稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SSR及其制备方法和应用的制作方法

稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SSR及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SSR，所述分子标记Pi2SSR是通过引物对SEQIDNO.1和SEQIDNO.2从水稻基因组DNA中扩增出的核苷酸序列，与稻瘟病抗性基因Pi2呈特异性带型的分子标记。本发明是第一个针对Pi2基因内部序列所开发的Pi2基因特异性SSR标记，具有特异性高、低成本、高通量的优点，能广泛应用于遗传背景不同的群体中。
【专利说明】稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SSR及其制备 方法和应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于农业生物【技术领域】，特别涉及一种稻瘟病抗性基因Pi2特异性分子标 记Pi2SSR及其方法与应用。

【背景技术】
[0002] 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由稻 瘟病菌（Magnapothe oryzae)引起的稻瘟病害是对水稻生产危害最严重的病害之一，几乎 每年都会造成严重的粮食损失。长期的生产实践表明，选育与利用抗病品种是防治稻瘟病 最为安全有效的方法。况且由于稻瘟病生理小种致病性变异频繁，导致单一抗性品种的抗 性会在种植后的3?5年时间里逐渐丧失，因此，挖掘和合理利用广谱抗性基因是获得持 久、广谱抗病品种的重要途径。常规抗性基因分析方法需要大量的接种鉴定、抗性遗传及基 因等位性分析工作，并且由于不同抗性基因在抗谱上有一定的重叠性，因此常规接种鉴定 方法不足以准确、真正地反映出水稻品种的基因型。近一、二十年来，随着水稻抗病分子遗 传学的发展，众多的抗性基因得以被精细定位或被克隆，SSR等连锁分子标记的应用大大促 进了抗性基因遗传背景的鉴定以及抗病多基因聚合育种的发展（Hittalmaniet al.，2000 ; Jena and Mackill，2008)。另一方面，基因克隆的结果显示抗病基因往往是成簇存在，且不 同复等位基因之间、功能型序列与非功能型之间序列高度同源，一般的连锁标记仍然难以 准确K别各种材料的功能抗病基因（Zhou et al.，2006 ;Ashikawa et al.，2008 ;Yuan et al.，2011 ;Zhaiet al.，2011 ;Hua etal.，2012)。因此，直接分析功能等位基因本身的序列 并开发其特异性的分子标记来对目标基因进行选择，不仅选择可靠性高，还会大大加快了 育种步伐。
[0003] 近年来，有关于Pi2/Pi9等位位点的抗性基因的研究有了很大进展，王倩等 (2012)发现该位点的基因是东北各地区抗性最好、抗谱最广的抗源。张学堂等（2010)和 曾凡松等（2011)在各自的研究中也证实Pi2/Pi9等位基因是当前优良的抗性基因。Zhou 等（2007)和Dai等（2010)通过对Pi2/Pi9等位位点在5个栽培种及4个野生种的对比 研究表明，该位点的基因组结构高度保守，其所属的NBS-LRR类LRR区受到过强正向选择。 目前该抗性位点上至今已至少发现有7个不同抗谱的抗性基因（Liu et al. 2010 ;Zhu er al. 2012)，并且有至少5个抗性基因的研究比较清楚，它们分别为Pi2、Piz-t、Pi9、Pi-gn^P Pi-50 (t) (Qu et al. 2006 ;Zhou et al. 2006 ;Deng et al. 2006 ;Zhu et al. 2012)，其中 Pi2和Piz-t在氨基酸水平上只存在着8个氨基酸残基的差异，二者与Pi9相比，氨基酸序 列一致性分别都高达96% (Qu et al.，2006;Zhou et al.，2006)。Pi2抗谱相当广，对从 中国收集的792个稻瘟小种中的绝大部分表现抗性，只有7. 55%的小种能侵染携带Pi2的 亲本C101A51(Chen et al，2001)，此外，C101A51对来自13个国家的43个稻瘟病菌株中的 36个表现抗性（Liu et al，2002)。已有研究开发出一些与Pi2连锁的基于PCR技术的分 子标记和基于Pi2基因的dCAPS标记（吴金红等，2002 Jiang等，2012 ;华丽霞等，2013)， 用于分子标记辅助选择（MAS)育种或品种鉴定工作。然而，前者由于位于抗性基因Pi2的 侧翼，与目标基因存在着一定的物理距离，因此，在减数分裂过程中存在着与目标基因发生 交换的风险，在抗性育种工作中容易发生错选或漏选的情况；后者需要酶切验证，不方便 大规模抗性育种鉴定。为了能更准确有效地将稻瘟病广谱抗性基因Pi2应用到水稻抗性育 种工作中，有必要将两者的优势结合起来，开发出准确有效的Pi2特异性分子标记显得尤 为重要。


【发明内容】

[0004] 为了克服现有技术的不足与缺点，本发明目的之一在于提供一种稻瘟病抗性基因 Pi2基因功能特异性分子标记Pi2SSR。
[0005] 本发明目的之二在于提供所述的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记 Pi2SSR的检测方法。
[0006] 本发明目的之三在于提供所述的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记 Pi2SSR的应用。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子 标记
[0008] Pi2SSR，是通过引物对SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2从水稻基因组DNA中扩增出 的核苷酸序列，与稻瘟病抗性基因Pi2呈特异性带型的分子标记；
[0009] SEQ ID NO. 1(5, -3, ):GCAGCGGCTAGGGTTTATC ；
[0010] SEQ ID NO. 2(5' -3,）：CACCCAGCAACTGATTTGTCA ;
[0011] 所述的水稻品种为C101A51 ;
[0012] 优选的，一种稻瘟病抗性基因Pi2特异性分子标记Pi2SSR的方法，包括以下步骤：
[0013] (1)通过常规PCR法扩增，获得多个Pi 2等位位点抗性基因和非抗性基因的DNA序 列；
[0014] (2)将步骤⑴所得的序列对比，得到Pi2抗性基因所特有的一处2-4个碱基的差 异；
[0015] (3)根据步骤⑵所获得的差异核苷酸片断，设计出引物对SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2,并用该引物对稻瘟病抗性水稻总DNA进行PCR扩增反应，扩增得到与稻瘟病抗性基因 Pi2呈特异性带型的核苷酸片断；
[0016] (4)对步骤（3)所获得的核苷酸片断在不同水稻品种中进行验证，从而确定Pi2抗 性基因的功能特异性的分子标记Pi2SSR。
[0017] 进一步优选，
[0018]步骤（3)中所述的水稻品种包括抗性品种C101A51 (Pi2)、抗性品种 IRBL9-W(Pi9)、抗性品种IRBLzt-T(Piz-t)、抗性品种谷梅4号（Pigm)、感病品种日本晴 (Nip)、感病品种LTH、感病品种9311。
[0019] 步骤（3)中Pi2SSR的57bp设计特异性下游引物SEQ ID N0. 2,而在其上游53bp 处设计特异性上游引物SEQ ID NO. 1 ;
[0020] 步骤（3)中所述的PCR的反应体系如下：
[0021]
[0022]
[0023] 所述的PCR的反应条件如下：预变性94°C 5分钟；94°C 30秒、55°C 30秒、72°C 20 秒，扩增35个循环；72°C 7分钟；10°C保存。
[0024] 取适量PCR产物在8%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为180v，1小 时。扩增所得到的PCR产物大小为llObp，即为抗性基因Pi2的特异性分子标记。
[0025] -种稻瘟病抗性基因Pi2特异性分子标记Pi2SSR的应用，包括在水稻种质资源中 快速、直接地鉴定该抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育 种中的应用。
[0026] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0027] (1)本发明提供的分子标记特异性高：Pi2所在的基因组区域存在着包括 Pi2在内的至少6个具有抗性基因特征的候选基因，这些候选基因在序列上高度同源， 彼此之间在核苷酸水平上的序列一致性范围为71. 8%?98. 6% (Qu et al.，2006. The broad-spectrumblast resistance gene Pi9encodes a nucleotide-binding site-leucine-rich repeatprotein and is a member ofa multigene family in rice. Genetics，172:1901-1914.);此外，Pi2与该位点上已经克隆的稻瘟病抗性基因Piz-t、 Pi9在氨基酸水平上的序列一致性都为96% (Zhou et al.，2006. The eight amino-acid differences within threeleucine-rich repeats between Pi2and Piz-tresistance proteins determine theresistance specificity to Magnaporthe grisea. MPMI，99:1216-1228.)。本发明提供的分子标记是本发明发明人经过不断的进行序列多态 性搜查并通过实验验证得到的，能明显地将Pi2与存在于该基因组区域内与Pi2高度同源 的旁系同源基因进行区分；也能能成功区分Piz-t、Pi9、F i2以及被定位在Pi2/9位点上 的其它稻瘟病抗性基因。
[0028] (2)本发明提供的分子标记在实际应用中，低成本、高通量：目前，常规SSR标记检 测一般距离基因较远，准确度差；SNP检测法大部分成本高，速度慢。本发明提供的分子标 记只需PCR，成本低、通量高、加上特异性高（即准确度高），特别适用于生产实践中。
[0029] (3)本发明是第一个针对Pi2基因内部序列所开发的Pi2基因特异性SSR标记。 本发明能通过电泳检测的方法成功地将Pi2与定位在该位点上的其它稻瘟病抗性基因 (Piz-t，Pi9, Fi26，Pigm)区分开，到目前为止，还没有有关这类标记的报道。本发明所提供 的Pi2特异性分子标记Pi2SSR是一个共显性标记，在实际应用过程中其可靠性及准确性优 于显性标记。本发明可应用于Pi2转基因鉴定，基因聚合以及基于MAS技术的水稻抗性育 种工作中。该标记存在于Pi2基因内部，因此对Pi2的筛选能力理论值可达100%，这样的 筛选能力优于已报道的与Pi2连锁的分子标记。
[0030] (4)本发明提供的分子标记能广泛应用于遗传背景不同的群体中。现有的与Pi2 连锁的分子标记大部分都是针对同一个群体2个不同亲本的序列多态性所开发的，这些标 记在其它群体中的适用性有限。本发明适用于任何遗传背景下的转基因育种，基因聚合以 及基于MAS技术的抗性育种，无需重复进行亲本多态性的筛选，大大提高了育种效率。
[0031] 有益效果：本发明所提供的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记具有重要 的应用价值，能够得到广泛的应用，对降低劳动成本，提高育种工作效率起到积极重要的作 用。

【专利附图】

【附图说明】
[0032] 图1是具有Pi2特异性的与4个抗性等位基因及2个感病等位基因的序列对比图； 表示Pi2SSR特异性位点的改变。
[0033] 图2是Pi2特异性分子标记Pi2SSR在21个水稻品种中的验证结果图。
[0034] 其中：泳道I?21的DNA模板依次为：抗性基因供体品种C101A51 (Pi2)、 IRBL9-W(Pi9)、9311、T55B、花 1B、珍汕 97B、博 B、冈 46B、29B、D702B、优 IB、绵香 1B、陆财号、 粤丰B、培矮64、IR58025B、辐恢838、特青、成恢448、苏御糯、特特普。

【具体实施方式】
[0035] 下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各 种等价形式的修改均属于本申请所附权利要求所限定的范围。
[0036] 实施例1 :Pi2基因特异性分子标记及其引物设计与检测
[0037] (l)Pi2特异性SSR差异位点的分析
[0038] 从公共数据库中下载得到已经公开发表的Pi2及Pi9水稻供体品种的部分基因组 序列（Genebank收录号分别为：DQ352453，DQ285630)以及测序品种日本晴（Nipponbare)、 9311相对应区域的基因组序列，针对Pi2位点进行序列比对，筛查Pi2特异的、能区别于该 位点其他稻瘟病等位抗性基因的特异性差异位点。具有基因特异性差异位点的水稻稻瘟病 抗性基因Pi2与IRBLzt-T(Piz-t)、Nip-Pi9和9311的多序列比对结果如下所示：

【权利要求】
1. 一种稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SSR，其特征在于，所述分子标记 Pi2SSR是通过引物对SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2从水稻基因组DNA中扩增出的核苷酸序 列，与稻瘟病抗性基因Pi2呈特异性带型的分子标记； 所述的SEQIDNO. 1(5' -3'）序列为：GCAGCGGCTAGGGTTTATC; 所述的SEQIDNO. 2(5' -3'）：序列为CACCCAGCAACTGATTTGTCA。
2. 根据权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SSR，其特征在 于，所述水稻品种为C101A51。
3. -种制备权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SSR的方 法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 通过常规PCR法扩增，获得多个Pi2等位位点抗性基因和非抗性基因的DNA序列； (2) 将步骤（1)所得的序列对比，得到Pi2抗性基因所特有的一处2-4个碱基的差异； (3) 根据步骤（2)所获得的差异核苷酸片断，设计出引物对SEQIDNO. 1和SEQID NO. 2,并用该引物对对稻瘟病抗性水稻总DNA进行PCR扩增反应，扩增得到与稻瘟病抗性基 因Pi2呈特异性带型的核苷酸片断； (4) 对步骤（3)所获得的核苷酸片断在不同水稻品种中进行验证，从而确定Pi2抗性基 因的功能特异性的分子标记Pi2SSR。
4. 根据权利要求3所述的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SSR的制备 方法，其特征在于，步骤（3)中所述的稻瘟病抗性水稻品种为抗性品种C101A51、抗性品种 IRBL9-W、抗性品种IRBLzt-T、抗性品种谷梅4号、感病品种日本晴、感病品种LTH、感病品种 9311中的一种。
5. 根据权利要求3所述的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SSR的制备方 法，其特征在于，步骤（3)中Pi2SSR的57bp设计特异性下游引物SEQIDNO. 2,而在其上 游53bp处设计特异性上游引物SEQIDNO. 1。
6. 根据权利要求3所述的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SSR的制备方 法，其特征在于，步骤（3)中所述PCR的反应体系如下： 反应体系 12.5μΙ 丨卜:_引物/1〇μΜ ?ΟμΙ 反I丨?I物/10 μΜ) 10μ1 聚合 +/2.5υ./μ丨 0.2μΙ +投板 <lp.g 水补至25μ1。
7. 根据权利要求3所述的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SSR的制备方 法，其特征在于，步骤（3)中所述的PCR的反应条件如下：预变性94°C5分钟；94°C30秒、 55°C30秒、72°C20秒，扩增35个循环；72°C7分钟；KTC保存；取适量PCR扩增产物在8% 的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为180v，1小时；扩增所得到的PCR产物大小 为llObp，即为抗性基因Pi2的特异性分子标记。
8. 权利要求1所述的一种稻瘟病抗性基因Pi2特异性分子标记Pi2SSR的应用，包括在 水稻种质资源中快速、直接地鉴定该抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育 种以及转基因育种中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104450932SQ201410809329
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月22日 优先权日:2014年12月22日
【发明者】杨立明, 罗玉明, 方继朝, 刘永锋, 陈露, 郭宝珠, 倪新智 申请人:淮阴师范学院, 江苏省农业科学院