专利名称：同时测定葡萄糖和蔗糖的双电极复合酶传感器的制作方法
技术领域：
本发明是关于生物传感器，特别是流动注射式双电极复合酶传感器的发明。该传感器由葡萄糖酶电极、固定化过氧化氢酶和蔗糖酶电极共同组成，可同时测定样品中的葡萄糖和蔗糖。
在食品和发酵工业及其相关科研中，常常需要测定葡萄糖和蔗糖。在各种测定方法中，以酶电极法最为快捷低耗。葡萄糖酶电极已经商品化，蔗糖酶电极也有一些研究报告，其酶促使反应原理如下
测定O2的消耗或H2O2的产生可以对蔗糖定量。然而，当样品中葡萄糖与蔗糖共存时(简称G/S溶液)，电极也对葡萄糖响应，蔗糖测定受到干扰。已知有三种解决办法(1)在蔗糖酶电极表面加一层固定化GOD膜，使共存葡萄糖在扩散进入电极反应前被除去[Scheller and Renneberg，Anal.Chim.Acta，152(1983)∶265]，该方法可排除葡萄糖干扰但不能测定葡萄糖;(2)结合采用GOD电极和固定化INV，G/S样品溶液经分流，一部分被GOD电极直接测定出葡萄糖浓度，另一部分以含固定化INV(酶管或酶柱)的旁路，其中庶糖被转化成葡萄糖，再被GOD电极测定，根据两次响应值之差可算出蔗糖浓度[Masoom and Townshend，Anal.Chim.Acta，171(1985)∶185]，该方法能同时测定葡萄糖和蔗糖，但酶柱(管)制作工艺较复杂，耗酶量大，易滞留气泡产生干扰;(3)用一只GOD电极先测定G/S样品中葡萄糖浓度，再用一只蔗糖电极对样器测定，将总的葡萄糖浓度减去GOD电极测定的葡萄糖浓度即为蔗糖浓度[Xu and Guilbault，Anal.Chem.61(1989)∶782;胡伟平，张先恩等，生物工程学报，7(1991)∶339]，该方法的不足在于测定分两步进行，耗时较长。
本发明的任务是建立(提供)一种能适用于流动注射分析的双电极复合酶传感器，该传感器能用于G/S样品的葡萄糖和蔗糖同时测定。
解决的方案是将一只葡萄糖酶电极(K1)和一只蔗糖酶电极(K2)固定(制作)在一个流通测定池中，G/S样器一次性流过双电极流通池，葡萄糖和蔗糖同时被测出。
下文及附图描述了本发明的一个实施例
图1为双碳糊电极复合酶传感器及流通池结构示意图。
流通测定池由有机玻璃上下基座(1)和(2)，流通池(3)，GOD电极K1(4)和蔗糖酶电极K2(5)组成，在K1和K2之间的池底有一层固定化过氧化氢酶(CAT)(6)，(1)和(2)通过螺丝(7)紧固。
酶电极的制作方法6份石墨粉与4份矿物油(W∶W)混合调匀，填充到插有铜导线的两个电极腔、压实，形成平坦表面;在K1碳糊电极表面滴注1ul GOD(2～4units/ul)，1ul牛血清白蛋白(BSA)(20%，W/V)和0.5ul戊二醛(5%)，均匀混合复盖碳糊，室温交联成酶膜;在K2碳糊电极表面滴注1ul GOD，2ul MUT(1-2units/ul)，4ul INV(80-100units/ul)，1ul BSA和2ul戊二醛，均匀混合复盖碳糊，室温成膜。
CAT酶膜的制作2ul CAT(4000-6000units/ul)，0.5ul BSA和0.5ul戊二醛滴注到流通池两电极之间的槽中，混均扩散，室温交联成膜。
图2为测定工作系统。
载流液为磷酸缓冲液(PBS，0.02mol/L，pH6.8)(1)，液流驱动力由蠕动泵(2)提供，G/S样品经注射阀(3)定量注入PBS载流，经混合圈(4)混合后流经K1(5)，K2(6)，Ag/AgCl参比电极(7)和对电极(8)，而后被排出(9)。K1和K2输出的响应电流信号由检测器(10)检出并由记录仪(11)记录。检出信号也可通过接口电路(12)送至单片计算机进行数据处理。
图3为电极K2的响应信号。
当测定池中无固定化CAT时(图3A)，K2的响应蜂有较长的拖尾，表明电极洗脱回复时间长(约5-6min)，不能迅速进入第二轮测定，其原因是K1表面的酶促反应产生的H2O2部分地扩散至K2，导致K2的持续响应。在两电极间固定一层CAT后(图1)，H2O2由K1向K2扩散的途中被CAT转化成H2O2和O2，使K2的响应峰拖尾消失，电极迅速被洗脱回复(图3B)，所产生的O2还可弥补因K1耗氧而可能造成K2的供氧不足。
测定G/S样品时采用两点标定法(two-point calibration)。分别用线性范围内的两种浓度的标准葡萄糖溶液和两种浓度的标准蔗糖溶液注射，以响应值为Y，浓度值为X，建立线性方程。
Y1＝a1+b1XG(1)Y2＝a2+b2XG(2)Y3＝a3+b3XS(3)这里，式(1)为K1的葡萄糖浓度一应值校准式，式(2)为K2的葡萄糖浓度一响应校准式，式(3)为K2的蔗糖浓度一响应值校准式，XG为葡萄糖浓度，XS为蔗糖浓度。当样品为G/S时，K2的响应值为YtY3＝Yt-Y2Yt-(a2+b2XG) (4)在高的载流速度下(〉1ml/min)，K1消耗的葡萄糖对样品中总的葡萄糖量可忽略不计，式(2)中的XG与式(1)中的XG近似相等，于是(1)和(2)可以联立，解出XG并代入(4)，得Y3＝Yt-[a2+b2(Y1-a1)/b1] (5)重排式(3)解出XS并代入式(5)，得XS＝｛Yt-[a2+b2(Y1-a1)/b1]-a3｝/b3(6)该式即为双电极复合酶传感器测定并求蔗糖浓度XS的基本计算式，式中an和bn由两点标定法得出，进行G/S样品测定时，一次注样，便同时测出蔗糖和葡萄糖浓度。
倘若an〈〈bn，式(6)可简化为Xs＝(Yt-b2Y1/b1)/b3(7)此时可采用单点标定法，使用一种浓度标定液即可在该实施例中，测定纯的葡萄糖或蔗糖(1mmol/L，进样量50ul)变导系数CV〈4%(n＝9)，测定G/S样品中的蔗糖(1mmol/L)，CV〈6.5%(n＝9)。
关于葡萄糖对蔗糖测定的干扰评价，设K2电极对纯蔗糖溶液线性范围内最高浓度的响应值为K3max，在对G/S测定时，若Yt〈70%K3max，葡萄糖浓度对蔗糖测定的干扰可忽略不计。
权利要求
1.一种用葡萄糖酶电极和蔗糖酶电极构成的流通式双电极复合酶传感器，其特征是当注入含葡萄糖和蔗糖的混合样品时，根据响应值Y1和Yt，按式(6)X6={Yt-[a2+b2(Y1-a1)/b1]-a3}/b3或式(7)X6=(Yt-b2Y1/b1)/b3或其衍生式计算出葡萄糖和蔗糖浓度。
2.按照权项1所述，其特征是在传感器装置中，若电极K1和电极K2为顺序安装(如图1)，则在两电极之间固定有一层过氧化氢酶，以消除电极K1酶促反应产物H2O2对电极K2的干扰，使K2的洗脱回复时间缩短。
全文摘要
本发明是关于生物传感器，特别是流动注射式双电极复合酶传感器的发明。该传感器由葡萄糖酶电极、固定化过氧化氢酶和蔗糖酶电极共同组成。将一只葡萄糖酶电极(K
文档编号C12Q1/54GK1097468SQ9310786
公开日1995年1月18日 申请日期1993年6月30日 优先权日1993年6月30日
发明者张先恩, 雷青利斯, 胡伟平, 张治平, 危宏平, 张晓梅, 曲红波, 张煜 申请人:中国科学院武汉病毒研究所