管（18\180臟)，菌丝生长温度15-401：，最适生长温度28-301：，菌丝生长？!15.5-7，最 适 pH 6· 5。
[0023] 实施例2
[0024] 菌核侧耳菌种CCTCC Μ2014392的栽培种的制备方法：
[0025] (1)制作母种：采集组织分离的菌种菌核侧耳CCTCC NO. Μ2014392,将菌种无菌接 至改良PDA斜面，置于28°C培养箱中恒温培养，直至菌丝长满斜面即得母种，这一过程大约 12天左右，菌丝生长情况为：菌丝白色，浓密，不形成棒状结构及子实体；
[0026] 其中所述改良PDA斜面的配方按质量百分比计为马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂 2%、磷酸二氢钾0. 15%、硫酸镁0.05%、维生素 Bl微量、酸水解酪蛋白1 %，其余为水；
[0027] (2)制作原种：将母种无菌接入原种瓶中，置于28°C培养箱中恒温培养，至菌丝吃 满料后即得原种，生长周期约为25-30天；
[0028] 其中原种料的原料组成按质量百分比计为高粱98 %、CaC032 %、含水量60 %，将所 述原种料装入玻璃瓶中，制得原种瓶；121°C高压灭菌25min，冷却后使用；
[0029] (3)制作栽培种：将原种无菌接入栽培种袋中，置于28°C培养箱中恒温培养，至菌 丝吃满料后即得栽培种，这一过程约需30-40天；
[0030] 其中栽培种料的原料组成按质量百分比计为棉籽壳73%、麸皮25%、CaC032%， 含水量65%，将所述栽培种料装入折角袋（15*35cm)中，盖上食用菌套环，制得栽培种袋，， 128°C条件下灭菌120min，冷却后使用。
[0031] 实施例3
[0032] 菌核侧耳菌种CCTCC M2014392的栽培方法：
[0033] 将栽培料按照比例混匀后装入17*35cm聚乙烯折角袋中，得到栽培袋，使用打孔 器打孔10cm，套上塑料颈圈和盖子，使用高压蒸汽灭菌锅，I. 5kg/cm2灭菌2小时，灭菌结束 后待栽培料冷却到30°C以下接入栽培种，转移至28°C _30°C室内培养，大约培养50天左右， 菌丝长满栽培袋，去掉塑料颈圈和盖子，调节湿度至88 % -85 %，光照100-2001uX，及时通 气，约30天左右即可形成子实体，采摘。
[0034] 栽培料的原料组成按质量百分比计为木屑78-80%、麸皮18-20%、CaC03l_2%，含 水量 70-75%。
[0035] 实施例4
[0036] 1、菌核侧耳菌种CCTCC M2014392的保藏
[0037] 试验证实，菌核侧耳菌种CCTCC M2014392适合于在改良PDA培养基（添加了酸水 解酪蛋白的PDA培养基）中保存，8-10°C冰箱中避光保存，改良PDA培养基的配方为按质量 百分比计为马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂2%、磷酸二氢钾0. 15%、硫酸镁0. 05%、维生素 Bl微量、酸水解酪蛋白1%，其余为水。
[0038] 2、菌核侧耳菌种CCTCC M2014392的保藏的培养基的比较：
[0039] 通过采用四种培养基进行试验，发现改良PDA培养基最适合于菌核侧耳菌种 CCTCC M2014392的保藏，按质量百分比计为，四种培养基配方分别为：
[0040] 改良PDA培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂2%、磷酸二氢钾0. 15%、硫酸镁 0.05%、维生素 Bl微量、酸水解酪蛋白1%，其余为水；
[0041] 普通PDA培养基：马铃薯20 %、葡萄糖2%、琼脂2 %、磷酸二氢钾0. 15 %、硫酸镁 0.05%、维生素 BI微量，其余为水；
[0042] 加富PDA培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂2%、磷酸二氢钾0. 15%、硫酸镁 0. 05%、蛋白胨1. 2%、维生素 Bl微量，其余为水；
[0043] MMN培养基：氯化钠0. 0025 %，葡萄糖1 %，磷酸二氢钾0. 05 %，麦芽浸粉0. 3 %， 维生素 B10. 00001 %，氯化钙0. 005%，磷酸氢二铵0. 025%，氯化铁0. 0012%，七水硫酸镁 0. 015%，其余为水，pH5. 8。
[0044] 试验结果：改良PDA培养基不利于菌核及子实体的形成，但菌丝生长浓密，而且能 较深地生长到培养基内部，因此，最适合试管种的保藏；而普通PDA和加富PDA都形成了菌 核或子实体，而且菌丝生长较稀疏，MMN培养基生长速度慢且形成菌核，均不利于试管种的 保藏。
[0045] 实施例5
[0046] 菌核侧耳菌种CCTCC M2014392的抑菌活性
[0047] 本实施例的所有实验器具均在121°C条件下灭菌30min或紫外灭菌30min。
[0048] 1、制备发酵液培养基：发酵液培养基的配方按质量百分比计为黄豆粉2.0%、甘 露醇2. 5 %、酵母粉0. 1 %、磷酸二氢钾0. 1 %、其余为水，按上述配方配制发酵液培养基，并 调节pH到7.0,分装倒入三角瓶，于121 °C高压灭菌30min后冷却备用；
[0049] 2、接种及培养：取菌核侧耳菌种CCTCC M2014392(试管斜面菌种）0. 5*0. 5cm大小 的菌丝块4-5块，无菌接入步骤1准备好的发酵液培养基中，于30°C，160rpm条件下避光振 荡培养6d，培养完成。
[0050] 3、发酵液浓缩：
[0051] 将培养完成的发酵液经过抽滤,将菌丝体等固体物质过滤除去,得到滤液,然后使 用旋转蒸发仪在60°C，75rpm条件下浓缩至无液体凝出，浓缩液按照1 :4的比例加入无水 乙醇，于4°C条件下静置24h后取出，再次抽滤，得到的滤液再次使用旋转蒸发仪在60°C， 75rpm条件下浓缩至无液体凝出，按照I :4的比例加入无水乙醇，于4°C条件下静置24h后 取出，再次抽滤，得到的滤液使用旋转蒸发仪在60°C，75rpm条件下浓缩至无液体凝出，得 到浓缩后的发酵液，冷却后放4°C冰箱暂存备用，该浓缩后的发酵液作为样品1，然后取部 分该浓缩后的发酵液，经〇. 22微米滤膜过滤，得到过滤后的浓缩后的发酵液，作为样品2。
[0052] 4、指示菌的制备：
[0053] 购买金黄色葡萄球菌（菌种编号ATCC6538,广东环凯微生物科技有限公司），按照 使用说明进行培养，得到斜面菌种后再划线转接平板营养培养基（配方：蛋白胨1 %，牛肉 膏粉0. 3%，氯化钠0. 5%，琼脂粉1. 5%，pH7. 3)上，于37°C避光条件下培养24小时，加入 无菌水制成菌悬液，调节菌悬液浓度至l〇6cfu/ml即得，储存至4°C冰箱备用。
[0054] 5、抑菌检测：
[0055] 配制营养培养基，其配方为按照质量百分比计：牛肉膏粉0.3%、蛋白胨1%、氯化 钠0. 5%、琼脂粉1. 5%，其余为水，然后在121°C下高压灭菌30min，待温度降至50°C时取出 倒平板（直径90mm)，待营养培养基凝固后使用加入步骤4准备好的菌悬液（浓度IO 6Cfu/ ml) 10微升，将菌悬液涂布均匀，然后将牛津杯（直径5_)放置在培养基中间，最后分别加 入步骤2准备好的样品1和样品2,以及加入阴性对照样品无菌水、加入阳性对照样品青链 霉素（浓度：青霉素含量l〇〇U/ml，链霉素含量0. lmg/ml)，每个待检样品6次重复，于36°C 恒温培养24小时后测量其抑菌圈。
[0056] 6、抑菌效果：测量抑菌圈直径，得到结果如表1所示。
[0057] 表1 :各样品的抑菌圈直径
[0058]
【权利要求】
1. 一种菌核侧耳新菌种，所述菌核侧耳新菌种为菌核侧耳（Lentinus tuber-regium) 6頂-1^001，保藏编号为0^0：勵.]\12014392。
2. -种如权利要求1所述的菌核侧耳新菌种的栽培方法，其特征在于，包括将菌种菌 核侧耳CCTCC N0.M2014392的栽培种接入栽培袋中，栽培培养并管理采收。
3. -种如权利要求2所述的菌核侧耳新菌种的栽培方法，其特征在于，将栽培料装入 聚乙烯折角袋中得到栽培袋，套上塑料颈圈和盖子，灭菌，待栽培料温度下降至30°C以时 下接入栽培种，转移至28°C -30°C室内培养，培养至菌丝长满栽培袋时，去掉塑料颈圈和盖 子，调节湿度至88 % -85 %，光照100-2001ux，通气，至长出子实体，所述栽培料的原料组成 按质量百分比计为木屑78-80 %、麸皮18-20 %、CaC03l-2 %，含水量70-75 %。
4. 一种如权利要求2所述的菌核侧耳新菌种的栽培方法，其特征在于，所述菌核侧耳 菌种CCTCC NO. M2014392的栽培种的制备步骤包括：组织分离菌种后制作母种，制作原种， 制作栽培种。
5. -种如权利要求4所述的菌核侧耳新菌种的栽培方法，其特征在于，所述菌核侧耳 菌种CCTCC NO. M2014392的栽培种的制备步骤包括： (1) 制作母种：采集组织分离的菌种菌核侧耳CCTCC NO. M2014392,将菌种无菌接至改 良PDA斜面，置于28°C培养箱中恒温培养，直至菌丝长满斜面即得母种，其中所述改良PDA 斜面的配方按质量百分比计为马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂2%、磷酸二氢钾0. 15%、硫酸 镁0.05%、维生素B1微量、酸水解酪蛋白1%，其余为水； (2) 制作原种：将母种无菌接入原种瓶中，置于28°C培养箱中恒温培养，至菌丝吃满料 后即得原种，其中原种料的原料组成按质量百分比计为高粱98 %、CaC032 %、含水量60 %， 将所述原种料装入玻璃瓶中，制得原种瓶； (3) 制作栽培种：将原种无菌接入栽培种袋中，置于28°C培养箱中恒温培养，至菌丝吃 满料后即得栽培种，其中栽培种料的原料组成按质量百分比计为棉籽壳73%、麸皮25%、 CaC032%，含水量65%，将所述栽培种料装入折角袋中，盖上食用菌套环，制得栽培种袋。
6. 如权利要求1所述的一种菌核侧耳新菌种在制备抑菌药物中的应用。
【文档编号】C12N1/14GK104403952SQ201410809652
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月19日 优先权日:2014年12月19日
【发明者】刘远超, 胡惠萍, 吴丽霞, 曹仁润, 黄龙花, 谭武平, 冯德龙 申请人:广东省微生物研究所, 广东粤微食用菌技术有限公司