一种构建老年性痴呆动物模型的D‑半乳糖添加饲料及其制备方法与流程

本发明涉及构建医药实验动物模型技术领域，涉及一种构建老年性痴呆动物模型的D-半乳糖添加饲料及其制备方法。

背景技术：

老年性痴呆(Alzheimersdisease，AD)，又称阿尔茨海默病，是一组病因未明的原发性退行性脑变性疾病；多起病于老年期，潜隐起病，病程缓慢且不可逆，临床以进行性记忆障碍和后天获得性知识丧失为特征；病理改变主要为皮质弥漫性萎缩，沟回增宽，脑室扩大，神经元大量减少，并可见老年斑，神经原纤维结等病变，胆碱乙酰化酶及乙酰胆碱含量显著减少。流行病学调查发现，60～90岁的老年人群中患病率随年龄的增长呈指数增长，每隔5.1岁即增加一倍，可见衰老肯定是老年性痴呆AD的危险因素之一。

老年性痴呆的防治研究对于提高老年人健康水平和生活质量具有举足轻重的意义，其中老年性痴呆AD动物模型的研究已成为近年医学界的研究热点之一。

老年性痴呆动物模型包括D-半乳糖诱导动物模型，损伤性动物模型，铝中毒动物模型，转基因小鼠模型，自然衰老动物模型，非人灵长类动物模型，炎症免疫动物模型；其中，常用的是D-半乳糖诱导老年性痴呆动物模型。

D-半乳糖(D-gal)，是一种二醛糖，可引起各器官受损，系统功能衰退，产生早衰、脑老化。临床表现为学习记忆力下降。病理学特征为皮质神经元中细胞器减少，线粒体膨胀呈空泡样变性，蛋白质合成减少，大脑海马超氧化物歧化酶(SOD)活力减少，神经元丢失等。试验小鼠出现触须脱落，大脑皮层出现类老年斑性质病理学改变，海马和人脑皮层神经元变性和坏死，在一定程度上模拟了老年性痴呆AD的发病特点。

老年性痴呆动物模型的建立一般采用皮下注射D-半乳糖。皮下注射的缺点是：1、皮下注射虽然给药剂量准确，可以在需迅速达到药效、不能或不宜经口服给药时采用，但是，不是任何药物都适用，有些会影响药物的作用时间，影响实验动物对药物的吸收；2、皮下注射时容易导致实验动物产生应激反应，注射器针头不易进入，硬进入容易折断针头，影响注射剂量，从而影响实验结果的准确性和稳定性。本发明通过使用D-半乳糖添加饲料喂养啮齿类动物，制备过程中采用单一、稳定营养素构成的营养成分稳定的饲料，符合啮齿动物自由采食的进食习惯，本发明建立的老年性痴呆动物模型成功率高、重复性好。

技术实现要素：

本发明针对现有技术存在的不足，提供了一种由单一稳定的营养素构成D-半乳糖添加饲料，该饲料构建老年性痴呆动物模型的成功率高、成模效果好、可重复性强。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种构建老年性痴呆动物模型的D-半乳糖添加饲料，由以下重量比的组份组成：酪蛋白20％～30％、玉米淀粉15％～30％、麦芽糊精10％～20％、蔗糖20％～30％、纤维素5％～10％、玉米油1％～5％、无水乳脂2％～6％、DL-蛋氨酸0.1％～0.5％、D-半乳糖0.02％～0.1％、复合矿物质0.5％～3.5％、碳酸钙0.1％～0.5％、复合维生素0.5％～3％和酒石酸氢胆碱0.2％～1％。

所述复合矿物质由下述组分按重量比组成：磷酸二钙0.1％～0.5％、一水合柠檬酸钾0.1％～0.5％、氯化钠0.05％～0.5％、氧化镁0.01％～0.2％、硫酸镁0.1％～0.5％、四水合钼酸铵0.0001％～0.008％、硫酸铬钾0.004％～0.01％、碳酸铜0.02％～0.1％、柠檬酸铁0.05％～0.5％、碳酸锰水合物0.01％～0.1％、碘酸钾0.00005％～0.0005％、氟化钠0.0008％～0.001％、亚硒酸钠0.00005％～0.0005％、碳酸锌0.005％～0.08％和葡萄糖0.05％～0.5％。

所述复合维生素由下述组分按重量比组成：维生素A醋酸酯0.0005％～0.005％、维生素D₃0.005％～0.05％、维生素E醋酸酯0.08％～0.3％、维生素K₁0.0001％～0.001％、生物素0.001％～0.05％、维生素B₁₂0.001％～0.01％、叶酸0.0001％～0.001％、烟酸0.007％～0.07％、泛酸钙0.005％～0.01％、维生素B₆0.0001％～0.001％、维生素B₂0.0001％～0.001％、维生素B₁0.0001％～0.001％和葡萄糖0.4％～2.5％。

其制备方法包括以下步骤：

1)、原材料预处理，

首先，称取玉米油1％～5％，无水乳脂2％～6％，将玉米油和无水乳脂加热至70～80℃融化，加入原材料总重量3％～10％的水，搅拌均匀，呈半流态脂料；待用；

按照比例称取原材料：酪蛋白、玉米淀粉、麦芽糊精、蔗糖、纤维素、DL-蛋氨酸、D-半乳糖、复合矿物质、碳酸钙、复合维生素和酒石酸氢胆碱；

2)、制备混合料，

将所称取的原材料混合，搅拌均匀，加入上述半流态脂料，继续混合2～4分钟；

3)、制备产品，

在20～30℃下，通过环模制粒机制成直径为10mm，长度为15～20mm的饲料颗粒；在20～25℃下，将饲料颗粒通过除湿机再进行除湿干燥24～36h，最终得干燥后饲料颗粒，饲料颗粒中水分的含量为6％～9％；

4)、得到成品，

将上述产品包装，用钴60进行辐照灭菌，得到成品。

钴60辐射源产生γ射线，作用于微生物，可以直接或者间接破坏微生物的细胞核，从而杀死微生物，起到消毒杀菌的作用。

其中：酪蛋白：具有pH敏感性，在肠胃的酸性环境下可以凝固变成凝胶状因此酪蛋白消化率较缓慢；消化慢有很多好处，可以长时间保护，修复和滋养身体。

玉米淀粉：含有丰富的营养素，玉米中含有大量的卵磷脂、亚油酸、谷物醇、维生素E、纤维素等，具有降血压、降血脂、抗动脉硬化、预防肠癌、美容养颜、延缓衰老等多种保健功效。

麦芽糊精：具有增稠性强，载体性好，发酵性小，填充效果好，不吸潮、无异味、易消化、低热、低甜度等特点。麦芽糊精含有大量的多糖类，另外还含有钙、铁等对人体有益的微量元素及矿物质，并能促进人体正常的物质代谢。

蔗糖：是光合作用的主要产物，是植物储藏、积累和运输糖分的主要形式，由一分子葡萄糖和一分子果糖脱水缩合形成，易溶于水较难溶于乙醇。

纤维素：能保持肠道通畅，排毒通便，维护肌肤健康。

玉米油：富含不饱和脂肪酸，含量高达80％～85％。玉米油本身不含有胆固醇，它对于血液中胆固醇的积累具有溶解作用，故能减少对血管产生硬化影响。

无水乳脂：从新鲜牛奶炼乳中提炼，为高质量纯奶油脂肪，而且不含任何添加剂色素。有提升口感、提高溶脂度、且含有脂肪甘油三脂酸，有调和油脂的作用。

DL-蛋氨酸：是一种重要的氨基酸品种，是动物饲料里必不可少的添加剂，加有DL-蛋氨酸的动物饲料可以在短时间内帮助动物快速成长，使其节省大约40％的饲料；动物缺少蛋氨酸会引起发育不良、体重减轻、肝肾功能减落、肌肉萎缩和皮毛变质等。

碳酸钙：可作补钙剂吸收率可达39％，仅次于果酸钙可溶于胃酸，已成为剂型最多、应用最多的补钙剂。

D-半乳糖：是一种二醛糖，可引起各器官受损，系统功能衰退，产生早衰、脑老化。

酒石酸氢胆碱：促使磷脂转变、加速脂肪的运转及利胆作用。

维生素D₃：提高肌体对钙、磷的吸收，使血浆钙和血浆磷的水平达到饱和程度；促进生长和骨骼钙化，促进牙齿健全；通过肠壁增加磷的吸收，并通过肾小管增加磷的再吸收；维持血液中柠檬酸盐的正常水平；维生素D₃是活性的7-脱氢胆固醇。

维生素K₁：可促使肝脏合成凝血酶原，用于低凝血酶原血症；还具有镇痛、缓解支气管痉挛的作用，对内脏平滑肌绞痛、胆管痉挛、肠痉挛引起的绞痛有明显的效果；还可以用于多维食品和禽畜饲料的添加剂。

生物素：是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质，维持上皮组织结构的完整和健全；增强机体免疫反应和抵抗力；维持正常生长发育。

烟酸：在体内转化为烟酸胺，烟酸胺是辅酶的组成部分，参与体内脂质代谢，组织呼吸的氧化工程和糖类无氧分解的过程。

泛酸钙：用于医药、食品及饲料添加剂。是辅酶A的成分，参与碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢作用。

本发明的有益效果：本发明造模饲料中，添加了D-半乳糖，通过D-半乳糖添加饲料饲喂啮齿类动物，诱导老年性痴呆动物模型。产品采用单一稳定的营养素构成，营养成分稳定，符合啮齿动物进食习惯的硬度和口感。本发明构建模型成功率高，过程简单，成模效果好。

附图说明

图1是本发明的制备流程示意图；

图2是昆明种小鼠大脑海马超氧化物歧化酶(SOD)活力曲线图；

图3是昆明种小鼠大脑海马蛋白含量曲线图。

具体实施方式

下面就具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

为了理解本发明，下面对本发明进行进一步的详细说明。

一种构建老年性痴呆动物模型的D-半乳糖添加饲料，由以下重量比的组份组成：酪蛋白20％～30％、玉米淀粉15％～30％、麦芽糊精10％～20％、蔗糖20％～30％、纤维素5％～10％、玉米油1％～5％、无水乳脂2％～6％、DL-蛋氨酸0.1％～0.5％、D-半乳糖0.02％～0.1％、复合矿物质0.5％～3.5％、碳酸钙0.1％～0.5％、复合维生素0.5％～3％和酒石酸氢胆碱0.2％～1％。

所述复合矿物质由下述组分按重量比组成：磷酸二钙0.1％～0.5％、一水合柠檬酸钾0.1％～0.5％、氯化钠0.05％～0.5％、氧化镁0.01％～0.2％、硫酸镁0.1％～0.5％、四水合钼酸铵0.0001％～0.008％、硫酸铬钾0.004％～0.01％、碳酸铜0.02％～0.1％、柠檬酸铁0.05％～0.5％、碳酸锰水合物0.01％～0.1％、碘酸钾0.00005％～0.0005％、氟化钠0.0008％～0.001％、亚硒酸钠0.00005％～0.0005％、碳酸锌0.005％～0.08％和葡萄糖0.05％～0.5％。

所述复合维生素由下述组分按重量比组成：维生素A醋酸酯0.0005％～0.005％、维生素D₃0.005％～0.05％、维生素E醋酸酯0.08％～0.3％、维生素K₁0.0001％～0.001％、生物素0.001％～0.05％、维生素B₁₂0.001％～0.01％、叶酸0.0001％～0.001％、烟酸0.007％～0.07％、泛酸钙0.005％～0.01％、维生素B₆0.0001％～0.001％、维生素B₂0.0001％～0.001％、维生素B₁0.0001％～0.001％和葡萄糖0.4％～2.5％。

其制备方法包括以下步骤：

1)、原材料预处理，

首先，称取玉米油1％～5％，无水乳脂2％～6％，将玉米油和无水乳脂加热至70～80℃融化，加入原材料总重量3％～10％的水，搅拌均匀，呈半流态脂料；待用；

按照比例称取原材料：酪蛋白、玉米淀粉、麦芽糊精、蔗糖、纤维素、DL-蛋氨酸、D-半乳糖、复合矿物质、碳酸钙、复合维生素和酒石酸氢胆碱；

2)、制备混合料，

将所称取的原材料混合，搅拌均匀，加入上述半流态脂料，继续混合2～4分钟；

3)、制备产品，

在20～30℃下，通过环模制粒机制成直径为10mm，长度为15～20mm的饲料颗粒；在20～25℃下，将饲料颗粒通过除湿机再进行除湿干燥24～36h，最终得干燥后饲料颗粒，饲料颗粒中水分的含量为6％～9％；

4)、得到成品，

将上述产品包装，用钴60进行辐照灭菌，得到成品。

具体实施例一

1)、原材料预处理，

首先，称取原材料中的材料：玉米油1％，无水乳脂2％，将玉米油和无水乳脂加热至70℃融化，往加热融化后的玉米油和无水乳脂混合物中加入原材料总重量3％的水，搅拌均匀，呈半流态脂料；待用；

按照比例称取原材料中其他的材料：酪蛋白20％、玉米淀粉15％、麦芽糊精10％、蔗糖20％、纤维素5％、DL-蛋氨酸0.1％、D-半乳糖0.02％、复合矿物质0.5％、碳酸钙0.1％、复合维生素0.5％和酒石酸氢胆碱0.2％；

2)、制备混合料，

将所称取的原材料混合，搅拌均匀，加入上述半流态脂料，继续混合2～4分钟；

3)、制备产品，

在20～30℃下，通过环模制粒机制成直径为10mm，长度为15～20mm的饲料颗粒；在20～25℃下，将饲料颗粒通过除湿机再进行除湿干燥24～36h，最终得干燥后饲料颗粒，饲料颗粒中水分的含量为6％～9％；

4)、得到成品，

将上述产品包装，用钴60进行辐照灭菌，得到成品。

具体实施例二：

1)、原材料预处理，

首先，称取原材料中的材料：玉米油3％，无水乳脂4％，将玉米油和无水乳脂加热至75℃融化，往加热融化后的玉米油和无水乳脂混合物中加入原材料总重量6.5％的水，搅拌均匀，呈半流态脂料；待用；

按照比例称取原材料中其他的材料：酪蛋白25％、玉米淀粉22.5％、麦芽糊精15％、蔗糖25％、纤维素7.5％、DL-蛋氨酸0.3％、D-半乳糖0.06％、复合矿物质2％、碳酸钙0.3％、复合维生素1.75％和酒石酸氢胆碱0.6％；

2)、制备混合料，

将所称取的原材料混合，搅拌均匀，加入上述半流态脂料，继续混合2～4分钟；

3)、制备产品，

在20～30℃下，通过环模制粒机制成直径为10mm，长度为15～20mm的饲料颗粒；在20～25℃下，将饲料颗粒通过除湿机再进行除湿干燥24～36h，最终得干燥后饲料颗粒，饲料颗粒中水分的含量为6％～9％；

4)、得到成品，

将上述产品包装，用钴60进行辐照灭菌，得到成品。

具体实施例三：

1)、原材料预处理，

首先，称取原材料中的材料：玉米油5％，无水乳脂6％，将玉米油和无水乳脂加热至80℃融化，往加热融化后的玉米油和无水乳脂混合物中加入原材料总重量10％的水，搅拌均匀，呈半流态脂料；待用；

按照比例称取原材料中其他的材料：酪蛋白30％、玉米淀粉30％、麦芽糊精20％、蔗糖30％、纤维素10％、DL-蛋氨酸0.5％、D-半乳糖0.1％、复合矿物质3.5％、碳酸钙0.5％、复合维生素3％和酒石酸氢胆碱1％；

2)、制备混合料，

将所称取的原材料混合，搅拌均匀，加入上述半流态脂料，继续混合2～4分钟；

3)、制备产品，

在20～30℃下，通过环模制粒机制成直径为10mm，长度为15～20mm的饲料颗粒；在20～25℃下，将饲料颗粒通过除湿机再进行除湿干燥24～36h，最终得干燥后饲料颗粒，饲料颗粒中水分的含量为6％～9％；

4)、得到成品，

将上述产品包装，用钴60进行辐照灭菌，得到成品。

经动物试验表明，本发明采用由单一稳定的营养素构成同时添加D-半乳糖的饲料；构建模型成功率高，模型制作过程简单，成模效果好；可重复，稳定性好等并为动物试验资料所证明，本发明的有关动物试验资料：

1.动物模型制备：

健康4～6周龄昆明种小鼠60只，雌雄各半，体重(22±2)g。随机将昆明种小鼠分为正常组(n＝20)和模型组(n＝40)。正常组小鼠喂养普通饲料，模型组小鼠喂养本发明D-半乳糖添加饲料。整个实验过程小鼠自由饮食饮水，于室温(24±2)℃，12h光照、12h黑暗条件下饲养。喂养6周；测定小鼠大脑的海马超氧化物歧化酶(SOD)活力及海马脑蛋白含量。

2.海马超氧化物歧化酶(SOD)活力及海马蛋白含量的测定方法

取小鼠海马组织剪碎后加适量(组织重量：磷酸缓冲盐溶液体积＝1g:9mL)磷酸缓冲盐溶液后用匀浆器匀浆，转移到离心管中，2500r/min离心15min，收集上清液，即得10％匀浆上清；备份后，准确吸取10％匀浆上清0.1mL，加入0.9mL磷酸缓冲盐溶液稀释为1％匀浆上清。

按超氧化物歧化酶(SOD)WST-1测定试剂盒说明书，将试剂按比例配成底物应用液和酶工作液；取10％匀浆上清于96孔板上按下表操作，然后混匀，37℃孵育20min，450nm波长处酶标仪读数。

按BCA法测微量蛋白含量试剂盒说明书，将试剂按比例配置测定工作液。取1％匀浆上清于96孔板上按下表操作，然后混匀，37℃孵育30min，630nm波长处，酶标仪测定，读取吸光度。

3.实验结果：

1)、大脑皮层病理学变化：

正常组小鼠的大脑皮层，海马和大脑皮层神经元完整。模型组小鼠出现触须脱落，大脑皮层出现类似老年斑性质病理学改变，皮质弥漫性萎缩，沟回增宽，脑室扩大，神经元大量减少，蛋白质合成减少，并可见老年斑，神经原纤维结；海马和大脑皮层神经元变性和坏死，继而表现为大脑皮质萎缩，脑重减轻。在一定程度上模拟了老年性痴呆AD的发病特点。

2)、海马超氧化物歧化酶(SOD)活力及海马蛋白含量的变化：

模型组昆明种小鼠的大脑海马超氧化物歧化酶(SOD)活力为(60.11±7.04)U/mg，显著低于正常组(73.25±6.39)U/mg。模型组昆明种小鼠的大脑海马蛋白含量为(0.758±0.036)mg/mL，显著低于正常组(0.941±0.045)mg/mL。D-半乳糖能诱导小鼠学习记忆能力减退，并能显著降低海马超氧化物歧化酶(SOD)活力和海马蛋白含量，提示老年性痴呆动物模型建立成功。