孜然精油中抗菌组分的分离与纯化方法与流程

本发明涉及孜然精油中抗菌组分的分离与纯化方法，是一种方便、快捷地提取和分离天然植物中有效抗菌组分的新方法，孜然精油作为一种天然食品防腐剂将得到广泛的应用，属天然产物分离提取领域。

背景技术：

孜然属伞形科草本植物，又名孜然芹、野茴香和安息茴香等。孜然种子可作为食品的调味品使用，具有一定的抑制脂质过氧化的作用和保护去氧核糖的能力。已有的关于孜然挥发油的提取及化学成分研究中，多采用有机溶剂萃取、水蒸气蒸馏和微波萃取等方法得到孜然精油，并对精油成分进行分析测试，但孜然精油的成分则因萃取方法的不同而差别较大。提取物成分含量不同使其具有不同程度的生物活性，目前主要研究的有抗氧化活性、杀菌活性和杀虫活性等。为了提高孜然精油的抗菌效果，需要将其中抗菌组分进行分离与纯化，但因孜然精油中成分复杂，采用目前技术手段难以将孜然精油分离得到高效抗菌成分，限制了其在食品领域的推广应用。

技术实现要素：

针对目前孜然精油提取和有效抗菌组分分离中的技术难点，本发明的目的在于提供一种简便的、低成本、分离效率高的孜然精油中抗菌组分的分离与纯化方法。

为实现上述目的，通过对孜然精油组分提取及抗菌实验研究，发现孜然的石油醚提取物中含有对肉类有很好保鲜作用有效成分。

具体技术方案如下：

1、将孜然种子进行干燥和粉碎处理，称取孜然粉末，以沸程为30～60℃的石油醚作为溶剂，采用索氏抽提法在55℃-60℃下浸提，抽提液以无水硫酸钠干燥后，用旋转蒸发仪除去溶剂获得孜然精油；

2、采用柱层析法将上述孜然精油中的饱和烃、芳香烃、非烃及胶质四种组分依次分离；柱层析中的洗脱溶剂为：饱和烃使用正己烷，芳香烃用正己烷/二氯甲烷＝1:2(体积比)，非烃用二氯甲烷/甲醇＝9:1(体积比)，胶质用甲醇；要求饱和烃、芳香烃、非烃和胶质四个组分总收率达到85％～100％，低于该值做平等样分析。

所述柱层析的层析柱用吸附剂选Al₂O₃和硅胶，使用前均进行活化处理，活化条件分别为：Al₂O₃在400℃下活化3-4h，硅胶在150℃下活化5-6h；装填按Al₂O₃/硅胶质量比1:1，装填顺序是先加入Al₂O₃，再加入硅胶，填充均匀，加入正己烷润湿柱子。

采用GC-MS联用仪，对分离得到的四种组分进行了定性和定量分析：

柱层析分离得到饱和烃中主要为非极性组分的直链和支链烷烃；芳烃组分主要为含有苯环类的极性组分；非烃类主要为含有杂原子的强极性有机化合物；胶质组分主要为配糖体、油脂和树脂类化合物。从饱/芳比值可知，在孜然精油中饱和烃组分含量较低，大部分为环状和含杂原子化合物。

经过抑菌实验发现，分离纯化得到四种组分中芳烃、非烃对各种菌的抑菌效果较明显，可以把二者按一定的比例混合作为一种天然防腐剂，安全、无毒且作用时间长，在食品防腐、肉食保鲜领域有潜在的使用价值和推广应用的前景。本发明制备的精油组分可以制成颗粒剂、水合剂、乳剂来使用，也可以同市售调味剂、防腐剂混合使用。

本发明创新点及优点在于：采用低沸点的溶剂、索氏抽提从孜然中获得孜然精油，并建立了柱层析的组分分离方法，将同类型的有机物质进行了分类，方法重现性良好。并用气相色谱-质谱联用仪对组分进行分析鉴定，确定孜然精油中对食品起到抑菌防腐的主要组分，为天然植物源食品防腐剂的开发和应用提供了实验基础和理论依据。

附图说明

图1为采用本发明工艺提取的四种组分的离子流图：a-饱和烃、b-芳烃、c-非烃、d-胶质。

图2为采用本发明工艺提取的组分对金黄葡萄球菌的抑菌圈照片，图中，a-饱和烃、b-芳烃、c-非烃、d-胶质。

图3为采用本发明工艺提取的组分对大肠杆菌的抑菌圈照片，图中，a-饱和烃、

b-芳烃、c-非烃、d-胶质。

图4为采用本发明工艺提取的组分对酵母菌的抑菌圈照片，图中，a-饱和烃、b-芳烃、c-非烃、d-胶质，e-精油。

具体实施方式

为对本发明进行更好地说明，举实施例如下：

实施例1

1、首先将市售孜然种子进行干燥和粉碎处理，然后称取孜然粉末，以沸程为30～60℃的石油醚作为溶剂，采用索氏抽提法在60℃下浸提，抽提液以无水硫酸钠干燥后，用旋转蒸发仪除去溶剂获得孜然精油；

2、采用柱层析将上述孜然精油中的饱和烃、芳香烃、非烃及胶质四种组分依次分离；柱层析中的洗脱溶剂为：饱和烃使用正己烷，芳香烃用正己烷/二氯甲烷＝1:2(体积比)，非烃用二氯甲烷/甲醇＝9:1(体积比)，胶质用甲醇；要求饱和烃、芳香烃、非烃和胶质四个组分总收率达到85％～100％，低于该值做平等样分析。

所述柱层析的层析柱用吸附剂选Al₂O₃和硅胶，使用前均进行活化处理，活化条件分别为：Al₂O₃是400℃下活化4h，硅胶是150℃下活化6h；装填按Al₂O₃/硅胶质量比1:1，装填顺序是先加入Al₂O₃，再加入硅胶，填充均匀，加入正己烷润湿柱子。

表1使用不同溶剂抽提得到的孜然精油收率及经本发明工艺处理成份含量对比情况；

表1孜然精油收率及组成

可见采用石油醚作为溶剂，进行索氏抽提孜然精油的收率高于正己烷溶剂。应用例1：保鲜试验

以猪、牛、羊鲜肉为试验样品，分别以鲜肉重量的1‰剂量，加入本发明精油分离的有效组分作为保鲜剂，进行单因素试验。结果表明：在20～25℃条件下，经保鲜剂处理的能够保持新鲜达5-6天，而不经处理的对照组猪肉经1-2天即腐败变质，经过保鲜剂处理的样品均较好的延长了保质期，保鲜效果显著。应用例2：保鲜对比试验

孜然精油与本发明精油分离的有效组分作为保鲜剂对比，二者对鲜肉都具有保鲜作用，其浓度不同，保鲜效果也有不同。当孜然精油与精油分离的有效组分的质量浓度均为50mg/mL时，本发明精油分离的有效组分的保鲜效果更为显著，常温条件下，孜然精油分离的有效组分相对应孜然精油处理效果的保质期延长2-3天。

应用例2：杀菌活性试验

菌种采用金黄葡萄球菌、大肠杆菌和酵母菌。

测试方法：表面皿离体活性测定法：将200克马铃薯去皮切碎，在700毫升蒸馏水中煮沸，冷却过滤，滤液与葡萄糖、琼脂混合，再加水至900毫升，加热至沸腾，冷却后即得培养基。培养基、蒸馏水、培养皿一起灭菌。

用电子天平称3mg左右本发明待测样品，加少量DMF溶解，滴加1滴吐温-80，加水配成1000ppm。

培养基高温减压灭菌15分钟，灭菌后，用刻度试管趁热取10毫升培养基，将其与1毫升，1000ppm溶液稀释到10毫升的本发明待测样品混匀，即制得50ppm的试样，盖好培养皿上盖，水平放置冷却。

用直径5mm的打孔器取空白对照琼脂片，用细钢丝挑入培养皿内，菌丝面朝下，每个培养皿放2-3个菌种。取菌前打孔器和钢丝酒精灯灼烧消毒。用上述方法，加待测样品，每一菌种做一次空白对照。然后置于无菌恒温箱内48～72小时后调查。测定菌斑直径，根据空白，以抑菌圈的直径表示药效。

结合附图2-4，通过对分离得到的四种组分抗菌试验，可以看出孜然精油中具有抑菌效果的组分是芳香烃和非烃，其中以芳香烃效果较显著。采用色谱-质谱对两种组分定性分析可知，芳香烃组分主要为γ-萜品烯、β-蒎烯、α-蒎烯、β-侧柏烯、β-月桂烯、α-水芹烯、枯茗醛、4-萜品醇等化合物；非烃主要含有枯茗酸、枯茗醇等化合物。如将芳香烃和非烃以一定比例混配，效果更佳。