专利名称：用于核酸纯化的新组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于从真核和原核细胞及病毒培养物中纯化或分离核酸的试剂组合物。
在生物技术实践中，核酸片段通常是从原核细胞和真核细胞以及病毒培养物中分离的。分离的这些片段能使其顺序化、能用作鉴定和其它分析研究的探针以及将其装配到基因中以编码完整的蛋白质或多肽。通常，核酸是从含杂质的蛋白质中分离的，方法是通过在一种去污剂(如十二烷基磺酸钠，SDS)和盐溶液(如醋酸钾溶液)存在下，溶解含杂质的蛋白质(如细菌和病毒培养物)，然后用苯酚或氯仿或它们的混合物提取(去蛋白作用)。这些方法一般是通过沉淀作用，从细胞或病毒培养物中沉淀脂类和蛋白质杂质而分离出核酸的。
这种用来从细菌培养物中分离质粒DNA的方法的一个众所周知和常用的实例是由H.C.Birnboim和j.Doly在“一种筛选重组质粒DNA的快速碱性提取法”(H.C.BirnboimandJ.Doly，“ARapidalkalineExtractionProcedureforScreeningRecombinantPlasmidDNA”NucleicAcidsRes.7∶1513-1523，1979)一文中已作了描述。在常规的方法中，溶解作用和去蛋白作用这两个步骤是分开进行的，其原因是溶解步骤中的试剂与去蛋白作用中的试剂是不混溶的。因此，从杂质中，分离核酸需要通过溶解和去蛋白作用两步过程。
本发明涉及用于从细胞或病毒培养物中分离核酸的一种稳定的单相含水组合物，该组合物包括
(a)约1.6到2.4M醋酸钾;
(b)约5%到15%(重量)苯酚(c)约5%到15%(重量)氯仿;和(d)足量醋酸，以使所述组合物的pH在6和9之间，其中，(a)的含量与(b)和(c)的总含量之比为4∶1-3(重量)。
本发明提供了一种用于各种核酸分离方法的稳定的单相含水组合物。发现了一种令人惊奇的试剂组合物，其中通常不溶于水的提取组份能完全可溶于这种含水溶解组份，形成稳定的试剂组合物。本发明能使前述两个先有分离步骤合并进行，从而简化了分离核酸片段的过程。出乎意料的是，与分两步法相比，使用本发明的新组合物使核酸分离产物的收率增加。
本发明包括一种稳定的，单相含水组合物，它包括1.6M到约3.2M的醋酸钾、约5%到约15%(重量)的苯酚、约5%到约15%(重量)的氯仿和使体系pH保持在6到9间的足量醋酸。本发明组合物可任意地包括0到约1.2%(重量)的异戊醇。此外，除该醇是一个任意的组份外，8-羟基喹啉也是另一个可任选的组份，其含量为0到0.12%(重量)。
该组合物的关键组成，即醋酸钾和苯酚/氯仿之重量比最好为4∶1-3，优选组合物为4∶1。在一理想的实施例中，组合物的各组成是2.4M的醋酸钾、10M的醋酸、10%的苯酚、10%的氯仿、0.2%异戊醇和0.02%的羟基喹啉、pH8。一个更好的溶液包括60ml5M醋酸钾、12ml氯仿、40ml醋酸、12ml苯酚、1ml异戊醇、和0.012克8-羟基喹啉、pH为8。
这个试剂组合物的令人惊奇之处在于它改变了苯酚的溶解度。现在认为这些组份的结合改变了醋酸钾溶液的离子强度，使得溶液和苯酚可混溶并且可无限期地保持稳定。该试剂组合物在室温(25℃)下至少稳定30天，贮存至少稳定60天。
本发明的稳定组合物可用于各种标准DNA分离过程，包括从细菌培养物中纯化质粒DNA和从噬菌体M13中分离单股模板DNA，其中用本发明的组合物代替几种溶解和提取试剂。就从其它组织源(如真核细胞及原核细胞分离DNA和RNA，包括从哺乳动物细胞分离核酸而言，也可使用本发明试剂代替本领域普通技术人员所熟知的标准溶解和提取技术。
本发明的试剂组合物可用在手工操作的DNA分离过程，例如T.Maniatis等在《MolecularCloning-ALaboratoryManua》，ColdSpringHarborLaboratory，(1982)中所描述的方法，或者用在下面例Ⅱ所描述的自动分离方法。在两种方法中，本发明组合物显著增加了分离核酸的收率，同样，由于使用这些试剂使溶胞作用和去蛋白作用能结合进行，因而提高了分离方法的效率。
鉴于本发明试剂组合物的稳定性，其可用于核酸分离方法中配套试剂的组成部分。另外可将该组合物放在可用于自动分离仪的容器中，例如，放在自动分离仪的可调换的合适的容器中。
下面的实施例说明了本发明组合物及其用于自动核酸分离方法中的较好的具体实例。
实施例1试剂组合物的制备本发明的组合物按如下方法制备在第一溶液中，将48ml5M醋酸钾与32ml冰醋酸混合(在这一溶液中，醋酸钾与醋酸的重量比为3∶2比较好)。按下面顺序加料制得第二溶液即将9.9ml苯酚、0.1%(重量)8-羟基喹啉、9.9ml氯仿、和0.2ml异戊醇配成。这两种溶液混合在一起，从而形成一种pH8的稳定的单相组合物。
实施例2从细菌细胞中分离质粒DNA用大肠杆菌JM101(E.coliJM101)细菌细胞和噬菌体M13mp19，接种5mlSOBM培养基[Maniatisetal.，suprap.693，并在37℃温育过夜。以3000rpm速率离心10分钟后收集细胞。倒出培养基后，将所得到的小片悬浮于pH7.5的0.3ml50mM葡萄糖、10mM乙二胺四乙酸(EDTA)、10mMTris-cl中，然后在室温下旋转振摇两分钟。紧接着加入0.6ml0.2N氢氧化钠和1%SDS，于室温下轻轻地旋转振摇该溶液15秒，温育30秒，然后再轻轻地旋转振摇15秒。
向该溶液加入0.54ml实施例1的组合物。将该混合物轻轻地旋转振摇15秒，温育30秒，再旋转振摇15秒，然后于3000rpm离心15分钟。
将所得到的上清液转移到一支装有0.8微米的多孔醋酸纤维素滤膜的试管和一支5ml的接收管(Schliecher和Schuell)中。向管中加入1.3ml异丙醇并轻轻地旋转振摇，再在室温下温育2分钟，使DNA附在滤膜上，将试管中的内含物在室温下以3000rpm离心4分钟。当DNA附在滤膜的同时，将0.5ml70%酒精加入试管中，再离心2分钟。重复这一步骤3次以上以保证完全除去杂质。
然后除去接收管，用1.5ml有盖的Eppendorf管代替。向该管中加入0.1ml含10mMTris-cl(pH8.0)、1mMEDTA和20μg/mlRNaseA的试剂溶液，于室温温育30分钟以使DNA从滤膜上释放出来。然后将试管及其内含物于室温下以3000rpm离心4分钟。
把10μl所得到的溶液转入一个新的Eppendorf管中。加入1.2μl10xEcoRI缓冲液(NewEnglandBiolabs)和1单位的EcoRI限制性内切酶，然后将所得溶液在37℃温育2小时。把含有DNA片段的溶液用凝胶电脉分析处理，得到7.2kb线性M13mp19载体DNA。
当用Maniatis等人所述的方法纯化相同的培养物时，所得到的凝胶电脉数据与用本发明组合物的上述方法得到的结果相同。然而，将本发明组合物用于自动处理过程，能节省大约10-15%的时间。另外，在手工操作和自动化分离DNA质粒的过程中，使用本发明组合物获得的分离DNA片段收率显著提高。
本领域普通技术人员可对本发明组合物的用途做出各种改变，但可以认为这些改变不会超出本文权利要求的范围。
勘误表
权利要求
1.一种用于从细胞或病毒培养物中分离核酸的稳定的单相含水组合物，该组合物包括，(a)约1.6M到2.4M的醋酸钾，(b)约5%到15%(重量)苯酚，(c)约5%到15%(重量)氯仿和(d)足量醋酸，以使所述组合物的pH在6和9之间，其中，(a)的含量与(b)和(c)的总含量之比为4∶1-3(重量)。
2.按照权利要求1的组合物，还包括，(e)0到约1.2%(重量)异戊醇，和(f)0到约0.12%(重量)羟基喹啉。
3.按照权利要求1的组合物包括，(a)2.4M醋酸钾，(b)10M醋酸，(c)10%(重量)苯酚，(d)10%(重量)氯仿，(e)0.2%(重量)的异戊醇;和(f)0.02%(重量)羟基喹啉。
4.一套用于从细胞或病毒培养物中分离DNA方法的试剂，该试剂包括权利要求1所述的组合物。
5.一种用于从细胞培养物中分离DNA的自动仪器的容器，该容器含有权利要求1所述稳定的单相含水组合物。
6.一种从含蛋白杂质中溶解细胞和提取核酸的核酸分离改进方法中，其改进包括使用权利要求1的组合物。
全文摘要
本发明提供了一种稳定的单相含水组合物，该组合物用于从细胞或病毒培养物中分离核酸。
文档编号C12N15/10GK1047108SQ8910303
公开日1990年11月21日 申请日期1989年5月6日 优先权日1986年9月17日
发明者戴维·A·迪邦维尔, 杰拉德·E·理德尔 申请人:仓敷纺绩株式会社