专利名称：一种魔芋多糖固定化微生物细胞和酶的新方法
技术领域：
本发明属于微生物细胞和酶的固定化技术。
微生物细胞和酶的固定化是一项生物工程技术，以前的固定化方法，一般是用聚丙烯酰胺、琼脂、明胶、K-菜胶、海藻酸钙凝胶等载体包埋微生物和酶。但以往的固定化方法往往存在这样或那样的缺点，如资源贫乏，或价格昂贵、或单体有毒、或制作过程繁琐，条件苛刻，或化学稳定性和机械强度差，限制其使用范围，降低了使用效果和使用寿命。为了克服上述缺点，近年来，有人提出用魔芋多糖(葡甘露聚糖，简称KGM)作载体固定化酶。日本冲增哲二人用魔芋精粉或以精粉纯化得到的KGM为原料，使用浓度为0.3～3.0%，用碱调pH10～12，在室温至80℃温度范围内使其凝固成胶状，破碎成粗粒，水洗至中性，用胶溶剂把凝胶溶化，中和，透析，过滤得溶液，加入酶，混合后冻干，或混合后加入乙醇、丙酮脱水，乙醚洗后，真空干燥得固定化酶(特公昭56～9119，1981，2，27);松元信也二人在含有糊化淀粉分解性和生淀粉分解性葡萄糖淀粉酶的酶液中浸渍KGM，然后从溶液中分离吸附了葡萄糖淀粉酶的葡甘露聚糖，用水洗后，风干或喷雾干燥得固定化葡萄糖淀粉酶(特公昭59～98691，1984，4，7)。还有在精粉中加NaOH和丙烯酰胺，反应后中和，稀释，透析，再用甲醇、丙酮沉淀，再在沉淀物中加NaOH、次氯酸钠进行霍夫曼反应，生成魔芋多糖的异氰酸脂，调pH9.8，加入碱性磷酸酶，凝胶化后水洗，丙酮脱水，真空干燥，得固定化碱性磷酸酶(日本魔芋协会研究报告书，1979年，15页)。
由此可见，上述方法在固定化过程中都要经过透析、真空冷冻干燥或丙酮脱水干燥，实际操作很不方便，不便在工业上实现。另外，未用于微生物细胞固定化。
本发明的目的就是为了解决上述方法中存在的缺点，用新的简便易行的方法，制备既可适用于酶的固定化，又可用于活的微生物细胞固定化，具有酶活高，机械强度好，化学稳定性优良，抗酸抗碱，耐有机溶剂，外形规则，适于长期使用和反复再生使用的固定化方法。
本发明采用魔芋精粉(主要含葡甘露聚糖)为原料，先在精粉中加入重量比为4∶0～1的聚乙烯醇，即魔芋精粉重量∶聚乙烯醇重量为4∶0～1，加水制成5～15%(W/V)的魔芋精粉碱性溶液(溶液中NaOH浓度达0.1N，使pH13～14)，放在沸水浴中煮30～60分钟，令其胶凝硬化，再经机械加工成一定形状后于0～-30℃温度范围内冷冻处理12～36小时，使其泡沫化，再置于30～60%(V/V)碱性乙醇溶液中，40～65℃浸泡处理10～24小时，水洗成中性。在固定微生物细胞和酶时，将上述已制好的载体在含有50～100mM对苯醌的溶液中，或0.5～2.5%(W/V)的四氯化钛、四氯化锡溶液中，在室温～65℃温度范围内活化2～20小时，用水冲洗后，加需要固定化的微生物细胞或酶，进行固定化。
本发明制备的不溶性微孔凝胶载体，根据需要可干燥保存，长期备用;经活化的载体可在4℃左右温度下长期保存备用。载体在0.5N强酸，0.5N强碱液中浸泡达一年无形变，在低温到100℃下凝胶稳定，在0.1～0.5M不同pH的各种缓冲液中长期操作和在多种有机溶剂中长期操作都很稳定;在2000转/分的速度摇瓶震荡三个月凝胶无形变。
本发明的优点是载体无毒，原料来源丰富，价格便宜，制备工艺简单，成本低廉，外型规则而有弹性，机械强度高，化学稳定性好，能抗酸抗碱，耐压耐温，在各种pH的缓冲液中反复使用，微生物细胞和酶的固定化过程简单，固定化效果好。
本发明可广泛用于食品、饮料、医药工业的微生物细胞和酶的固定，可改进传统工艺，提高生产率。
实施例例一将啤酒酵母按上述方法进行固定化，在瓶内培养增殖。酵母细胞数达109个/ml载体时，进行啤酒批式发酵，前酵由原来的7天缩短至1.5～2天，后酵由原来的22～30天缩短至11～14天。制品纯正。
例二将酿酒酵母按上述方法进行固定，置瓶内增殖，细胞数达0.8～2×109个/ml载体。用批式连续发酵300天，在15～30%糖浓度下，乙醇浓度达7.6～14%(V/V)，乙醇产率达20ml/l载体·小时。
例三将浓度为10mg蛋白/ml葡萄糖淀粉酶按上述方法固定化。酶蛋白结合量30～40mg/g载体，酶活性保持50%以上，45℃柱式连续运转操作，半衰期151天，固定化酶在4℃左右贮存6个月，酶活力保持95%。
权利要求
1.用魔芋多糖(即魔芋精粉，主要含魔芋葡甘露聚糖KGM)作载体的微生物细胞和酶的固定化方法，其特征是，固定微生物细胞和酶的载体是由碱溶胀的魔芋精粉，经沸煮、冷冻泡沫化和不溶性处理而制成的外型规则的各种凝胶，并经对苯醌溶液或四氯化钛、四氯化锡溶液作共价修饰固定化微生物细胞和酶。
2.按权利要求1所述的固定化微生物细胞和酶的方法，其特征是，作载体的魔芋多糖(魔芋精粉)在制成溶液前加入聚乙烯醇，魔芋精粉与聚乙烯醇重量比为4∶0～1，溶液浓度在5～15%(W/V)之间，碱溶胀是用0.1N NaOH，其pH为13～14。
3.按权利要求1或2所述的固定化微生物细胞和酶的方法，其特征是，所说的泡沫化是用低温冷冻法，温度为0～-30℃，时间12～36小时;不溶性处理是用碱性乙醇，乙醇浓度为30～60%(V/V)，碱浓度为0.05～0.25N，温度为40～65℃，时间为10～24小时。
4.按权利要求2或3所述的固定化微生物细胞和酶的方法，其特征是，所说的共价修饰所用对苯醌浓度为50～100mM，四氯化钛、四氯化锡浓度为0.5～2.5%(W/V)，处理温度为室温～65℃，时间为2～20小时。
5.按权利要求4所述的固定化微生物细胞和酶的方法，其特征是，微孔凝胶的外型为方型、柱型、膜状、颗粒或粉末。
全文摘要
用魔芋多糖载体固定化微生物细胞和酶的方法，是以魔芋精粉为原料，经碱溶胀，沸煮、冷冻泡沫化和不溶性处理，制备出各种外形的规则的微孔凝胶载体，并置于对苯醌溶液或四氯化钛或四氯化锡溶液中经共价修饰后固定微生物细胞和酶。它的特点是载体无毒、来源方便、价格便宜、载体制备工艺简单、外形规则而有弹性、机械强度高、化学稳定性好、抗酸碱、耐压耐温，可在各种pH缓冲液中反复使用。微生物细胞和酶的固定化过程简单，效果好。
文档编号C12N11/10GK1053089SQ89109710
公开日1991年7月17日 申请日期1989年12月30日 优先权日1989年12月30日
发明者陈家任, 贾成禹 申请人:中国科学院成都生物研究所