本发明涉及化学化工领域，且特别涉及一种竹叶黄酮的制备方法和应用。
背景技术：
竹叶黄酮(bambooleavesflavonids)是从竹叶中提取出来的具有生理活性的生物黄酮。竹叶黄酮是竹叶中主要活性成分之一，在竹叶中的含量占1-2％，主要以荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷等黄酮碳苷为主，同时，还含有木犀草素、芹菜素等黄酮苷元。与氧苷黄酮相比，竹叶黄酮结构稳定、不易降解、食用安全性强。
黄酮具有清除氧自由基、抑菌杀菌、消炎、消肿、降血脂等功能，引起了国内外学者的广泛关注。竹叶黄酮的提取方法多样，溶剂提取法、超声提取法、超临界提取法等。这些方法获得的很好的产品，但是成本都较高，使得竹叶黄酮的应用受到价格限制。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种竹叶黄酮的制备方法，此制备方法操作简单，易于实现。
本发明的另一目的在于提供一种由上述竹叶黄酮的制备方法制备而得的竹叶黄酮的应用，即将竹叶黄酮作为抗氧化剂应用于食品加工中，可降低食品的加工成本。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：
本发明提出一种竹叶黄酮的制备方法，其包括以下步骤：
将经蒸汽冲蒸后的竹叶与复合酶溶液混合酶解，得酶解液。过滤酶解液，收集滤液。以醇-水溶液为洗脱剂，于大孔吸附树脂层析柱中等度洗脱滤液，收集洗脱液，得竹叶黄酮。
等度洗脱包括第一次洗脱，第一次洗脱是以醇体积浓度为20-30％的醇-水溶液洗脱滤液。
复合酶溶液含有重量比为0.05-0.4：0.05-1：0.01-0.05的纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶。
本发明还提出了一种竹叶黄酮的应用，即将由上述的竹叶黄酮的制备方法制备而得的竹叶黄酮作为抗氧化剂应用于食品加工中。
本发明实施例的竹叶黄酮的制备方法和应用的有益效果是：
蒸汽冲蒸可在灭活竹叶中所含的生物酶的同时，尽可能的保留竹叶原料中的黄酮活性成分。其次，蒸汽冲蒸还能将竹叶中的细菌灭活。再次，蒸汽冲蒸还能对竹叶起到杀青作用，以利于除去竹叶中的叶绿素。酶解可溶解竹叶中的纤维素、果胶和木聚糖。过滤可除去酶解液中的纤维素、果胶和木聚糖，避免上述物质影响黄酮成份的提取，降低提取难度和成本。选择醇体积浓度为20-30％的醇-水溶液进行等度洗脱，可使黄酮的洗脱效果最佳，洗脱出的黄酮量最大，且杂质含量最少。
因此，本发明实施例的竹叶黄酮的制备方法操作简单，易于实现，且竹叶黄酮的得率及纯度均较高。将其作为抗氧化剂应用于食品加工中，可降低食品的加工成本。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的竹叶黄酮的制备方法和应用进行具体说明。
本实施例中例如可以选择毛竹、淡水竹等品种的竹叶为原料，较佳地，上述竹叶例如采自新鲜竹叶。以新鲜竹叶为原料，一方面可避免黄酮成分流失，另一方面还便于原料的加工，降低原料的加工成本。
对上述原料进行蒸汽冲蒸。蒸汽冲蒸例如可以用压强为0.2-0.6mpa的蒸汽对竹叶原料冲蒸20-40min。因新鲜竹叶中含有多种生物活性酶，生物活性酶可改变竹叶中竹叶黄酮的含量和比例，故通过蒸汽冲蒸，可在灭活生物酶的同时，尽可能的保留竹叶原料中的黄酮活性成分。其次，蒸汽冲蒸还能将竹叶中的细菌灭活。再次，蒸汽冲蒸还能对竹叶起到杀青作用，以利于除去竹叶中的叶绿素。
将经蒸汽冲蒸后的竹叶与复合酶溶液混合酶解，得到酶解液。作为可选地，竹叶与复合酶溶液可按1g：1ml的比例混合，复合酶溶液中的复合酶的质量浓度为0.1-0.5％。复合酶例如可以含有重量比为0.05-0.4：0.05-0.1：0.01-0.05的纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶。纤维素酶主要用于酶解竹叶原料中的纤维素，果胶酶主要用于酶解竹叶原料中的果胶酶，木聚糖酶主要用于酶解竹叶原料中的木聚糖。按上述比例将三种酶混合，可对竹叶原料中的纤维素、果胶和木聚糖同时起到充分酶解的作用。
具体地，酶解例如可在40-60℃的条件下进行5-15h。优选地，酶解温度可以为45-55℃，此酶解温度可使纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶对竹叶原料的酶解效果较为均衡，达到最佳状态。酶解过程中还可对酶解物进行搅拌，以提高酶解程度。
过滤上述酶解液，得到滤液。作为可选地，本实施例中的过滤可包括第一次过滤，第一次过滤是用碱性溶液以10-15ml/min的速度渗滤酶解液2-3h，得到第一滤液。其中，碱性溶液例如可以为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠和氢氧化钙。优选为氢氧化钙，该物质不仅具有较强的碱性作用，而且可较其它碱性物质对酶解液起到更优的除杂效果。经第一次过滤的渗滤作用，酶解液中的纤维素、果胶、木聚糖类以及其它杂质即可得以除去。
进一步地，因渗滤后的第一滤液中所含有的黄酮成分在碱性物质的作用下，环状结构变成了开环状态，不利于后续的柱层析操作。故，本实施例中的过滤还包括第二次过滤，第二次过滤是用酸性溶液调节第一滤液至ph为6-8，然后除去固体。其中，酸性溶液例如可以为盐酸和硫酸等。为了节约柱层析洗脱剂的用量以及缩短柱层析的时间，本实施例中还将滤液进行浓缩至其比重为1.05-1.1。
然后，以醇-水溶剂为洗脱剂，于大孔吸附树脂层析柱中等度洗脱上述滤液，收集洗脱液，得到竹叶黄酮。其中，洗脱剂优选为乙醇-水溶剂，以便于将获得的竹叶黄酮用于食品加工中。
在洗脱前，将滤液浓缩物进行上柱于大孔吸附树脂层析柱中，上柱速度例如可控制在1-5l/min范围内，以使滤液浓缩物上柱均匀。上柱完后，可先用去离子水进行预洗脱，将大孔吸附树脂层析柱中的杂质除去。
然后，进行等度洗脱。作为可选地，本实施例中的等度洗脱例如可以包括第一次洗脱。第一次洗脱是以醇体积浓度为20-30％的醇-水溶液洗脱。洗脱过程中，可将第一次洗脱的洗脱速度控制在1.5-3.5l/min，第一次洗脱的洗脱体积控制在450-650l。较优地，以500l的醇体积浓度为25％的乙醇-水溶液，以1.5l/min的速度进行洗脱，该洗脱条件下的乙醇-水溶液对黄酮成分的洗脱效果最佳。
由于第一次洗脱虽能洗脱出原料中大部分的黄酮活性成分，但还残留部分不能洗脱出的黄酮活性成分。故本实施例还可包括第二次洗脱，第二次洗脱是以醇体积浓度为60-75％的醇-水溶液洗脱第一次洗脱后大孔吸附树脂层析柱中剩余的黄酮活性成分。洗脱过程中，可将第二次洗脱的洗脱速度控制在2-3l/min，第二次洗脱的洗脱体积控制在300-500l。较优地，以400l的醇体积浓度为67.5％的乙醇-水溶液，以2.5l/min的速度进行洗脱，该洗脱条件下的乙醇-水溶液对剩余黄酮活性成分的洗脱效果最佳，从而将大孔吸附树脂层析柱中剩余的黄酮活性成分含量降到最低。
因制备而得竹叶黄酮具有较强的抗氧化能力，故可将竹叶黄酮作为抗氧化剂用于制备抗氧化剂或直接用于食品加工中。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
选择200kg新鲜毛竹竹叶为原料，以0.2mpa的蒸汽对该原料冲蒸40min。然后以1g：1ml将冲蒸后的竹叶与复合酶溶液混合，并于40℃的条件下酶解15h，得到酶解液。其中，复合酶溶液中的复合酶的质量浓度为0.1％，该复合酶含有重量比为0.05：0.05：0.01的纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶。
用氢氧化钠以10ml/min的速度渗滤酶解液3h，得到第一滤液。然后再用甲醇体积浓度为20％的甲醇-水溶液作为洗脱剂，以洗脱速度为1.5l/min、洗脱体积为450l的洗脱条件，于大孔吸附树脂层析柱中对第一滤液进行等度洗脱，收集洗脱液，得到竹叶黄酮。
实施例2
选择200kg新鲜淡水竹竹叶为原料，以0.6mpa的蒸汽对该原料冲蒸20min。然后以1g：1ml将冲蒸后的竹叶与复合酶溶液混合，并于60℃的条件下酶解5h，得到酶解液。其中，复合酶溶液中的复合酶的质量浓度为0.5％，该复合酶含有重量比为0.4：0.1：0.05的纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶。
用氢氧化钾以15ml/min的速度渗滤酶解液2h，得到第一滤液。然后用盐酸调节第一滤液至ph为6，然后除去固体，将除去固体后的滤液进行浓缩至滤液比重为1.05，得到滤液浓缩物。
将上述滤液浓缩物以1l/min的上柱速度上柱于大孔吸附树脂层析柱中，然后用去离子水进行预洗脱，将大孔吸附树脂层析柱中的杂质除去。然后再用乙醇体积浓度为30％的乙醇-水溶液作为洗脱剂，以洗脱速度为3.5l/min、洗脱体积为650l的洗脱条件，于大孔吸附树脂层析柱中对第一滤液进行第一次洗脱，收集第一次洗脱后的洗脱液作为第一洗脱液。
然后，用乙醇体积浓度为60％的乙醇-水溶液作为洗脱剂，以洗脱速度为2l/min、洗脱体积为300l的洗脱条件，于大孔吸附树脂层析柱中对第一次洗脱后大孔吸附树脂层析柱中剩余的黄酮活性成分进行第二次洗脱，收集第二次洗脱后的洗脱液作为第二洗脱液。
上述第一洗脱液和第二洗脱液中均含有竹叶黄酮，共同最为最终的竹叶黄酮。
实施例3
选择200kg新鲜毛竹竹叶为原料，以0.4mpa的蒸汽对该原料冲蒸30min。然后以1g：1ml将冲蒸后的竹叶与复合酶溶液混合，并于50℃的条件下酶解10h，得到酶解液。其中，复合酶溶液中的复合酶的质量浓度为0.3％，该复合酶含有重量比为0.225：0.075：0.03的纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶。
用碳酸氢钠以12.5ml/min的速度渗滤酶解液2.5h，得到第一滤液。然后用硫酸调节第一滤液至ph为8，然后除去固体，将除去固体后的滤液进行浓缩至滤液比重为1.1，得到滤液浓缩物。
将上述滤液浓缩物以5l/min的上柱速度上柱于大孔吸附树脂层析柱中，然后用去离子水进行预洗脱，将大孔吸附树脂层析柱中的杂质除去。然后再用乙醇体积浓度为25％的乙醇-水溶液作为洗脱剂，以洗脱速度为2.5l/min、洗脱体积为550l的洗脱条件，于大孔吸附树脂层析柱中对第一滤液进行第一次洗脱，收集第一次洗脱后的洗脱液作为第一洗脱液。
然后，用乙醇体积浓度为75％的乙醇-水溶液作为洗脱剂，以洗脱速度为3l/min、洗脱体积为500l的洗脱条件，于大孔吸附树脂层析柱中对第一次洗脱后大孔吸附树脂层析柱中剩余的黄酮活性成分进行第二次洗脱，收集第二次洗脱后的洗脱液作为第二洗脱液。
上述第一洗脱液和第二洗脱液中均含有竹叶黄酮，共同最为最终的竹叶黄酮。
实施例4
选择200kg新鲜淡水竹竹叶为原料，以0.3mpa的蒸汽对该原料冲蒸35min。然后以1g：1ml将冲蒸后的竹叶与复合酶溶液混合，并于45℃的条件下酶解7.5h，得到酶解液。其中，复合酶溶液中的复合酶的质量浓度为0.2％，该复合酶含有重量比为0.1：0.065：0.02的纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶。
用氢氧化钙以11.5ml/min的速度渗滤酶解液2.3h，得到第一滤液。然后用盐酸调节第一滤液至ph为7，然后除去固体，将除去固体后的滤液进行浓缩至滤液比重为1.075，得到滤液浓缩物。
将上述滤液浓缩物以3l/min的上柱速度上柱于大孔吸附树脂层析柱中，然后用去离子水进行预洗脱，将大孔吸附树脂层析柱中的杂质除去。然后再用乙醇体积浓度为22.5％的乙醇-水溶液作为洗脱剂，以洗脱速度为2l/min、洗脱体积为500l的洗脱条件，于大孔吸附树脂层析柱中对第一滤液进行第一次洗脱，收集第一次洗脱后的洗脱液作为第一洗脱液。
然后，用乙醇体积浓度为67.5％的乙醇-水溶液作为洗脱剂，以洗脱速度为2.5l/min、洗脱体积为400l的洗脱条件，于大孔吸附树脂层析柱中对第一次洗脱后大孔吸附树脂层析柱中剩余的黄酮活性成分进行第二次洗脱，收集第二次洗脱后的洗脱液作为第二洗脱液。
上述第一洗脱液和第二洗脱液中均含有竹叶黄酮，共同最为最终的竹叶黄酮。
实施例5
选择200kg新鲜淡水竹和毛竹竹叶共同作为原料，以0.5mpa的蒸汽对该原料冲蒸25min。然后以1g：1ml将冲蒸后的竹叶与复合酶溶液混合，并于55℃的条件下酶解12.5h，得到酶解液。其中，复合酶溶液中的复合酶的质量浓度为0.4％，该复合酶含有重量比为0.3：0.085：0.04的纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶。
用氢氧化钙以14.5ml/min的速度渗滤酶解液2.8h，得到第一滤液。然后用盐酸调节第一滤液至ph为6.5，然后除去固体，将除去固体后的滤液进行浓缩至滤液比重为1.55，得到滤液浓缩物。
将上述滤液浓缩物以3l/min的上柱速度上柱于大孔吸附树脂层析柱中，然后用去离子水进行预洗脱，将大孔吸附树脂层析柱中的杂质除去。然后再用乙醇体积浓度为25％的乙醇-水溶液作为洗脱剂，以洗脱速度为1.5l/min、洗脱体积为500l的洗脱条件，于大孔吸附树脂层析柱中对第一滤液进行第一次洗脱，收集第一次洗脱后的洗脱液作为第一洗脱液。
然后，用乙醇体积浓度为67.5％的乙醇-水溶液作为洗脱剂，以洗脱速度为2.5l/min、洗脱体积为400l的洗脱条件，于大孔吸附树脂层析柱中对第一次洗脱后大孔吸附树脂层析柱中剩余的黄酮活性成分进行第二次洗脱，收集第二次洗脱后的洗脱液作为第二洗脱液。
上述第一洗脱液和第二洗脱液中均含有竹叶黄酮，共同最为最终的竹叶黄酮。
试验例1
重复上述实施例1-5，得到足够多的竹叶黄酮。分别测定实施例1-5中洗脱出的竹叶黄酮中所含的总黄酮的重量和得率(以洗脱液中竹叶黄酮占洗脱液的重量百分数计)，并计算最终竹叶黄酮的得率(以所有洗脱液中竹叶黄酮的总量占竹叶原料中总黄酮重量的百分数计)，其结果如表1所示。
表1竹叶黄酮含量及得率
由表1可以看出，经本实施例中的竹叶黄酮的制备方法所制备出的黄酮含量较高，且较以相同原料通过溶剂提取法、超声提取法和超临界提取法所得到的黄酮含量(0.5-0.8％)要高，说明本实施例中的竹叶黄酮的制备方法有效可行。此外，经试验对比，本实施例1-5所得到的竹叶黄酮中黄酮的纯度较通过溶剂提取法、超声提取法和超临界提取法所得到的要高8.3-11.4％，成本低17-21％。
进一步地，通过对实施例1-5所得的竹叶黄酮进行羟基自由基清除率试验，得到以下结论：竹叶黄酮的浓度在0.4-0.8ug/ul范围内时，其对羟基自由基清除率可到50％-89％。因此说明本发明实施例制备出的竹叶黄酮具有较强的自由基清除效果，也即具有较强的抗氧化性。
故，可将上述所得的竹叶黄酮作为抗氧化剂用于食品加工或其它含有抗氧化剂的产品中。
综上所述，本发明实施例的竹叶黄酮的制备方法操作简单，易于实现，且竹叶黄酮的得率及纯度均较高。将其作为抗氧化剂应用于食品加工中，可降低食品的加工成本。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。