牛乳β-酪蛋白来源生物活性肽的制备和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及蛋白领域，具体涉及多个来源于β-酪蛋白的乳源性生物活性多肽QNIP、QQPV、GEIVE、VSKVK、PYPQRD。经过体外抗氧化实验和体外免疫功能促进实验，发现了本发明的生物活性多肽具有不同的抗氧化生物学活性和促进细胞免疫的活性；研究结果表明本发明的五种乳源性生物活性肽作为一类小分子物质具有潜在的延缓衰老的功能。另外，模拟消化实验结果表明发现的五条生物活性多肽在通常的动物体内消化条件下稳定，不会被进一步降解，能够被动物机体直接吸收利用发挥其具有的生物活性功能，对开发具有抗氧化功能、增强免疫功能及延缓衰老的乳制品、保健品及药物具有十分重要的意义。
【专利说明】牛乳β-酪蛋白来源生物活性肽的制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蛋白领域，具体涉及多种来源于β-酪蛋白的生物活性多肽及其制备 和应用。
【背景技术】
[0002] 由于生物活性肽作为促进健康的生物活性成分，具有传递生理信息，调节生理功 能的作用，对于人体的神经、消化、生殖、生长、运动、代谢、循环等系统的正常生理活动的维 持非常重要。它们不仅具有抗病毒、细菌、抗高血压、降胆固醇等作用，而且作为免疫调节剂 具有调节免疫反应、抗肿瘤等功能；能够清除自由基具有延缓衰老的功效，是当前国际食品 界最热门的研宄课题和极具发展前景的功能因子。各种活性肽常作为功能食品添加成分用 于食品的实践生产，特别是在乳饮料、食品添加剂的应用方面已经取得良好效果。乳源性生 物活性肽生物的功能及对消费者的健康的影响正备受重视。
[0003] 近年来，越来越多的科学研宄表明很多来源于生物蛋白的小肽具有多种生物学活 性，如激素作用、免疫调节、抗血栓、抗高血压、降胆固醇、抑菌、抗病毒、抗癌作用等。同时， 研宄发现小肽可以被人体更好地吸收和利用，改变了传统的蛋白质只能被降解成氨基酸才 能被吸收利用的观点。在众多生物蛋白中各种牛乳蛋白是非常重要的生物活性多肽来源之 一，它们被乳酸菌分解利用，并发生了一系列生理生化反应，使蛋白质变为多肽或者游离的 氨基酸，最终被人体消化吸收或通过小肠上皮细胞的吸收转运直接进入人体的血液循环， 发挥其生物活性作用。
[0004] 因此，这些生物活性小肽不仅成为筛选药物的天然资源宝库，也是功能性食品工 业的主要原料成分。目前，生物活性肽的制备及其应用开发已经成为世界范围内研宄的热 点。
[0005] 免疫活性肽是继阿片肽发现后首次从乳中获得并证明其生理活性的一类生 物活性肽。1981年，Jolles等人首次发现，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，从水解物中 得到一种免疫活性肽段，其氨基酸序列为Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr，该短肽被证明在 体外实验中能够增强小鼠腹腔巨噬细胞对绵羊血红细胞的吞噬作用，静脉注射，则能 增强小鼠对肺炎克氏杆感染的抵抗能力。Elitsur等人经胃蛋白酶处理酪蛋白得到 Arg-Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu 和 Arg-Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu，研宄证明该两短肽不仅具 有阿片样活性，也具有免疫调节活性，可增强淋巴细胞增殖，提高自然杀伤细胞（NK)能力， 促进噬中性白细胞的移动。张少辉等人利用瑞士乳杆菌发酵脱脂乳获得了生物活性多肽 QEPVL及其降解产物QEPV，经过体外抗氧化实验、体外免疫功能促进实验，验证了多肽QEPV 具有较好的抗氧化生物学活性和促进细胞免疫的活性，一方面能够清除机体内的自由基， 减少自由基对人体的伤害；另一方面，生物活性多肽QEPVL和QEPV还能够增强机体免疫力， 增强淋巴细胞、巨噬细胞的增殖能力，使巨噬细胞一氧化氮诱生量增加，并促巨噬细胞分泌 细胞因子。
[0006] 尽管牛乳蛋白内隐含有许多具有生物活性的肽序列，但这些生物活性肽序列只有 通过一定的手段将其释放出来才能发挥作用。获取乳蛋白源活性肽的主要手段有两种：发 酵，利用微生物（乳酸菌）发酵乳源蛋白获取；酶解，包括来自动物的消化道酶和来自植物 和微生物的蛋白酶。
[0007] 研宄结果表明乳源性生物活性肽作为一类小分子物质，以其分子量低、活性强、用 量少的独特优势，已越来越多的引起人们的重视。所以它们不仅仅作为功能性食品原料用 于各种功能性食品的制造，而且作为免疫调节剂具有调节免疫反应、抗肿瘤等功能；能够清 除自由基具有延缓衰老的功效。此外，多数乳源性生物活性肽能够抵抗胃肠道的消化，在小 肠内以完整的形式被机体吸收，而不必被分解成单个氨基酸，具有易消化吸收，食用安全性 极高。因此乳源性生物活性肽的能够提高机体抵御外界不良因素的刺激、降低机体发病率 等功能特性备受重视，有望成为具有清除自由基、减少患癌几率和延缓衰老的非药物性物 质原料，在功能性食品和医药领域具有非常广阔的应用前景，今后必将成为国际食品界和 生物医药产业界的最热门的研宄课题，为提高人类健康水平、不得病或者说少得病、延缓衰 老、延长寿命发挥重要的作用。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供：
[0009] -种分离的生物活性多肽QNIP，其包括
[0010] (a)由Gln-Asn-Ile-Pro (SEQ ID NO :1)所示的氨基酸组成的多肽；
[0011] (b)或在SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基 酸且具有同等活性的由（a)衍生的多肽；
[0012] 一种分离的生物活性多肽QQPV，其包括
[0013] (c)由Gln-Gln-Pr〇-Val(SEQ ID NO :2)所示的氨基酸组成的多肽；
[0014] (d)或在SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基 酸且具有同等活性的由（c)衍生的多肽；
[0015] -种分离的生物活性多肽GEIVE，其包括
[0016] (e)由 Gly-Glu-Ile-Val-Glu(SEQ ID NO :3)所示的氨基酸组成的多肽；
[0017] (f)或在SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基 酸且具有同等活性的由（e)衍生的多肽；
[0018] -种分离的生物活性多肽VSKVK，其包括
[0019] (g)由 Val-Ser-Lys-Val-Lys (SEQ ID NO :4)所示的氨基酸组成的多肽；
[0020] (h)或在SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基 酸且具有同等活性的由（g)衍生的多肽；
[0021] 一种分离的生物活性多肽PYPQRD，其包括
[0022] (i)由 Pro-Tyr-Pro-Gln-Arg-Asp (SEQ ID NO :5)所示的氨基酸组成的多肽；
[0023] (j)或在SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基 酸且具有同等活性的由（i)衍生的多肽。
[0024] 较优的，所述生物活性多肽的来源为乳源性。
[0025] 酪蛋白的氨基酸序列为既有技术，酪蛋白氨基酸序列的GenBank编号 ΑΑΑ30431. 1，序列如 SEQ ID NO :6 所示：
[0026] Met Lys Val Leu He Leu Ala Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Arg
[0027] Glu Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro Gly Glu He Val Glu Ser Leu Ser
[0028] Ser Ser Glu Glu Ser He Thr Arg He Asn Lys Lys He Glu Lys Phe
[0029] Gln Ser Glu Glu Gln Gln Gln Thr Glu Asp Glu Leu Gln Asp Lys He
[0030] His Pro Phe Ala Gln Thr Gln Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly Pro
[0031] He Pro Asn Ser Leu Pro Gln Asn He Pro Pro Leu Thr Gln Thr Pro
[0032] Val Val Val Pro Pro Phe Leu Gln Pro Glu Val Met Gly Val Ser Lys
[0033] Val Lys Glu Ala Met Ala Pro Lys Gln Lys Glu Met Pro Phe Pro Lys
[0034] Tyr Pro Val Glu Pro Phe Thr Glu Ser Gln Ser Leu Thr Leu Thr Asp
[0035] Val Glu Asn Leu His Leu Pro Leu Pro Leu Leu Gln Ser Trp Met His
[0036] Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro Thr Val Met Phe Pro Pro Gln Ser
[0037] Val Leu Ser Leu Ser Gln Ser Lys Val Leu Pro Val Pro Gln Lys Ala
[0038] Val Pro Tyr Pro Gln Arg Asp Met Pro He Gln Ala Phe Leu Leu Tyr
[0039] Gln Glu Pro Val Leu Gly Pro Val Arg Gly Pro Phe Pro lie lie Val 0
[0040] β -酪蛋白（gen. var. C)的氨基酸序列为既有技术，序列如SEQ ID NO :7所示：
[0041] Arg Glu Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro Gly Glu He Val Glu Ser Leu Ser Ser Ser Glu
[0042] Glu Ser He Thr Arg He Asn Lys Lys He Glu Lys Phe Gln Ser Glu Glu Gln Gln Gln
[0043] Thr Glu Asp Glu Leu Gln Asp Lys He His Pro Phe Ala Gln Thr Gln Ser Leu Val Tyr
[0044] Pro Phe Pro Gly Pro He Pro Asn Ser Leu Pro Gln Asn He Pro Pro Leu Thr Gln Thr
[0045] Pro Val Val Val Pro Pro Phe Leu Gln Pro Glu Val Met Gly Val Ser Lys Val Lys Glu
[0046] Ala Met Ala Pro Lys Gln Lys Glu Met Pro Phe Pro Lys Tyr Pro Val Glu Pro Phe Thr
[0047] Glu Ser Gln Ser Leu Thr Leu Thr Asp Val Glu Asn Leu His Leu Pro Leu Pro Leu Leu
[0048] Gln Ser Trp Met His Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro Thr Val Met Phe Pro Pro Gln
[0049] Ser Val Leu Ser Leu Ser Gln Ser Lys Val Leu Pro Val Pro Gln Lys Ala Val Pro Tyr
[0050] Pro Gln Arg Asp Met Pro He Gln Ala Phe Leu Leu Tyr Gln Gln Pro Val Leu Gly Pro
[0051] Val Arg Gly Pro Phe Pro lie lie Val。
[0052] 本发明的生物活性多肽QNIP为乳源性，具体来源于β-酪蛋白，并且为β-酪蛋 白（SEQ ID Ν0:6)第72?75位的氨基酸残基。
[0053] 本发明的生物活性多肽QQPV为乳源性，具体来源于β -酪蛋白（gen. var. C)，并且 为β -酪蛋白（gen. var. C) (SEQ ID NO:7)第194?197位的氨基酸残基。
[0054] 本发明的生物活性多肽GEIVE为乳源性，具体来源于β-酪蛋白，并且为β-酪蛋 白（SEQ ID NO:6)第10?14位的氨基酸残基。
[0055] 本发明的生物活性多肽VSKVK为乳源性，具体来源于β-酪蛋白，并且为β-酪蛋 白（SEQ ID Ν0:6)第95?99位的氨基酸残基。
[0056] 本发明的生物活性多肽PYPQRD为乳源性，具体来源于β-酪蛋白，并且为β-酪 蛋白（SEQ ID Ν0:6)第179?184位的氨基酸残基。
[0057] 较优的，所述生物活性多肽QNIP、QQPV、GEIVE、VSKVK、PYPQRD均具有体外抗氧化 活性和增强机体免疫力的功能。
[0058] 本发明的生物活性多肽QNIP、QQPV、GEIVE、VSKVK、PYPQRD均可以通过基因工程的 方法和化学方法人工合成，也可以从乳制品中通过分离纯化、酶降解的方法获得。
[0059] 本发明还公开了编码前述生物活性多肽QNIP、QQPV、GEIVE、VSKVK、PYPQRD的核苷 酸片段。
[0060] β -酪蛋白和β -酪蛋白（gen. var. C)的氨基酸序列以及核苷酸序列为既有技术， 编码β-酪蛋白（SEQ ID N0:6)第72?75位的氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的生 物活性多肽QNIP，编码β-酪蛋白（gen.var.C) (SEQ ID N0:7)第194?197位的氨基酸残 基的核苷酸片段能编码成熟的生物活性多肽QQPV，编码β-酪蛋白（SEQ ID N0:6)第10? 14位的氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的生物活性多肽GEIVE，编码β-酪蛋白（SEQ ID NO:6)第95?99位的氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的生物活性多肽VSKVK，编 码β-酪蛋白（SEQ ID N0:6)第179?184位的氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的生 物活性多肽PYPQRD。
[0061] 本发明第二方面公开了前述生物活性多肽的制备方法，步骤如下：
[0062] 1)发酵：将瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus CICC6024)添加到脱脂乳中 进行厌氧发酵，获得瑞士乳杆菌发酵乳；
[0063] 2)多肽的粗提：对步骤1)的瑞士乳杆菌发酵乳进行低温离心分离，取上清液；
[0064] 3)多肽的纯化：
[0065] a.对步骤2)的上清液进行超滤处理，收集滤液；
[0066] b.固相萃取柱分离：收集的滤液采用Waters Sep-pak C18固相萃取柱萃取，收集 生物活性多肽混合物；
[0067] 4)多肽的消化及稳定性：采用两步酶解法酶解步骤3)的生物活性多肽混合物，获 得被消化后的生物活性多肽混合物；第一步酶解所采用的酶为胃蛋白酶，第二步酶解所采 用的酶为胰酶。
[0068] 本发明所述脱脂乳为经过脱脂处理的牛乳，通常脱脂乳中脂肪含量小于0. 1%。
[0069] 较优的，步骤1)中，瑞士乳杆菌为瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus， CICC6024)。
[0070] 较优的，步骤1)中，所述厌氧发酵的条件为：发酵温度36?38°C，发酵培养6? 8h ;更优选发酵温度37°C，发酵培养7h。
[0071] 较优的，步骤2)中，所述低温离心的条件为：4°C，8000?lOOOOrpm，离心15? 30min〇
[0072] 较优的，步骤3) a中，所述超滤处理所采用的是截留分子量分别为3kDa的超滤管。
[0073] 更优的，步骤3)a中，所述超滤处理过程中，转速为4800r/min，时间为30min，离心 温度为4°C。
[0074] 较优的，步骤3)b中，固相萃取柱分离，具体方法为：活化和平衡Waters Sep-pak C18固相萃取柱；将步骤3)a中收集的滤液进行稀释后上样，采用洗脱液洗脱，收集所得到 的洗脱液，即包含生物活性多肽混合物。
[0075] 较优的，步骤3)b中，固相萃取柱分离法中，所采用的洗脱液为甲醇和CldH2O的混 合液，所述甲醇和CldH 2O的混合液中甲醇与CldH2O的体积比为80:20,所述甲醇和CldH2O的混 合液中含有〇· 1% (v/v)的甲酸。
[0076] 较优的，步骤3)b中，固相萃取柱分离法中，采用甲醇活化Waters Sep-pak C18固 相萃取柱；优选2ml甲醇。
[0077] 较优的，步骤3)b中，固相萃取柱分离法中，采用ddH20平衡Waters Sep-pak C18 固相萃取柱；优选lmlddH20。
[0078] 较优的，步骤3)b中，固相萃取柱分离法中，将步骤3)a中收集的滤液进行稀释50 倍后上样，采用400ul洗脱液洗脱。
[0079] 较优的，步骤3)b固相萃取柱分离法中，先采用2mL甲醇活化Waters Sep-pak C18 固相萃取柱，采用ImLddH2O平衡Waters Sep-pak C18固相萃取柱；上样样品为2mL;将步 骤3) a中收集的滤液稀释50倍，采用400 μ L洗脱液洗脱。
[0080] 较优的，步骤4)所述两步酶解法具体步骤为将步骤3)得到的含有多肽的混合物 溶于灭菌去离子水中，调节pH值为2.0±0. 1，再加入胃蛋白酶，获得反应液，于37±0. 5°C 的恒温水浴中保温反应90min，获得第一步酶解液；将第一步酶解液的pH值调整为 7. 5±0. 1，并加入胰酶，于37±0. 5°C的恒温水浴中保温反应150min，获得第二步酶解液； 将第二步酶解液采用沸水浴法使酶失活，时间为5min，获得酶解产物；采用冷冻干燥获得 粉状酶解产物。
[0081] 更优选的，所述沸水浴法为95°C水浴法。
[0082] 较优的，步骤4)所述胃蛋白酶的添加量为胃蛋白酶10?30mg/g底物；所述胰酶 的添加量为胰酶30?50mg/g底物。
[0083] 更优的，步骤4)所述胃蛋白酶的添加量为胃蛋白酶20mg/g底物；所述胰酶的添加 量为胰酶40mg/g底物。
[0084] 较优的，提取分子量为471. 25Da的多肽的洗脱峰，即为生物活性多肽QNIP ;提取 分子量为471. 25Da的多肽的洗脱峰，即为生物活性多肽QQPV ;提取分子量为546. 27Da的 多肽的洗脱峰，即为生物活性多肽GEIVE ;提取分子量为560. 38Da的多肽的洗脱峰，即为生 物活性多肽VSKVK ;提取分子量为775. 38Da的多肽的洗脱峰，即为生物活性多肽PYPQRD。
[0085] 在本发明中，已知QNIP的分子量，提取分子大小为471. 25Da的洗脱峰，即为本发 明的生物活性多肽QNIP。具体的，本发明QNIP分子大小为471. 25Da的洗脱峰其保留时间 为 2. 44min〇
[0086] 在本发明中，已知QQPV的分子量，提取分子大小为471. 25Da的洗脱峰，即为本发 明的生物活性多肽QQPV。具体的，本发明QNIP分子大小为471. 25Da的洗脱峰其保留时间 为 2. 44min〇
[0087] 在本发明中，已知GEIVE的分子量，提取分子大小为546. 27Da的洗脱峰，即为本发 明的生物活性多肽GEIVE。具体的，本发明GEIVE分子大小为546. 27Da的洗脱峰其保留时 间为 0· 79min。
[0088] 在本发明中，已知GEIVE的分子量，提取分子大小为560. 38Da的洗脱峰，即为本发 明的生物活性多肽GEIVE。具体的，本发明GEIVE分子大小为560. 38Da的洗脱峰其保留时 间为 6. 55min。
[0089] 在本发明中，已知GEIVE的分子量，提取分子大小为775. 38Da的洗脱峰，即为本发 明的生物活性多肽GEIVE。具体的，本发明GEIVE分子大小为775. 38Da的洗脱峰其保留时 间为 9. 45min。
[0090] 本发明第三方面公开了前述生物活性多肽QNIP、QQPV、GEIVE、VSKVK、PYPQRD或其 衍生物在制备抗氧化和/或增强机体免疫力的食品、保健品及药物中的应用。
[0091] 本发明的生物活性多肽QNIP、QQPV、GEIVE、VSKVK、PYPQRD、或其衍生物可以用于酸 奶等乳制品以及各种食品、减少自由基对皮肤伤害的化妆品；并且由于本发明的生物活性 多肽QNIP、QQPV、GEIVE、VSKVK、PYPQRD能够通过胃肠道直接吸收不被降解，因此可以用于 制备提高免疫力的保健品，或者用于制备具有抗氧化和/或增强机体免疫力的药物。
[0092] 本发明第四方面公开了一种抗氧化药物，包含前述生物活性多肽QNIP、QQPV、 GEIVE、VSKVK、PYPQRD或前述生物活性多肽的衍生物。
[0093] 本发明第五方面公开了一种增强机体免疫力药物，包含前述生物活性多肽QNIP、 QQPV、GEIVE、VSKVK、PYPQRD或前述生物活性多肽的衍生物。
[0094] 本发明第六方面公开了 一种潜在的延缓衰老/抗衰老的保健产品，包含前述生物 活性多肽QNIP、QQPV、GEIVE、VSKVK、PYPQRD或前述生物活性多肽的衍生物。
[0095] 所述多肽的衍生物，是指在多肽的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基 化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。
[0096] 本发明生物活性多肽的有益效果为：本发明的乳源性生物活性多肽QNIP、QQPV、 GEIVE、VSKVK、PYPQRD具有很好的抗氧化活性和促进机体免疫力活性；一方面能够清除机 体内的自由基，减少自由基对人体的伤害；另一方面，本发明的生物活性多肽还能够增强机 体免疫力，增强巨噬细胞的吞噬功能，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病 率，而且经过胃肠道消化模拟实验能直接吸收不被降解，进入体内不会引起机体的免疫排 斥反应。另外，模拟消化实验结果表明发现的五条生物活性多肽在通常的动物体内消化条 件下稳定，不会被进一步降解，能够被动物机体直接吸收利用发挥其具有的生物活性功能， 对开发具有抗氧化功能、增强免疫功能、延缓衰老的食品、保健品和药品具有十分重要的意 义和应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0097] 图1 :瑞士乳杆菌发酵乳消化产物的洗脱图谱
[0098] 图2 :质量色谱提取图（m/z = 471. 25)
[0099] 图3 :质荷比为471. 25的片段的一级质谱图
[0100] 图4 :质量色谱提取图（m/z = 546. 27)
[0101] 图5 :质荷比为546. 27的片段的一级质谱图
[0102] 图6 :质量色谱提取图（m/z = 560. 38)
[0103] 图7 :质荷比为560. 38的片段的一级质谱图
[0104] 图8 :质量色谱提取图（m/z = 775. 38)
[0105] 图9 :质荷比为775. 38的片段的一级质谱图
[0106] 图10 :质荷比为471. 25的片段1的二级质谱图
[0107] 图11 :质荷比为471. 25预测得到的序列1的az，by断裂情况（QNIP)
[0108] 图12 :质荷比为471. 25的片段2的二级质谱图
[0109] 图13 :质荷比为471. 25预测得到的序列2的az，by断裂情况（QQPV)
[0110] 图14 :质荷比为546. 27的片段的二级质谱图
[0111] 图15 :质荷比为546. 27预测得到的序列的az，by断裂情况（GEIVE)
[0112] 图16 :质荷比为560. 38的片段的二级质谱图
[0113] 图17 :质荷比为560. 38预测得到的序列的az，by断裂情况（VSKVK)
[0114] 图18 :质荷比为775. 38的片段的二级质谱图
[0115] 图19 :质荷比为775. 38预测得到的序列的az，by断裂情况（PYPQRD)
[0116] 图20 :对照组质量色谱提取图（m/z = 560. 38)
[0117] 图21 :对照组质荷比为560. 38的片段的一级质谱图
[0118] 图22 :对照组质荷比为546. 27的片段的二级质谱图
[0119] 图23 :对照组质荷比为546. 27预测得到的序列的az，by断裂情况（GEIVE)
[0120] 图24 :Trolox标准曲线
[0121] 图25 : β -酪蛋白来源混合多肽的体外巨噬细胞增殖能力实验结果
【具体实施方式】
[0122] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
[0123] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本【技术领域】技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本【技术领域】的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0124] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术 领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技 术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego ；ffolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION， Third edition， Academic Press， San Diego,1998 ;METH0DS IN ENZYM0L0GY， Vol. 304,Chromatin(P. M. Wassarman and A. P. ffolffe,eds.),Academic Press，San Diego， 1999;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol. 119, Chromatin Protocols(P.B. Becker， ed. )Humana Press，Totowa，1999 等。
[0125] 实施例 I 活性肽 QNIP、QQPV、GEIVE、VSKVK、PYPQRD 的发现
[0126] 一、瑞士乳杆菌发酵乳的制备
[0127] 采用脱脂奶粉（新西兰NZMP牌脱脂奶粉）与水配置12wt%的脱脂乳（12wt%的脱 脂乳的制备为将12g脱脂奶粉加入到88g水中，下同）。随后，将购买的菌种活化即以2% 的量接种到12% (W/V)的灭菌脱脂乳中培养，温度37°C，培养时间7h，即完成瑞士乳杆菌的 活化，连续活化2次，制得发酵乳，作为瑞士乳杆菌发酵乳发酵剂备用。
[0128] 取IOmL已制备的瑞士乳杆菌发酵剂接种到500mL已灭菌的12wt%脱脂乳中（接 种率为2v/v% )，37°C发酵7小时后，搅开凝乳后，在4°C条件下保存，得到瑞士乳杆菌发酵 乳。二、生物活性多肽混合物的制得和确认
[0129] L实验方法
[0130] 1)样品处理
[0131] 分别将前一步骤制备的瑞士乳杆菌发酵乳和对照发酵乳，以及12wt%的脱脂乳装 入离心管中进行低温离心，离心条件为9000rpm/min，4°C，20min。离心后弃沉淀，取上清液。
[0132] 将上清液分别倒入超滤管中，滤膜的截留分子量为3kDa，超滤过程中，转速为 4800r/min，时间为30min，离心温度为4°C。收集瑞士乳杆菌发酵乳的滤液，于_4°C冷冻保 存。
[0133] 将2mL超滤液稀释50倍后固相萃取，用ImL C18小柱，2mL甲醇活化柱子，ImLddH2O 平衡柱子，上样样品为2mL稀释50倍后的滤液，最后400 μ L洗脱液洗脱，其中洗脱液为 80:20ν/ν甲醇/水和0· 1 % ν/ν的甲酸。
[0134] 将得到的洗脱液氮吹后冻干成干粉，后模拟胃肠道消化实验：首先，采用灭菌去离 子水溶解干粉，在溶液中加入胃蛋白酶（购自Sigma公司），比例是每克样品加入胃蛋白酶 20mg，调节反应液的pH值至2. 0,在37°C恒温水浴中保温90min ;然后将反应液的pH值调 整至7. 5,加入胰酶（Corolase PP，购自德国AB公司），比例是每克样品加入胰酶40mg，在 37°C恒温水浴中保温150min ;最后置于95°C水浴中加热5min使酶失活。同时设置对照组， 除不加入胃蛋白酶和胰蛋白酶外，在相同时间做相同的PH和温度处理。将对照组和样品组 真空冷冻干燥成粉末后，存储于_80°C备用。
[0135] 2)液质分析
[0136] 液相色谱条件：
[0137] 仪器：Waters ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪
[0138] 色谱柱规格：CSH C18色谱柱
[0139] 流速：0. 4mL/min
[0140] 温度：45°C
[0141] 紫外检测波长：220nm
[0142] 进样量：5 μ L
[0143] 流动相 A 液：ddH20
[0144] 流动相B液：乙腈溶液
[0145] 梯度条件：0min-2. 5min 保持 99 % A 液，I % B 液；2. 5min-5minB 液从 I % 变 为5 %，A液从99 %变为95 % ;5min-10minB液从5 %变为10 %，A液从95 %变为90 % ; 10min-17min% B 液从 10%变为 25%，A 液从 90%变为 75% ;17min-22min，B 液从 25%变 为 40 %，A 液从 75 % 变为 60 % ; 22min-27min，B 液从 40 % 变为 80 %，A 液从 60 % 变为 20 % ; 2711^11-29111丨11，8液从80%变为100%，4液为0%，保持2111丨11;31111丨11-31.5111丨11，8液从100% 变为5 %，A液从0 %变为95 % ;31. 5min-32min，B液从5 %变为1 %，A液从95 %变为99 % ; 32min-34min，保持 99% A 液，1 % B 液。
[0146] 质谱条件：
[0147] 离子方式：ES+
[0148] 质量范围（m/z) :50-2000
[0149] 毛细管电压（Capillary) (kV) :3. 0 [0150]采样锥（V) :35.0
[0151] 离子源温度（°C )) :105
[0152] 去溶剂温度（°C ) :35〇
[0153] 锥孔气流量（L/Hr) :50. 0
[0154] 去溶剂气流（L/hr) :600. 0
[0155] 碰撞能量（eV) :6.0
[0156] 碰撞气流（ml/min) :0· 6
[0157] 扫描时间（sec) :0· 26
[0158] 内扫描时间（sec) :0. 02
[0159] 根据上述实验条件，利用Masslynx软件分析，得到瑞士乳杆菌发酵乳消化产物中 多肽物质保留时间和分子量，如表1所示，用Masslynx软件提取多肽的质量色谱提取图、一 级质谱图，见图2-9。
[0160] 表1瑞士乳杆菌发酵乳消化产物中的多肽核质比
[0161]
【权利要求】
1. 一种分离的生物活性多肽QNIP，其包括 (a) 由SEQ ID NO :1所示的氨基酸组成的多肽； (b) 或在SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且 具有同等活性的由（a)衍生的多肽； 一种分离的生物活性多肽QQPV，其包括 (c) 由SEQ ID NO :2所示的氨基酸组成的多肽； (d) 或在SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且 具有同等活性的由（c)衍生的多肽； 一种分离的生物活性多肽GEIVE，其包括 (e) 由SEQ ID NO :3所示的氨基酸组成的多肽； (f) 或在SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且 具有同等活性的由（e)衍生的多肽； 一种分离的生物活性多肽VSKVK，其包括 (g) 由SEQ ID NO :4所示的氨基酸组成的多肽； (h) 或在SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且 具有同等活性的由（g)衍生的多肽； 一种分离的生物活性多肽PYPQRD，其包括 (i) 由SEQ ID NO :5所示的氨基酸组成的多肽； (j) 或在SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且 具有同等活性的由（i)衍生的多肽。
2. 编码权利要求1所述生物活性多肽QNIP、QQPV、GEIVE、VSKVK、PYPQRD的核苷酸片 段。
3. 权利要求1所述生物活性多肽的制备方法，步骤如下： 1) 发酵：将瑞士乳杆菌添加到脱脂乳中进行厌氧发酵，获得瑞士乳杆菌发酵乳； 2) 多肽的粗提：对步骤1)的瑞士乳杆菌发酵乳进行低温离心分离，取上清液； 3) 多肽的纯化： a. 对步骤2)的上清液进行超滤处理，收集滤液； b. 固相萃取柱分离：收集的滤液采用Waters Sep-pak C18固相萃取柱萃取，收集生物 活性多肽混合物； 4) 多肽的消化及稳定性：采用两步酶解法酶解步骤3)的生物活性多肽混合物，获得生 物活性多肽混合物；第一步酶解所采用的酶为胃蛋白酶，第二步酶解所采用的酶为胰酶。
4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述厌氧发酵的条件为：发酵 温度36?38°C，发酵时间6?8h。
5. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述低温离心的条件为： 4°C，8000 ?lOOOOrpm，离心 15 ?30min。
6. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤3) a所述超滤处理所采用的是截留 分子量分别为3kDa的超滤管；所述超滤处理过程中，转速为4800r/min，时间为30min，离心 温度为4°C。
7. 权利要求3所述生物活性多肽QNIP、QQPV、GEIVE、VSKVK、PYPQRD或前述生物活性多 肽的衍生物在制备抗氧化和/或增强机体免疫力的食品、保健品及药物中的应用。
8. -种抗氧化药物，包含前述生物活性多肽QNIP、QQPV、GEIVE、VSKVK、PYPQRD或前述 生物活性多肽的衍生物。
9. 一种增强机体免疫力药物，包含前述生物活性多肽QNIP、QQPV、GEIVE、VSKVK、 PYPQRD或前述生物活性多肽的衍生物。
10. -种潜在的延缓衰老/抗衰老的健康产品，包含前述生物活性多肽QNIP、QQPV、 GEIVE、VSKVK、PYPQRD或前述生物活性多肽的衍生物。
【文档编号】C12P21/06GK104479002SQ201410809425
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月19日 优先权日:2014年12月19日
【发明者】张少辉, 徐海红, 金赢凯, 马鎏镠, 钱蕙佶, 高扬, 程志才, 卢飞 申请人:上海交通大学