PfEMP3疟疾抗原、类似物、抗体及其应用的制作方法

专利名称：PfEMP3疟疾抗原、类似物、抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及疟疾抗原和编码所说抗原的基因。更具体地说，本发明涉及命名为PfEMP3的红细胞膜蛋白及其抗体的分离、鉴定和应用，所说的PfEMP3得自含有所说蛋白质的恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)核酸。
据估计，世界范围内有2.5亿多人感染了疟疾。仅在非洲，每年就有100-200万人死于由恶性疟原虫引起的四种人类疟疾中恶性程度最高的一种疟疾。这就是说大约每20秒钟就有一个人死于疟疾。重症疟疾的特征是血液中含有高比例的感染红细胞，且在肾脏、肺和神经系统发生病理生理改变(参见例如Oaks 等编 MalariaObstacles and Opportunities，National Academy Press，Washington，D.C.)。
恶性疟原虫是四种感染人类的疟原虫中较独特的一种，它在成熟的无性阶段隐藏于各种器官的后毛细管小静脉中，因而此时这种寄生虫从外周血中消失了。因为在血循环中游离存在的成熟寄生虫感染红细胞(PE)在脾脏中会被破坏，所以成熟的PE附着于毛细血管的内皮上是一种重要的存活机制。恶性疟独特的细胞粘附(粘附到细胞上)特性直接关系到脑型疟独特的病理学。能够粘附于细胞上的寄生虫称为C+，反之则称为C-。在一些感染中，滋养体阶段的PE结合到脑血管上阻碍血流，并常导致病人死亡(参见例如Aikawa，1988，Am.J.Trop.Med.Hyg.393-10;Pongponratn等，1991，Am.J.Trop.Med.Hyg.44168-175)。利用由实验室得到的、不能粘附到微血管内皮细胞上的恶性疟原虫变异体进行的试验，突出显示了粘附作用对寄生虫存活的重要性。用这种非隐藏性寄生虫感染猴不产生毒害作用，而用隐藏性寄生虫进行的平行感染均为致死性的。借助电子显微镜对成熟PE的红细胞表面进行观察发现，常与PE粘附作用相关的是有电子致密的球状突起物(K+表型)。球状物的出现与PE的成熟及其C-36粘附(C+)表型相关。因为利用电子显微镜在体内和体外都观察到了球状物与内皮表面之间的紧密接触，所以PE针对内皮细胞的受体定位于球状物上。而且，液相CD36和血栓应答素(thrombospondin)两者被公认为是PE的受体，可特异性地粘附于球状物上的PE表面。然而，因为已在体外选择出K-C+株，所以在K+和C+表型之间不存在严格的联系。但是，由于直接从被感染的人体采集的血样总是表现为K+C+，并且那些未经过粘附选择的K+C+寄生虫的体外培养物常产生K+C-寄生虫而不是K-C+寄生虫，因而对这些K-C+寄生虫在体内的病理相关性还存在争议。因此，球状物在人类感染过程中的病理学及寄生虫毒力的维持两方面都具有重要作用。
有数种疟疾蛋白质与红细胞膜相关，例如PfEMP1(恶性疟原虫红细胞膜蛋白1)、MESA/PfEMP2(参见Howard等，1988，Mol.Bio-chem.Parasitol.27207-224);Pf155/RESA(参见Foley等，1991，Mol.Biochem.Parasitol.46137-148);Pf1(参见Irving等，1987，Molecular Strategies of Parasitic Invasion，pp 37-46，Agabian等编，Alan Liss，New York);HRP1(参见Ardeshir等，1987，EMBO J.61421-1427);41-2裂殖体蛋白(参见Knapp等，1989，Mol.Biochem.Parasitol.3747-56);以及抗原332(参见Mattei等，1992，Gene 110-71-79)。在这一组蛋白质中，只肯定组氨酸丰富蛋白1(HRP1)与球状物形成有关。K-寄生虫不表达HRP1。在K-寄生虫中，位于第二条染色体上的HRP1基因部分或全部缺失。任何其他上述蛋白质的丢失都不产生无球状物的寄生虫。
可以用免疫沉淀法或于还原条件下进行的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴别至少10种分子量大于200KD的恶性疟原虫蛋白，所说的免疫沉淀法是通过用成熟无性阶段PE感染的红细胞的生物合成放射标记提取物的人免疫血清进行的。这些分子中只有小部分已用特异抗体试剂进行了确认，对于已命名和确认的分子常常也只能获得有限的顺序信息。对这一类疟疾蛋白的兴趣不仅源于有关这些大分子的功能作用的基本问题，而且源于对于数种这类分子显示出的与PE宿主细胞膜(位于膜下或暴露于PE表面)相关现象的观察，这在宿主细胞膜上可能参与了红细胞(E)膜上伴随疟疾寄生虫成熟的多种形态、抗原性和功能改变。
PfEMP2/MESA/PP3000抗原是一种用特异性单克隆抗体(MAbs)和完整cDNA顺序进行过充分确认的恶性疟原虫蛋白，其分子量约240-400KD。已经证明该蛋白与亚细胞膜细胞骨架成分结合，并且该蛋白定位于PE的球状突起物下的电子致密度物质处。
根据去污剂提取能力的不同特性以及鉴别用MAb和多克隆抗体的反应性，已对与PfEMP2大小相似的抗原D260进行了确认，但该蛋白的顺序尚未公开。另一种分子量约220KD的很大的蛋白分子似乎属于富含精氨酸蛋白家族，由于缺乏能将它从这一族具有抗原交叉反应性的蛋白质中区分出来的特异性试剂，因而该蛋白还未得到详尽的鉴定。人们疏忽了第一种在无性阶段疟原虫中表达的很大的蛋白质Pf1(分子量约240KD，已获得了其部分核酸顺序)，对它在PE中的定位或其意义知之甚少。
另一种抗原Pf11.1最初被描述为260KD的无性阶段蛋白质。人们获得了Pf11.1基因的详尽的核酸顺序，并在不同的寄生虫中对其结构多形性进行了研究。从随后的研究中得出的结论是，原始基因组DNA(gDNA)实际上相应于大于一百万道尔顿的无性阶段抗原。最近证实，该百万道尔顿蛋白质相应于另一种称为332的疟疾基因顺序，并且Pf11.1已被描述为不存在于无性寄生虫中的高分子量有性阶段抗原。最初称为Pf11.1的抗原可能相应于D260蛋白质。
鉴于越来越多的证据表明，另一种被称为PfEMP1或隐藏素(sequesterin)的很大的疟疾蛋白质可以在PE粘附于内皮细胞的特性中起功能性作用，人们对PfEMP1产生了极大的闪趣。由于缺乏特异性多克隆抗体或单克隆抗体以及缺乏任何核酸或氨基酸顺序的资料，对PfEMP1的研究受到阻碍。
上述情况表明，确认很大的疟疾抗原存在非常大的困难。MAbs或亲和纯化的抗体会与短的线性氨基酸顺序反应，而该氨基酸顺序可以在许多疟疾蛋白(和重组蛋白)中仅仅由于机遇而存在。此外，许多疟疾蛋白似乎有共同的顺序，并且听说的共同顺序常较具免疫原性和抗原反应性。例如，D260和Ag332属于包括Pf11.1和Pf155/RESA在内的、具有抗原交叉反应的一族蛋白质，所有这一族的蛋白质均有由人IgM MAb 33G2识别的交叉反应抗原决定簇。被MAb 33G2识别的抗原决定簇为由六个氨基酸残基组成的重复基序EEXXEE(此为单字母代码，用更正规的三字母代码表示则为Glu-Glu-Xaa-Xaa-Glu-Glu)。无球状物的恶性疟原虫与C32黑色素瘤细胞的粘附受MAb 33G2抑制，这表明所说氨基酸重复基序是在PE表面表达的，这也提示带有这一基序的蛋白质参与了PE的粘附。因为由MAb 33G2识别的这种氨酸基序为许多蛋白质共有，因此很难确定哪一种已知蛋白质(如果有的话)可以在PE表面进行表达。
对很大的疟疾抗原进行确认和研究的单一特异性试剂的缺乏已阻碍了疟疾研究领域的进展。这种障碍限制了用于保护人类免遭上述的巨大痛苦、苦难以及最终死亡的各种治疗和预防方法的进展。因此，需要抗分子量大于200KD的滋养体/裂殖体蛋白的单克隆抗体。本发明满足了很多这类需要，并且提供了许多有用的试剂、组合物和方法。
本发明提供了一种分离的核酸，该核酸含有编码与疟疾PfEMP3蛋白的相应片段高度同源的多肽片段的顺序，所编码的多肽片段具有一个抗原决定簇，并且优选与表3所公开的顺序高度同源。所说的蛋白质一般包括选自下列片段的多肽的片段a)KN-AAl-EL-AA2-NKGS-AA3-GLKENAE-AA4(更正规的三字母氨基酸代码为Lys-Asn-AAl-Glu-Leu-AA2-Asn-Lys-Gly-Ser-AA3-Gly-Leu-Lys-Glu-Asn-Ala-Glu-AA4);
其中ⅰ)AA1是Lys或Asn;
ⅱ)AA2是Arg或Gln;
ⅲ)AA3是Asp或Glu;
ⅳ)AA4是Leu或Gln;
b)D-AA5-KN-SEQ6-NKD-SEQ7-N-AA8(更正规的三字母氨基酸代码为Asp-AA5-Lys-Asn-SEQ6-Asn-Lys-Asp-SEQ7-Asn-AA8);
其中ⅰ)AA5是Met或Leu;
ⅱ)SEQ6是Lys-Glu-Leu-Leu或Asn-Asp-Ile-Gln;
ⅲ)SEQ7是Leu-Ser或Ile-Arg;
ⅳ)AA8是Lys或Glu; 和/或c)Gln-Gln-Asn-Thr-Gly-Leu-Lys-Asn-AA9-AA10-AA11-AA12-AA13，其中ⅰ)AA9是Thr或Ala;
ⅱ)AA10是Pro或Ala;
ⅲ)AA11是Ser或Asn;
ⅳ)AA12是Glu或Lys;
ⅴ)AA13是Gly或Arg。
在具体的实施方案中，所说的片段至少重复3次，或彼此相邻。优选的实施方案是以这样一段顺序结尾，即其中AA9是Thr;AA10是Pro，AA11是Ser，AA12是Gly，AA13是Gly;AA9是Ala，AA10是Ala，AA11是Asn，AA12是Lys，AA13是Gly;AA11是Asn，AA12是Glu，AA13是Arg;或AA11是Asn，AA12是Glu，AA13是Gly。其它实施方案编码多个所说的抗原决定簇。
其它实施方案提供了含有下列无氨基酸顺序的基本纯的多肽a)Gln-Gln-Asn-Thr-Gly-Leu-Lys-Asn-Thr-Pro-Ser-Glu-Gly;或
b)一段与a)中定义的氨基酸顺序基本一致的肽顺序。另一个实施方案是含有公开于表3中的氨基酸顺序之片段的重组多肽。典型的重组多肽含有下列氨基酸顺序a)Gln-Gln-Asn-Thr-Gly-Leu-Lys-Asn-Thr-Pro-Ser-Glu-Gly;或b)一段与a)中定义的氨基酸顺序基本一致的肽顺序。
本发明还提供能特异性识别疟疾PfEMP3蛋白特有的抗原决定簇的抗体。具体的抗体实施方案识别表3所公开的抗原决定簇，例如，一段见于下列PfEMP3同源重复区的顺序Gln-Gln-Asn-Thr-Gly-Leu-Lys-Asn-Thr-Pro-Ser-Glu-Gly。
本发明还提供了诊断宿主疟疾感染的方法，该方法包括使上述的抗体与得自所说宿主的样本接触。具体地说，这常常涉及到检测疟疾PfEMP3蛋白在生物体中的存在。本发明还提供了每个隔室包含下列成分的试剂盒a)特异性结合PfEMP3蛋白的蛋白质;或b)PfEMP3蛋白或其片段。
本发明还提供了治疗组合物，这些组合物包含有效量的所述抗体和另一种抗疟疾治疗剂，最好以单位剂量配制。
本发明还包括一种疫苗，该疫苗包含分离的核酸、基本纯的PfEMP3多肽、特异性识别疟疾PfEMP3蛋白特有的抗原决定簇的抗体、或疟疾PfEMP3肽的抗个体基因型抗体，所述分离的核酸包括编码与疟疾PfEMP3蛋白的相应片段高度同源的多肽片段的顺序。


图1显示从cDNA顺序推测的PfEMP3的一级结构。不同的阴影区代表蛋白质的不同区域。13体顺序中的间隙表示尚未完全测序的区域，其长度是根据限制图谱推出的。图中还显示了克隆p2b1、p12-1和pJC3的大致长度。
本发明的概况Ⅰ.概述Ⅱ.核酸A.上游、下游特征B.内含子/外显子组成C.同源性D.探针Ⅲ.蛋白质A.结构域结构B.重复特性C.功能特征、推测D.基本一致性、类似物E.片段F.融合蛋白质Ⅳ.抗体;结合蛋白A.多克隆、单克隆B.嵌合的;人化的C.融合蛋白质D.抗个体基因型的Ⅴ.诊断应用A.DNA探针
B.蛋白质检测C.结合组合物Ⅵ.试剂盒Ⅶ.治疗应用Ⅰ.概述本发明提供了两类能与存在于成熟无性阶段寄生虫感染的红细胞(PE)膜上、分子量大于200KD的疟疾抗原反应的大鼠单克隆抗体，即41E11和MAb 12C11。41E11代表一类能限定包括一种约310KD蛋白质在内的一组独特蛋白质的单克隆抗体。这后一种蛋白质被进一步分离，并且克隆了编码该蛋白质的基因。本发明涉及抗体组合物、分离的蛋白质、两者之一的功能片段及其应用。
本发明特别公开了上述两类单克隆抗体的详细特征，也描述了由抗体识别的抗原的本性和性质，例如，疟疾抗原的去污剂提取特性、抗原在SDS-PAGE中的相对迁移率、这些MAbs与固定细胞的免疫荧光(IFA)反应模式以及抗原的阶段特异性表达。另外，已分离和克隆了一种由MAb 12C11识别的疟疾红细胞膜蛋白。该蛋白约为315KD，最初称为抗原12A，并且在后来被称为恶性疟原虫红细胞膜蛋白3，或简称为PfEMP3。PfEMP3不同于D260、PfEMP1和PfEMP2。PfEMP3抗原与以前鉴定的HRP1一样，可能与球形物的形成和结构有关。携带缺失了编码PfEMP3的基因的疟原虫品系显示出无球状物的表型。
更具体地说，本发明的基础包括大鼠单克隆抗体的制备和鉴定，这种抗体对在被寄生虫感染的红细胞中表达的很大的恶性疟原虫蛋白质有特异性。
由用大于200KDa的PE蛋白质免疫的大鼠制备杂交瘤。用PE的SDS提取物观察到两种模式的Western吸印反应性，其一由12种杂交瘤代表，我们对其中的一个克隆41E11(IgM，к)进行了研究;其二由单一的杂交瘤克隆12C11(IgM，λ)代表。
两种大鼠MAbs在进行Western吸印时均与数种抗原反应。在用MAb 41E11分析E的提取物时，未观察到上述条带，并且，由于MAb 41E11免疫沉淀生物合成放射标记疟疾蛋白D260/Ag41B，所以这些条带可能代表疟疫蛋白。虽然一些IgM MAbs(如33G2)在进行Western吸印时也能与许多抗原反应，但其它的IgM MAbs(如用于确认PfEMP2的鼠MAb 4H9.1)在进行Western吸印和免疫沉淀分析时都只与一种疟疾蛋白发生特异性反应。就41E11而言，这些为数众多的反应性可能对应于对一个共同氨基酸重复基序的识别，这种结构可能类似于由人IgM MAb 33G2识别的EEXXEE基序。
由于尚无有关MAb 33G2能免疫沉淀任何疟疾蛋白的报道，所以可以证明MAb 41E11对D260/Ag41B的免疫沉淀作用是一种有用的特性。
MAb 12C11在进行Western吸印时与一组条带(Ags 12A-12E)反应，由于在E提取物中不存在这组条带，因此它们可能代表疟疾蛋白。Ags 12A-12E可能共有线性氨基酸顺序，并且相应于具有最高表观分子量的Ag 12A的蛋白降解产物。或者，这些抗原可能是能与MAb 12C11发生交叉反应的有显著差别的基因产物。
MAb 12C11的一个奇怪的特征是在进行Western吸印时能与分子量为40和30KD(Ags 12F和12G)的正常人E的蛋白成分反应，观察到它与包括不同寄生虫阶段的PE有同样的反应性。在纯化的人血红蛋白的Western吸印中，用MAb 12C11作探针，也见到30KD条带。约为12KD的血红蛋白单体形式即使丰富，但它们也不与MAb 12C11反应。商业上制备的血红蛋白制备物中的30KD条带可能代表血红蛋白二聚体，或者代表血红蛋白与来源于正常人E细胞质并已被共纯化的另一种蛋白质的加合物。值得注意的是，MAb 12C11不与正常红细胞或PE中的血红蛋白反应，这些红细胞已用多聚甲醛或丙酮固定并用免疫荧光(IFA)进行了分析。在这些条件下，只有PE为荧光阳性，并且只有宿主细胞质内的寄生虫依赖性结构(除去含有血红蛋白的细胞质)具有反应性。
MAb 12C11与血红蛋白的Western吸印的反应最初增加了MAb与已结合至人或寄生虫蛋白上的血红蛋白发生反应的可能性。然而，所获得的进一步数据表明，MAb 12C11也与疟疾蛋白上的抗原决定簇直接发生反应，这表明正如在应用MAbs时时常发现的，与血红蛋白的反应性是偶然的交叉反应性。用两种标准判断MAb 12C11与疟疾蛋白上抗原决定簇的反应性。第一，用MAb 12C11对λgt11疟疾基因组DNA表达文库进行免疫探测，鉴定出含有疟疾核酸顺序的克隆(按照用插入DNA进行的Southern和Northern吸印方法)并表达MAb 12C11反应性融合蛋白。第二，证明MAb 12C11能与来自于gDNA克隆之一的推测氨基酸顺序的线性肽反应。
由于SDS-PAGE凝胶的丙烯酰胺浓度在4%和7.5%之间变动，几种MAb 41E11反应性抗原的相对迁移率与Ag12A(PfEMP3)和PfEMP2有很大的差异。例如，在丙烯酰胺为4%时，Ag 41B 比PfEMP3(Ag12A)和PfEMP2迁移得慢，而在丙烯酰胺为7.5%时，它却迁移得较快。这种电泳行为可能是由于高比例的独特氨基酸顺序如重复基序EEXXEE的存在。与此相反，同样大小范围的PfEMP3与PfEMP2相比其相对迁移率没有改变。
用丙酮或多聚甲醛固定的PE的免疫荧光(IFA)结果可提供有关由两种大鼠MAb识别的抗原位置的信息，但不能提供每族中各个抗原位置的信息。Udomsangpetch等(1989)J.Immunol.1423620-3626描述了用固定的PE进行的人IgM MAb 33G2 的 IFA图形。这些用MAb 41E11得到的结果在不同的无性阶段寄生虫中均给出相同的图形，这证实了在进行Western吸印时这些抗体表现出的相似的特异性。MAb 12C11和41E11都提供了疟疾抗原从寄生虫移至PE的外围的证据。不成熟的无性寄生虫本身最初为荧光阳性，随着寄生虫的成熟，PE胞质内的一些结构中见到发生抗原反应的数量不断增加，后来这些结构出现在邻近细胞外膜处。这些抗原性结构可能对应于不同的膜性结构或电子致密物质，而这些膜性结构和电子致密物质已被透射电镜在宿主细胞质中鉴定出，并已在几项用免疫电镜进行的研究中被证明带有疟疾抗原。
由MAb 12C11识别的抗原的亚细胞分布不同于由MAb 41E11识别的抗原的亚细胞分布。MAb 12C11得到的荧光强度较弱，并且在宿主细胞质中所见用MAb 12C11进行的荧光反应聚集体一般要小一些。而且，MAb 12C11可以标记许多只有微弱荧光反应的小聚集体，而用MAb 41E11时完全不存在荧光反应。由于这些小聚集体直径等于或小于0.2μm，而球形突起物为约0.1μm，所以MAb 12C11免疫荧光反应可能与球形物相关。的确，用LR金树脂包埋物进行的免疫电镜显示出MAb 12C11可与球形物反应，而41E11则不能。
已分离出针对12C11的单克隆抗体，并且这种单克隆抗体是一组具有能与成熟无性阶段恶性疟原虫的多种蛋白质反应特性的抗体。这些蛋白中最大的为约315KD，称为PfEMP3。由Malayan Camp品系寄生虫的基因组DNA产生的λgt11表达文库用MAb 12C11进行筛选。一个阳性克隆λ12.1.3含有与λgt11的β-半乳糖苷酶基因码内融合的1.4kb片段。所推断的455氨基酸顺序是新的、高度带电荷的顺序，该顺序编码在N末端紧接有27个13氨基酸重复单位的两个15氨基酸重复单位。C末端的最后59个残基为非重复性的。gDNA的3′末端的两个码内终止密码子表明该DNA片段编码了蛋白的C末端。cDNA克隆的测序证实了码内终止密码子在该位置的存在。用克隆片段进行的Southern吸印证实了在球形物阳性、CD36粘附的寄生虫感染的红细胞(K+C+PE)中每单倍体基因组有两个拷贝的这种片段。这两个DNA片段均未在K-C-PE中出现。滋养体阶段PE总RNA的Northern吸印显示在K+PE中有10、4.4、2kb的mRNA，但不与K-PE杂交。现已诱发了抗λ12.1.3β-半乳糖苷酶融合蛋白和产生于所推测的λ12.1.3氨基酸顺序的肽的免疫血清。这些血清和MAb 12C11在进行Western吸印时能与成熟K+PE的PfEMP3发生特异性反应，但不与K-PE的任何抗原反应。大鼠和小鼠的抗重组蛋白血清在固定的成熟K+PE所形成的免疫荧光图形与由抗球状物相关蛋白(组氨酸丰富蛋白，HRP1)单克隆抗体所形成的免疫荧光图形完全一样。同样的抗体对进行了固定的K-PE则无免疫荧光产生。小鼠抗重组蛋白抗体在免疫电镜中也与K+PE的红细胞膜、标记的球状物以及球状物间的膜反应。相反，抗HRP1的MAb只在球状物的电子致密物质下反应。λ12.1.3 DNA 克隆编码315 KD PfEMP3抗原的C末端部分。球状物的形成可能需要蛋白PfEMP3，而且PfEMP3可能具有引起宿主细胞膜的各种紊乱的作用。
MAb 41E11在进行Western吸印时可识别类似于人MAb 33G2所识别的抗原的一组抗原。除了存在一种可用MAb 33G2而不能用MAb 41E11检测出的抗原以外，这些MAbs共同具有与具有同样迁移性和去污剂溶解性特征的一组抗原反应。另外，MAb 41E11已用于从λgt11疟疾gDNA表达文库中克隆基因片段，该基因片段与已公开的Pf11.1的DNA顺序有很强的顺序同源性。
Pf11.1是一种有性阶段抗原，它是具有可被MAb 33G2识别的EEXXEE氨基酸重复基序的恶性疟原虫抗原的一种。MAb 41E11在ELISA试验时也和与Pf155/RESA有共同重复结构的肽(EENV)6[或(Glu-Glu-Asn-Val)6]发生很强的反应。该肽含有被证明为MAb 33G2决定簇的EE(Glu-Glu)二肽顺序，它也通过ELISA与MAb 33G2发生很强的反应。所有这些数据，包括观察到Pf155/RESA蛋白可作为成对物迁移以及它在Triton X 100中基本不溶，均意味着Ags 41A、41B和41C加41D分别对应于Ags 332、D260和Pf155/RESA。这些结果总结于表1中。
表1MAb 41E11反应性抗原与以前鉴定的、含EEXXEE氨基酸基序的恶性疟原虫抗原之间的对应关系MAb 41E11抗原 Mr(KDa) 以前的鉴定b参考文献c41A 2.5×103332 Mattei等(1992)41B 320 D260 Peterson等(1990)41C 175 Pf155/RESA Mattei等(1989);
Udomsangpetch等(1989)41D 160 Pf155/RESA Mattei等(1989);
Udomsangpetch等(1989)a 获自表5。
b 基于Mr、去污剂提取特性和与MAb 33G2反应性抗原共同迁移的结合的特征进行的暂时的鉴定。
c 参考文献Mattei等(1992)Gene 11071-79。
Pettersen等(1990)Mol.Biochem.Parasitol.42189-196。
Mattei等(1989)Parasite Immunol.1115-30。
Udomsangpetch等(1989)J.Immunol.1423620-3626。
MAb 12C11与在SDS-PAGE上有不同迁移速度的一组疟疾抗原反应，该组抗原与由MAb 41E11所鉴定的抗原完全不同(表1)。由MAb 12C11在进行Western吸印时所识别的最大抗原-约为310KD的Ag 12A(PfEMP3)有着与D260/Ag 41B、PfEMP2和PfEMP1相近的迁移率。D260/Ag 41B以主要存在于PE的Triton X-100提取物中著称，而PfEMP2从Triton X-100不溶物的SDS提取物中回收，并且PfEMP3可存在于Triton X-100和SDS提取物两者之中。有可能用含有不同浓度丙烯酰胺的SDS-PAGE溶解PfEMP3(Ag 12A)、D260/Ag 41B和PfEMP2。尽管应用了多样的第二抗体和亲和吸附剂，但MAb 12C11始终不能使在其表面用125I碘化的或用35S-蛋氨酸进行了生物合成或放射性标记的任何疟疾蛋白发生免疫沉淀。这表明MAb 12C11限制为识别只出现在经过SDS-PAGE和Western吸印之后所见的失去天然形态的相关疟疾蛋白上的线性抗原决定簇。鉴于MAbs源自用SDS提取物切下的SDS-PAGE凝胶片免疫的大鼠，因而这样的结果并不使人感到吃惊。PfEMP3也区别于PfEMP1。
当于来源于FVO(Vietnam Oak Knoll)、FMG(参见Elliott等，PNAS(1990)，876363-6367)和MC(Malayan Camp)品系疟原虫的SDS提取物的MAb 12C11进行Western吸印以鉴定PfEMP3时，PfEMP3在表现Mr方面未发生显著改变，这些SDS提取物在还原条件下以SDS-PAGE分成多个部分。相反，125I碘化的PfEMP3蛋白在表现Mr方面发生改变，以FVO品系疟原虫的PfEMP3最显著，碘化的PfEMP3是在免疫沉淀后用品系特异性Aotus猴血清通过其表面标记的放射性鉴定的。在FVO品系中，125I碘化的PfEMP3的迁移位于约为250KD的条带位置，此迁移率快于PfEMP3条带。在MC和FMG品系疟原虫中，PfEMP1和PfEMP3条带迁移彼此接近。这些结果已得到用在同一凝胶泳道上结合进行的免疫沉淀和Western吸印实验的证实。多种抗λ12.1.3重组蛋白(作为谷胱甘肽-S-转移酶，GST)的大鼠、兔和小鼠血清未标记经Western吸印免疫沉淀的125I-PfEMP1。从非洲得到的人免疫血清的免疫沉淀125I-PfEMP1的能力也与PfEMP3(经探测Western吸印进行鉴定或用MAb 12C11或抗λ12.1.3血清进行免疫沉淀)的免疫沉淀无关。
以前认为大鼠MAb 12C11具有与产自成熟无性疟原虫的许多不同恶性疟原虫抗原反应的特征。应用MAb不能把所定义的单个抗原定位于特殊的亚细胞器中。这些抗原中最大的为约315KD的PfEMP3，如本文所述，以前也称为抗原12A。已证明PfEMP3为不同于在SDS-PAGE上有相似迁移率的MESA/PfEMP2和D260/Ag 41B的新抗原。在MC疟原虫品系中，PfEMP3在分子量、去污剂提取特性和其由晚期PE进行的表达等方面类似于公认的PE受体。为了更好地了解这种高分子量抗原的特征以及制备单一特异性抗体试剂，克隆PfEMP3的基因是重要的。该目的可通过用MAb 12C11探测λgt11表达文库分离出λ12.2.3达到。已有一些各自独立的证据支持λ12.1.3含有的基因片段实际上编码PfEMP3的一部分但并不编码另一种交叉反应基因产物的结论。首先，从采集的人免疫血清中纯化的抗体在免疫吸印中特异性地与PfEMP3反应但并不识别与MAb 12C11反应的其它抗原。另外，以重组融合蛋白免疫的大鼠、兔和小鼠产生能与PfEMP3反应的血清，该反应由免疫吸印测定。更强有力的证据为观察到了用来源于所推测的带有β-半乳糖苷酶的顺序的三种不同肽对兔进行免疫，产生了可与PfEMP3反应的血清。另外，同源于K-品系中λ12.1.3的插入段的DNA的缺失与PfEMP3在免疫吸印中表达的丧失有关，但并不导致其它更小的MAb 12C11反应性蛋白的丧失。最后，λ12.1.3DNA插入子与10kb的RNA转录子杂交，该RNA转录子的长度是以编码PfEMP3大小的蛋白。
该项研究表明由MAb 12C11定义的PfEMP3与另外两种大的疟疾蛋白MESA/PfEMP2和D260/Ag 41B有显著不同。其它已知为如此大小的蛋白质仅有PfEMP1，这种PE的表面蛋白据认为在体内介导PE粘附至微血管内皮细胞上，在体外介导PE粘附至纯化的CD36、血栓应答素和ICAM-1上。由于λ12.1.3的顺序是新的，因此，对目前还不清楚的该gDNA片段是否编码PfEMP1或另一种蛋白的问题进行了研究。已获得多种抗重组融合蛋白(RP)的抗血清，以检测其是否能特异性地免疫沉淀125I-表面标记的PfEMP1。在对K+C+疟原虫提取物进行免疫吸印时，所有源于不同单模标本的同类系小鼠、大鼠以及兔的抗RP血清均可与PfEMP3反应。只有一种抗RP兔血清05-75始终免疫沉淀125I-PfEMP1。某些大鼠抗RP血清也可以免疫沉淀125I-PfEMP1，但不是在所有的实验中均能如此。所获得的兔抗λ12.1.3顺序肽的抗血清通过免疫吸印疟原虫提取物识别PfEMP3，但所说的抗血清不能免疫沉淀125I-PfEMP1。这些血清中只有一种始终成功地免疫沉淀PfEMP1，这个事实可能归因于少数实验动物的基因特性，这些所说动物能够产生正确的特异性的免疫应答。一种更简单的假设是PfEMP3和PfEMP1并不相同，但它们共同具有由少数动物识别的抗原决定簇或mimctope(非必需的线性肽顺序)。PfEMP3的其它特性支持了最后一个论点。用猴抗血清可将125I-PfEMP1从不同恶性疟原虫株的PE中特异性地免疫沉淀出来，所说的猴抗血清能特异性地只凝集同源疟原虫的PE。以这种方法鉴定的、来源于不同株的PfEMP1在SDS-PAGE上具有显著不同的迁移率。相反，用MAb 12C11和抗RP血清鉴定的PfEMP3在各株之间具有一致的Mr这一特征。鉴于所有的数据，可以得出PfEMP3和PfEMP1是有差异的和性质截然不同的蛋白质的结论。
没有一种抗RP或抗肽血清在进行凝集或湿性IFA试验时始终与完整的非固定PE的表面反应。这一结果并未否定PfEMP3为表面蛋白的可能性。已获得抗10kb基因的仅1.4kb片段表达部分的抗RP血清。PfEMP3表面暴露的抗原决定簇可在除了3′末端的基因的其它部分很好地编码。完整基因的测序工作目前正在进行，并也可能揭示PfEMP3的跨膜区域和表面暴露区。
用λ12.1.3探针对K+DNA的EcoRI消化物进行的Southern吸印检测出了两个EcoRI片段。由于λ12.1.3的克隆DNA无任何内部的EcoRI位点，上述结果表明在恶性疟原虫基因组中至少有两个该克隆基因片段的拷贝。用其它限制性内切酶也获得了相似数据。目前还不能分辨这些拷贝是存在于单个基因中还是两个或多个基团中。由这些拷贝在K-品系中均未存在，所以它们在基因图上应彼此相近。如果有一个以上的PfEMP3的拷贝存在，那么测定是否有一个或两个拷贝在成熟PE中进行表达就很重要。
λ12.1.3DNA插入段与三种不同的RNA杂交，10kb的转录子已大得足以编码整个PfEMP3蛋白。由于K-PE中PfEMP3基因的缺失导致PfEMP3基因转录子的丧失，因此这些转录子必须从PfEMP3基因位点进行转录，虽然如此，但还不知道较小的RNA(4.4和2kb)的来源。因此，较小的转录子可能是全长信息RNA的特异性降解产物或者可能在PfEMP3中有其它偶发的启动子。也可能是双链探针与在PfEMP3相对应的DNA链上转录的信息杂交，因为在该链上编码了一个长的开放阅读框架。
PfEMP3蛋白质的C末端显示出一些异源性。cDNA克隆中有两个克隆与gDNA克隆完全相同，但第三个克隆(pJC12)在C端的最末端有轻度变异。顺序的不同可能表明恶性疟原虫非克隆的Malayan Camp品系的异源性。另一种可能性是PfEMP3基因有1个以上的拷贝。所推测的编码PfEMP3 C末端的四种不同克隆的氨基酸顺序在表2中列出以供比较。
星号(＊＊＊)表示顺序的C末端;垂直线(Ⅰ)表示顺序间同样的氨基酸。
PfEMP3在恶性疟原虫基因组的染色体2上编码。在所有试验的K-品系中，PfEMP3基因均缺失，这表明球状物的表型可能需要PfEMP3。而且，该基因的丧失常与寄生虫品系细胞粘附作用的丧失有关。因为Palo Alto品系缺失PfEMP3基因但仍有很强的粘附性，所以PE的细胞粘附不需要PfEMP3基因。PfEMP3可能涉及增强或促进PE通过间接机制，如通过球状物形成，粘附至内皮细胞上。
PfEMP3基因的缺失常与HRP1缺失有关，HRP1为另一种被认为负责球状物形成的基因。HRP1也位于染色体2上，因此这两个基因可能有紧密连接，例如相互毗邻。
在K+品系的固定IFA中PfEMP3和PfEMP1产生相似的染色图形，这说明这两种蛋白共同位于红细胞膜上，由于在所有无球状物品系的试验中，编码HRP1的基因均从基因组中部分或完全缺失，因此，HRP1已被认为是负责球状物形成的成分之一。对于PfEMP3也有同样的证据。在所试验的MC K-株和其它K-寄生虫中，编码PfEMP3的基因完全缺失并且在进行免疫吸印时无PfEMP3痕迹。因此，球状物的形成需要PfEMP3或HRP1，或者两种都需要。如果可以分离出PfEMP3+/HRP1-和PfEMP3-/HRP+寄生虫并测出其球状物表型，就可以回答上述问题。Ellis等(1987)Mol.Biochem.Parasitol.26203-214提出克隆7G8是一个用多种办法包括组氨酸标记、免疫沉淀和免疫吸印在其中均未测出HRP1的K+寄生虫。然而，用MAb 89和抗HRP1兔多克隆血清进行免疫吸印时，在克隆7G8的近期培养物中测出了HRP1和PfEMP3。
PfEMP3可能与宿主红细胞细胞骨架中的某些成分发生作用。已证明与条带4.1同源的HRP1的一个肽段结合至纯化的Spectrin和肌纤蛋白上。另外，使红细胞的内外囊泡与所说肽一起保温、重新密封，随后发现这些囊泡的电子致密物质恰好集中位于红细胞膜下。这些数据表明HRP1可能是(至少部分是)与球状物处的电子致密物质有关。值得注意的是这种肽并不产生与球状物相关的突起物。其它的疟原虫蛋白如Pf155/RESA和MESA/PfEMP2也与红细胞细胞骨架的特异蛋白发生作用。Pf155/RESA结合Spectrin，MESA结合条带4.1。这些蛋白和HRP1与细胞骨架之间的联系可能直接负责红细胞变形性的减弱。还需要进行类似的上述实验以评价PfEMP3与红细胞细胞骨架间的作用。
Ⅱ.核酸由SDS-PAGE所估测的PfEMP3的大小为315KD。根据PfEMP3的相对迁移率所估测的DNA编码顺序的长度为约9.5kb。这种大小与由Northern吸印测出的PfEMP3 mRNA为10kb的大小是一致的。迄今为止，已测出编码PfEMP3的C末端DNA顺序约为6kb。假设所说基因约为10kb，那么PfEMP3基因的4kb仍需要测序，这部分基因将编码蛋白的N末端。利用可行的技术，例如如下面所述的技术，可以分离含有相应顺序的克隆并对之进行测序。
本发明研究了应用编码抗原或其片段的分离的DNA或片段以编码有生物活性的相应多肽。另外，本发明包括分离的或重组的DNA，所说的DNA编码具有免疫原性或抗原活性的生物活性蛋白质或片段并且在适宜的条件下能与表3所示的DNA顺序或其侧翼顺序杂交。所说的生物蛋白质或多肽可以是抗原本身或片段，并且具有表3所示的氨基酸顺序或其侧翼编码顺序。进一步说，本发明包括分离的或重组的DNA及其片段的应用，所说的DNA及其片段编码与上述蛋白质同源的蛋白质，或用编码同源蛋白的cDNA作为探针而被分离出。分离的DNA可在5′和3′两侧有各自的调节顺序，例如启动子、增强子、多聚A加入信号等。
“分离的”核酸是指如RNA、DNA或混合聚合物的核酸，这种核酸已基本上从当然具有天然顺序(例如，从原始的或相关物种而来的核糖体、聚合酶以及侧翼基因组顺序)的其它成分中分离出来。该术语包括了已从其天然存在环境中分离出来的核酸顺序，并且包括重组或克隆的DNA分离物以及化学合成的类似物，或由异源系统生物合成的类似物。基本纯化的分子包括分子的分离形式。
分离的核酸一般是各种分子的同源性组合物，但在某些实施方案中会有微小的不均一性。这种不均一性一般见于聚合物末端或者对所需生物功能或活性无重要性的部位。另外，不均一性可由不同mRNA拼接、基因变异或移码、品系变异以及其它过程引起。
“重组”核酸以其制备方式或结构进行定义。关于其制备方法，即为所应用的重组核酸技术，该技术涉及人类对核酸顺序的人为干预。另外，重组核酸可以是以制备一种顺序获得的核酸，该顺序包括天然状态下并不相邻的两个片段的融合;然而排除了(例如天然存在的突变体的)天然产物，因此，正如含有用任何合成寡核苷酸方法得到的顺序的核酸一样，通过用任何非天然存在载体转化细胞制成的产物也包括在内。在典型地导入或去除一个顺序识别位点时，常用此方法以编码同一个氨基酸的密码子或以编码保守相关氨基酸的密码子替代另一密码子。另外，可将所需功能的氨基酸片段连接起来产生单一的遗传实体，它包括在普遍可得到的天然形式(例如启动子-基因对)中未发现的所需功能的结合。限制性酶识别位点常常是这种人工基因操作的靶子，但也可设计将其它特异性位点靶包括进来，这些位点包括启动子、DNA复制位点、调节顺序、调控顺序或其它有用的特征位点。对于重组多肽如融合多肽也可采用相似的构想。特别要包括的是合成核酸，这种核酸以遗传密码的多余部分编码类似于所说抗原片段的多肽和许多不同的相关蛋白顺序的融合。
本文在核酸中所用的“片段”一词指相邻的一段核苷酸，它至少为17个核苷酸，一般至少为20个核苷酸，更一般至少为23个核苷酸，普通至少为26个核苷酸，更普通至少为29个核苷酸，常常至少为32个核苷酸，更常见的是至少为35个核苷酸，典型的是至少为38个核苷酸，更典型的是至少为41个核苷酸，通常至少为44个核苷酸，更通常至少为47个核苷酸，优选至少为50个核苷酸，更优选至少为53个核苷酸，在特别优选的实施方案中至少为56个或更多的核苷酸。
编码PfEMP3蛋白的DNA在鉴定编码相关或同源蛋白的基因、mRNA和cDNA种类方面以及编码不同种类相关抗原的DNA方面特别有用。种属和菌株变异体应高度同源并包括在本文中。然而，即使是与PfEMP3的关系很远，并且不能与株特异性探针杂交的蛋白，如果它们有足够的同源性，用相关顺序也能容易地被分离出。哺乳动物的相关蛋白引起人们特别的兴趣。鉴于有高含量AtT倾向的疟原虫独特密码子的应用，可以预料哺乳动物的同源蛋白可能不被核酸杂交所识别。相反，通过比较所推测其它生物体的同源顺序的蛋白顺序，则更可能被识别。检索目前的Swiss Prot和NBRF蛋白顺序数据库没有找出一种与PfEMP3，尤其是其重复片段，有广泛同源性的蛋白质。
用于这种筛选的优选探针是抗原的重复区，尤其是在不同株之间都保守的抗原区。具体地说，要求多种重复片段表现出与其它相关抗原的相应区域有高度同源性。通过比较从不同疟疾株尤其是疟原虫属分离的其它相似蛋白，将识别出其它保守区。
本发明进一步包括与本文中所阐明的分离DNA相同或有高度同源性的DNA顺序的重组DNA分子和片段。具体地说，这种顺序常经人工基因操作连接至控制转录、翻译和DNA复制的DNA片段上。
在比较同源的核酸顺序时，这些顺序显示出显著的相似性。核酸同源性的标准或者是以现有技术中一般所用的顺序比较测定同源性，或者是基于杂交条件。下面将更详细地描述杂交条件，尤其是所涉及的温度、盐和其它影响杂交能否检出的可变因素。
在对核酸顺序比较的上下文中，基本同源性意为核酸片段或其互补链插入或缺失适宜的核苷酸并进行最理想的排列后相互比较，它们的一部分核苷酸完全相同，这些核苷酸至少为50%的核苷酸，一般至少56%，更一般至少59%，普通至少62%，更普通至少65%，经常至少68%，更经常至少为71%，典型地至少74%，更典型地至少77%，通常至少80%，更通常至少85%，优选至少90%，更优选至少约95%至98%或更高。并且，在具体实施方案中，可以高达核苷酸的约99%或更高。另外，在核酸片段于选择性杂交条件下与典型地来自表3疟原虫基因组的一段顺序或其侧翼顺序的单链或其互补链杂交时，基本同源性同样存在。典型地是，当至少为14个核苷酸的一般顺序中有至少约55%同源，优选的至少约65%，更优选的至少约75%，最优选的至少约90%时，选择性杂交将产生(参见Kanehisa(1984)Nuc.Acids Res.12203-213，引入本文作为参考)。正如所描述的，同源性比较可以在较上的一段顺序上进行，在某些实施方案中，这段顺序可以超过至少约17个核苷酸，通常至少约20个核苷酸，更通常至少约24个核苷酸，典型地至少约28个核苷酸，更典型地至少约40个核苷酸，优选至少约50个核苷酸，更优选至少约75至100个或更多的核苷酸。
考虑到杂交前后的同源性，严格的条件将与盐分、温度、有机溶剂和在杂交反应中典型地受控的可变因素等条件严格结合。严格的温度条件通常包括超过约30℃，更通常超过37℃，典型地超过约45℃，更典型地超过约55℃，优选超过约65℃，更优选超过约70℃。严格的盐分条件一般少于约1000 mM，通常少于约500 mM，更通常少于约400 mM，典型地少于约300 mM，优选少于约200 mM，更优选少于约150 mM。然而将可变条件结合起来考虑比任何单个条件的测定更为重要。参见，例如，Wetmur and Davidson(1968)J.Mol.Biol.31349-370，引入本文作为参考。
Ⅲ.蛋白质已从PfEMP3蛋白的基因顺序测出其蛋白的一部分顺序。如由SDS-PAGE所估计的，分离的克隆编码整个成熟蛋白的约60%。还未对翻译后的修饰进行完全的分析，但顺序的测定表明有酪蛋白激酶Ⅱ介导的磷酸化共有顺序位点，如(ST)XX(D、E)。
该1393 bp片段有一个推测的氨基酸顺序，该顺序带有高电荷，它以两个15氨基酸重复单位起始，紧接有27个完全13氨基酸重复单位，并以非重复顺序的59个氨基酸结束(表3)。在整个多肽中，酸性氨基酸和碱性氨基酸分别占9.3%和13.8%。在克隆的3′末端有两个码内终止密码子，这表明此DNA片段编码PfEMP3的C末端。这些终止密码子也见于用λ12.1.3 DNA插入段作为探针从cDNA库中分离出的克隆中，这提示这些终止密码子并不归因于进入内含子的编码顺序。
表3PfEMP3的DNA和推测的氨基酸顺序结合P2b1和P12-1 cDNA顺序
表3(续)
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在λ12.1.3的对应链中存在有长的开放读码，它起始于第1365位核苷酸(表3)并扩展至第一位置，编码总共455个氨基酸。在接近反相翻译的PfEMP3顺序C末端的第114位核苷酸处才于该“反向”开放阅读码(rORF)中发现起始密码子(AUG)。然而，共有拼接接受位点位于1322位和1323位核苷酸之间，这表明从1323至1393的核苷酸可编码内含子的一部分，并且该基因的起始位点位于5′-外显子中。对于PfEMP3来说，所推测的由rORF编码的氨基酸顺序含有13氨基酸重复单位，但与PfEMP3不同的是，该氨基酸顺序具有强疏水性。在rORF中，重复单位的共有顺序是CCPSLGVFFKPVF[Cys-Cys-Pro-Ser-Leu-Gly-Val-Phe-Phe-Lys-Pro-Val-Phe]。高含量的半胱氨酸表明非常复杂的二级结构。该重复单位比PfEMP3的13氨基酸重复单位更为保守。对该rORF密码子的应用所作的分析表明，由恶性疟原虫优选的密码子有高出现率，这显示的确存在着对该rORF的基因产物。对疟疾数据库PIR/NBRF蛋白顺序数据库的检索没有找出任何同源多肽。
对PfEMP3蛋白顺序的详尽分析显示出重复性结构。表4是以强调PfEMP3蛋白顺序中的重复单位的方式显示的。存在21个有同源性的完整片段，其中的同源片段长度为22个氨基酸，即相应于下列位置的氨基酸472-493，494-515，516-537，538-559，560-581，582-603，604-625，626-647，648-669，670-691，692-713，714-735，736-757，758-779，780-801，802-823，824-845，846-867，868-889，890-911和912-933，加上来自934-946的部分同源片段。还有含19个氨基酸长度之同源性的11个完整片段，即相应于下列位置的氨基酸949-967，968-986，987-1005，1006-1024，1025-1043，1044-1062，1063-1081，1082-1100，1101-1119，1120-1138和1139-1157，加上来自1158-1173的部分同源片段。有15个氨基酸长度的同源性的4个完整片段，即相应于下列位置的氨基酸1179-1193，1194-1208，1209-1223和1224-1238。有13个氨基酸长度的同源性的27个完整片段，即1248-1260，1261-1273，1274-1286，1287-1299，1300-1312，1313-1325，1326-1338，1339-1351，1352-1364，1365-1377，1378-1390，1391-1403，1404-1416，1417-1429，1430-1442，1443-1455，1456-1468，1469-1481，1482-1494，1495-1507，1508-1520，1521-1533，1534-1546，1547-1559，1560-1572，1573-1585和1586-1598，加上来自1599-1604的部分同源片段。这些片段以串联形式重复，在这种形式中，它们彼此邻近又无间隔顺序插入。13体的规范化顺序为GlnGlnAsnThrGlyLeuLysAsnThrProSerGluGly.
如果进行定位，其完整的顺序为(Gln，27)-(Gln，26/Pro，1)-(Asn，27)-(Thr，25/Asn，2)-(Gly25/Asp，2)-(Leu，27)-(Lys，27)-(Asn，27)-(Thr，22/Ala，4/Lys，1)-(Pro，22/Ala，5)-(Ser，14/Asn，12/lle，1)-(Glu，20/Lys，7)-(Gly，21/Arg，6)，其中应用了(A，b/c，d)命名法，A和c为氨基酸，b和d分别表示各自出现的频率，总数为27。特殊普通的重复顺序是进行了修饰的规范化顺序(出现11次)，以致其羧基末端顺序为AsnGluArg(出现5次)，AlaAlaAsnLysGly(出现3次)和AsnGluGly(出现3次)。见表4。对其它重复长度可以进行相似的分析。
表4推测的显示重复结构的氨基酸顺序HKRKEALKQK TEKNEKARNA LKEKKLKEQK KNDAQKAKDL TKKESQDSSS 50EKSLKEKVNG EALKEKENKE TLKKKELENQ KEKEEKNKIK DNNDEALKNK 100GNDKDDKKIV PKKPESVEKD LKEMELKEKE FIKQHLKDYE ERKEKRRNWI 150LRSLRRDKLR EIEQLEKLNA QLESAINELK ERRASRRPMM VKMQRGMKDE 200VDEWIKKYDD EQAEKNGTKD EEIKDKGDGY EEIVETKFYG MRENALGELD 250EYEERYEKKR YYLKEDGEGD LKDVEEKLEE TGYGFREKFP TTRILVKRKR 300NKEQKKLKED KEKKLIAAEE PDDEKKIKLK DSDDKVVVPV NKNKSSFPDK 350FRAPDKKRTM FYRLSELFPI VPRKDNELAV CGDSMDSKVN GKKLKSTFNP 400FKRRRNKLKE RKMQELHKFK KNYKKYQKLL EREKRENPDG EPLNTPEIHV 450IRPSDLMDKG ENKSAGHPFK Y 4711 QPTKGLKEYE ESHVSKDYQL EH2 EPPTKLPEYE KGHVSREYQL DH3 EPPTKLPEYE KGHVSREYQL DN4 EVRDELPEYE KGHVSREYQL DN5 EGPSTLKEYD QTELAKGKDI TN6 KPHESVDEYD QTELAKGKDI TN7 KPHESVDEYD QSELAKGKDI TN8 KPHESVDEYD QTELAKGKEV TN9 KPHENLEEYN ETDLAKGKEV TN10 KPHESVDEYD QSELAKGKDI TN11 KPHESVDEYD QTELAKGKEV TN (22体)12 KARENLEEYN ETDLAKGKEV TN13 KARENLEEYN ETDLAKGKEV TN14 KAHENLEEYN ETDLAKGKEV TN15 KAHENLEEYN ETDLAKGKEV TN16 KAHENLEEYN ETDLAKGKEV TN17 KARENLEEYN ETDLAKGKEV TN18 KARENLEEYN ETDLAKGKEV TN19 KARENLEEYN ETDLAKGKEV TN20 KARENLEEYN ETDLAKGKEV TN21 KARENLEEYN ETDLAKGKEV TN 93322 KARENLEEYE EKD 946YM 9481 KNNELQNKGS DGLKENAEL2 KNKELRNKGS DGLKENAEL3 KNKELRNKGS DGLKENAEL4 KNKELRNKGS EGLKENAEL5 KNKELRNKGS EGLKENAEL6 KNKELRNKGS EGLKENAEL (19体)7 KNKELQNKGS EGLKENAEL8 KNKELQNKGS EGLKENAEQ9 KNKELQNKGS EGLKENAEL
表4(续)10 KNKELRNKGS DGLKENAEL11 KNKELRNKGS DGLKENAEL 115712 KNKELRNKGS EGLKEN 1173VYTNN 11781 DLKNNDIQNK DLSNK2 DMKNKELLNK DISNK (15体)3 DMKNKELLNK DLSNE4 DMKNKELLNK DIRNK 1238DLK 1241SIGNME 12471 QQNTGLKNTP SKG2 QQNTGLKNTP NER3 QQNTGLKNTP SEG4 QQNTGLKNTP SEG5 QQNTGLKNTP NER6 QQNTGLKNTP SEG7 QQNTGLKNTP IEG8 QQNTGLKNTP SEG9 QQNTGLKNAA NKG10 QQNTGLKNAA NKG11 QQNTGLKNTP SKG12 QQNTGLKNTP NER13 QQNTGLKNTP NER14 QQNTGLKNTP SEG (13体)15 QQNNDLKNTP NER16 QQNTGLKNTA SKG17 QQNTGLKNAP NER18 QQNTGLKNTP SEG19 QQNTGLKNTP SEG20 QQNTGLKNAA NKG21 QQNTGLKNTP SEG22 QPNTGLKNTP NEG23 QQNTGLKNTP SEG24 QQNTGLKNTP NEG25 QQNTGLKNTP SEG26 QQNTGLKNTP NEG27 QQNNDLKNKA SKG 159828 QQNNDL 1604
KKNLRGKKN 1663
在得自不同疟疾种或株的PfEMP3同源蛋白中也应发现相似的重复性特征。
PfEMP3类似物正常将含有与在本文中公开的顺序相似的顺序特征。
PfEMP3类似物正常将含有与在本文中公开的顺序相似的顺序特征。这些相似或基本上相同的氨基酸顺序片段正常地将以串联形式重复，典型地至少3次，更典型地至少6次，通常至少9次，更通常至少12次，优选至少15次，更优选至少18次或更多次。这些片段通常将以串联形式重复，但可能在重复片段内或之间包括缺失和插入。
在PfEMP3蛋白的其它部分也发现了相似的特征，存在着不同长度的其它重复片段。共有的22氨基酸顺序为KARENLEEYNETDLAKGKEVTN[Lys-Ala-Arg-Glu-Asn-Leu-Glu-Glu-Tyr-Asn-Glu-Thr-Asp-Leu-Ala-Lys-Gly-Lys-Glu-Val-Thr-Asn]。共有的19个氨基酸顺序为KNKELRNKGSDGLKENAEL[Lys-Asn-Lys-Glu-Leu-Arg-Asn-Lys-Gly-Ser-Asp-Gly-Leu-Lys-Glu-Asn-Ala-Glu-Leu]。共有的11氨基酸顺序为DLKNNDIQNKD[Asp-Leu-Lys-Asn-Asn-Asp-Ile-Gln-Asn-Lys-Asp]。本文也提供和描述了其它与这些氨基酸顺序有同源顺序的蛋白质。尤其感兴趣的是有EEYXE顺序基序｛Glu-Glu-Tyr-Xaa-Glu｝的22体重复单位，这种顺序基序示为酪氨酸激酶的底物。对这种能力的测定已表明所说蛋白质在适宜的条件下可磷酸化。
用核苷酸的置换、核苷酸的缺失、核苷酸的插入以及核苷酸段的转化等方法，可以容易地修饰分离到的PfEMP3 DNA。这些修饰产生了编码其抗原、衍生物或有PfEMP3生物活性的蛋白质的新DNA顺序。这些修饰顺序可以用于制备突变抗原或增强PfEMP3蛋白种类的表达。增强的表达可以包括基因扩增、增加转录、增加翻译和其它机制。这种突变抗原衍生物包括PfEMP3或其片段的预期的或位点特异性突变。本文所用的“突变PfEMP3”包含另外处于上面所说的PfEMP3蛋白质同源性定义中的多肽，所说的多肽无论经过缺失、取代或插入等方法应有不同于自然界中发现的PfEMP3蛋白质顺序的氨基酸顺序。具体地说，“位点特异性突变PfEMP3”包括具有与表3中的蛋白质或其侧翼片段有同源性的蛋白质，并且典型地与所说蛋白质共有多种生物活性。如前所述，所强调的是这些描述意味着包括所有PfEMP3相关蛋白，但并不限制为由该特异性株变异体中分离的特异性抗原。
虽然位点特异性突变位点为预先设定的，但突变体不必是位点特异的。可插入或缺失氨基酸以进行PfEMP3突变。可以通过置换、缺失、插入或其结合应用，产生最终的构建体。插入包括氨基末端或羧基末端融合。随机突变可在靶密码子处进行，并且也按所需的活性筛选已表达的PfEMP3突变体。现有技术已公知在具有已知顺序的DNA中的预设位点进行取代突变的方法，例如用M13引物或用PCR进行的突变。也参见Sambrook等(1989)和Ausubel等(1987和Suppl-ements)。
DNA中的突变正常情况下不应将编码顺序置于读码之外，并且最好不产生能够杂交而形成如环状或发夹状的二级mRNA结构的互补区。
本发明也提供了重组蛋白，例如，用PfEMP3的片段形成的异源性融合蛋白。异源性融合蛋白是在自然情况下不能正常地以同样的方式进行融合的蛋白或片段的融合。因此，免疫球蛋白与受体多肽的融合产物是一具有以典型的肽连接形式融合的顺序的连续蛋白分子，该蛋白分子典型地作为单一的翻译产物生成并且显示出各来源肽的特性。类似的概念也适用于异源核酸顺序。
另外，也可将其它蛋白的相似功能域结合制备新的构建体。例如，抗原结合片段或其它片段可在不同的新融合多肽或片段内“交换”。参见，例如Cunningham等，(1989)Science 2431330-1336;O′Dowd等(1988)J.Biol.Chem.26315985-15992，均引入本文作为参考。因此，赋予蛋白相互作用特异性的区域的功能性连接将形成显示新的特异性结合的新嵌合体多肽。例如，其它相关PfEMP3蛋白的某些抗原特异性可加至或取代所说蛋白的其它片段，从而形成融合，例如PfEMP3与另一种抗原性疟疾蛋白的融合。所形成的蛋白质常常具有杂交的功能和特性，例如，与β-半乳糖苷酶的杂交。
用Beaucage和Carruthers(1981)Tetra.Letts.221859-1862描述的亚磷酰胺法可制备适宜的合成DNA片段。借助在合适条件下合成互补链和退火该链，或借助用DNA聚合酶和适宜引物顺序而互补链的方法，常常获得双链片段。
PfEMP3的“衍生物”包括氨基酸顺序突变体、糖基化变异体和与其它化学部分的共价连接物或聚集连接物。用现有技术中已知的方法，将功能性部分与在PfEMP3氨基酸侧链或其N末端或C末端发现的基因连接，可以制备共价衍生物。这些衍生物可包括但不限于羧基末端或含有羧基侧链的残基的脂族酯或酰胺、含羟基残基的O-酰基衍生物和氨基末端氨基酸或含氨基残基(如赖氨酸或精氨酸)的N-酰基衍生物。酰基选自包括C3-C18正烷基的烷基部分，从而形成各种烷酰基芳酰基。
具体地说，包括糖基化改变，如通过在多肽合成、加工、或进一步处理步骤中，修饰其糖基化模式。因而，所说核酸可在能进行与天然存在该核酸的细胞相比不同的糖基化作用方式的细胞中表达，这种细胞包括在能导致糖基化作用方式改变的生理条件下培养的天然细胞。完成此过程特别优选的方法是将多肽与源于可正常完成此过程细胞的糖基化酶接触，如哺乳动物糖基化酶。去糖基化作用的酶也可应用。还包括已有其它小的修饰，但有同样的一级氨基酸顺序的变异体，这包括磷酸化的氨基酸残基，如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸。
主要的衍生物包括PfEMP3蛋白或其片段与其它蛋白或多肽的共价结合物。这些衍生物可在如N或C末端融合物的重组培养物中合成，或者应用现有技术已知的能通过反应性侧位基团交联蛋白质的物质合成。带有交联物的优选衍生位点在游离氨基、糖类部分和半胱氨酸残基上。
本发明也提供了PfEMP3与其它同源或异源性蛋白质的融合多肽。同源多肽可以是不同疟疾蛋白与PfEMP3间的融合，它产生的杂交蛋白例如可显示出一种抗原的抗原性，但还带有另一种抗原的其它功能域，或者一种显示出修饰了功能或结构特征的蛋白质。同样，异源性融合物可构建成显示出来源蛋白质的特性或功能的结合。已制备PfEMP3的融合蛋白质，如带有谷胱甘肽-S-转移酶或麦芽糖结合蛋白。这样就可以进行细菌表达以及将毫克数量的两种融合蛋白进行简单纯化。其它典型的例子为一种信息多肽(如荧光素酶)与PfEMP3蛋白的片段或结构域(如抗原决定簇的片段)的融合，因而可容易地测出所期望得到的配体的存在或位置。参见Dull et al.U.S.Patent No.4，859，609，引入本文作为参考。其它基因融合配对物包括细菌β-半乳糖苷酶、trpE、蛋白A、β-内酰胺酶、α-淀粉酶、乙醇脱氢酶和酵母α-接合因子。参见Godowski等(1988)Scienee 241812-816。
Beaucage和Carruthers(1981)Tetra.Letts.221859-1862描述的亚磷酰胺法可以制备适宜的合成DNA片段以表达修饰后的蛋白。借助在合适条件下合成互补链和退火该链或借助用DNA聚合酶和适宜的引物顺序而加入互补链的方法，常常可获得双链片段。
这样的多肽也可用经过化学修饰的氨基酸残基，所进行的修饰包括磷酸化、磺化、生物素化或加上或去除其它部分，尤其是具有与磷酸基相似分子形状的部分。在某些实施方案中，修饰作用在标记试剂，或用作纯化靶物质(如亲和配体)等方面有用。
融合蛋白质一般由重组核酸法或合成多肽法制备。核酸操作和表达的技术在例如Sambrook等(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual第二版第1-3卷(Cold Spring Harbor Labor-atory)的文献中进行总的描述，该文献引入本文作参考。合成多肽的技术已由如Merrifield(1963)J.Amer.Chem.Soc.852149-2156;Merrifield(1986)Science 232341-347;以及Atherton等(1989)Solid Phase Peptide SynthesisA Practical Approach，IRL Press，Oxford等进行了描述，这些文献均引入本文作参考。
本发明也研究了以不涉及氨基酸顺序或糖基化作用的变异为特征的PfEMP3蛋白衍生物的应用。这种衍生物可涉及与化学部分共价或聚集相联。这些衍生物包括三种普通类别中的物质(1)盐;(2)侧链或末端氨基酸残基的共价修饰物;(3)吸附复合体，如与细胞膜的复合体。这种共价或聚集衍生物可用作免疫原、免疫测定中的试剂或者用于如PfEMP3蛋白或其它衍生蛋白亲和纯化的纯化方法中。例如，PfEMP3蛋白可以借助于以现有技术中已知的方法共价结合于固相支持物(如溴化氰活化的琼脂糖)，或吸附于用或未用戊二醛交联的聚烯表面，从而使其固定化，用于进行抗PfEMP3抗体或与此相关蛋白的测定或纯化。PfEMP3蛋白也可用可检测的基团标记，例如用氯胺T法进行放射碘标，也可与稀土螯合物共价结合，或结合于另一荧光部分以用于诊断测定。
本发明蛋白的溶解形式可用作制备对蛋白或其片段有特异性的抗血清或抗体的免疫原。纯化的蛋白可用于筛选用免疫法制备的单克隆抗体或抗原结合的片段，该免疫法是用含有免疫原的不同形式的不纯制备物进行的。具体地说，术语“抗体”也包括天然抗体的抗原结合片段。纯化的受体也可用作检测针对寄生虫蛋白而产生的所有抗体的试剂。另外，PfEMP3蛋白片段也可作为免疫原制备本发明的抗体，下面将对此进行描述。例如，本发明研究了对表3所示氨基酸顺序或其侧翼顺序或其片段有结合亲和性或由其诱发的抗体。具体地说，本发明研究了可结合至可能位于磷脂双层外面的特异性片段的抗体，尤其是针对细胞外片段的抗体，或者是由所说片段诱发的抗体。其它PfEMP3蛋白质的类似区也将得到应用。
编码PfEMP3蛋白质或其片段的DNA可以用化学合成法、筛选cDNA文库或筛选由多种细胞系或组织样本制备的基因组文库而获得。
这种DNA能在广泛的宿主细胞内表达以合成全长蛋白质或片段，而这种蛋白质或片段又可用于制备多克隆或单克隆抗体;用于结合研究;用于修饰的PfEMP3相关分子的构建和表达;以及用于结构/功能研究。每种蛋白或其片段均能在用合适表达载体转化或转染的宿主细胞内表达。这些分子除了来源于重组宿主的分子外基本上可不含蛋白质或细胞污染物，并因此在与可药用的载体和/或稀释剂结合应用时，在形成的药物组合物中特别有用。PfEMP3蛋白或其部分可以以与其它蛋白融合的形式表达。
表达载体一般是含有所需PfEMP3基因或其片段的自我复制DNA或RNA构建体，这种PfEMP3基因或片段通常是被人工操作连接至可在适宜的宿主细胞中被识别的适宜基因调控成分。这些调控成分能够影响在适宜宿主内的表达。影响表达所必需的调控成分的特殊类型依赖于实际所用的宿主细胞。一般地，基因调控成分可包括原核启动子系统或真核启动子表达调控系统，一般包括转录启动子、控制转录起始的理想操纵子、提高mRNA表达水平的转录增强子、编码适宜核糖体结合位点的顺序以及中止转录和翻译的顺序。表达载体也通常含有使载体独立于宿主细胞进行复制的复制起点。
本发明的载体包括编码PfEMP3样蛋白或肽或其片段(如编码生物活性多肽)的DNA。DNA能在病毒启动子的控制之下并能编码选择性标记。本发明进一步研究了能在原核或真核宿主中表达编码受体的真核cDNA的表达载体的应用，这里所说的载体与宿主相容，并且编码PfEMP3的真核cDNA插入到载体中使含有载体的宿主的生长能表达该cDNA。通常，表达载体设计为能在其宿主细胞内进行稳定复制或扩增以大大增加每个细胞内所需基因的拷贝总数。并不总是必须使表达载体在宿主细胞内复制，例如，有可能利用不含被宿主细胞识别的复制起点的载体影响不同宿主中蛋白或其片段的短暂表达。也有可能应用通过重组使编码PfEMP3或其片段的DNA整合人宿主DNA中的载体。
本文所用的术语“载体”包括质粒、病毒、噬菌体、可整合的DNA片段以及其它能使DNA片段整合人宿主基因组的载体。表达载体是含有能影响操作连接上的基因表达的基因调控成分的特殊载体。质粒是最常用的载体形式，但所有具有同样功能并在现有技术中早已了解或成为已知的其它形式的载体均适于在本发明中应用。参见，例如Pouwels等(1985和Supplements)Cloning VectorA Labo-ratory Manual，Elsevier，N.Y.;和Rodriquez等编VectorsA Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses，Butter-sworth，Boston，1988，均引入本文作参考。
转化细胞已被用重组DNA技术构建的受体载体转化或转染。转化的宿主细胞(优选哺乳动物细胞)通常表达所需蛋白或其片段;然而，在用于克隆、扩增和操作转染DNA的目的时，它们不必表达蛋白。本发明进一步研究了在营养培养基中培养转化细胞，因而使得PfEMP3在培养物中聚集。PfEMP3能作为抗原从培养物中或从培养基中加以回收。
鉴于本发明的目的，当DNA顺序在功能上互相相关时，将它们以可操作方式连接起来。例如，如果当编码前顺序或分泌前导顺序的DNA表达为前蛋白或参与引导一条多肽至细胞膜或多肽分泌的参与物时，则可将该DNA以可操作方式与编码多肽的DNA连接。如果某个启动子调控多肽的转录，则将该启动子与一个编码顺序以可操作方式连接;如果一个核糖体结合位点的定位允许进行翻译，则将该核糖体结合位点与一个编码顺序以可操作方式连接。通常，“以可操作方式连接”指邻近的和在读码内的连接;然而，某些基因成分如阻遏基因并不是邻近连接，但仍结合至本身控制表达的操纵顺序上。
适宜的宿主细胞包括原核细胞、低等真核细胞和高等真核细胞。原核细胞包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细胞，例如大肠杆菌和枯草杆菌。低等真核细胞包括酵母菌，例如啤酒酵母、和毕赤氏酵母以及网柄粘菌属的酵母种。高等真核细胞包括由动物细胞建立的组织培养细胞系，这些细胞既有非哺乳动物来源的，如昆虫细胞和鸟类，也有哺乳动物来源的，如人类、灵长类和啮齿类。
原核宿主载体系统包括针对许多不同种属的多种载体。如本文中所用的，大肠杆菌及其载体一般用于举例说明其它原核细胞和可在原核细胞中应用的等同载体。用于扩增DNA的代表性载体是pBR332或其多种衍生物。可用于表达受体或其片段的载体包括但不限于如含有Lac启动子(pUC系列)、trp启动子(pBR322-trp)、Ipp启动子(pIN系列)、λ-pP或pR启动子(pOTS)、或如ptac(pDR540)的杂交启动子的载体。参见Brosius等(1988)“Expression Vectors Employing Lambda-，trp-，lac-，and Ipp-derived Promoters”，in VectorsA Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses，(Rodriguez和Denhardt编)，Buttersworth，Boston，第10章第205-236页，引入本文作参考。
低等真核细胞例如酵母和网柄粘菌属，可以用编码的PfEMP3的载体转化。鉴于本发明的目的，最常用的低等真核细胞宿主为啤酒酵母。它一般用于代表低等真核细胞，尽管也有许多其它的菌株和种可以应用。酵母载体一般包括复制起点(除非载体为整合型)、选择基因、启动子、编码受体或其片段的DNA以及终止翻译、多聚腺苷酸化和终止转录的顺序。酵母的适宜表达载体包括象3-磷酸甘油酸激酶和各种其它糖酵解酶基因启动子这样的组成启动子，或象乙醇脱氢酶-2启动子或金属硫堇启动子这样的可诱导启动子。适宜的载体包括下述类型的衍生物自我复制低拷贝数(如YRp系列)自我复制高拷贝数(如YEp系列)、整合型(如YIp系列)或微染色体(mini-chromosomes)(如YCp系列)。
高等真核组织培养细胞可以是用于表达有生物功能PfEMP3蛋白的优选宿主细胞。原则上，任何高等真核组织培养细胞系均可应用(例如昆虫棒状病毒表达系统)，无论来源于无脊椎动物还是脊椎动物。然而优选的是哺乳动物细胞。这种细胞的转化或转染和增殖已成为常规步骤。有用的细胞系的例子包括Hela细胞、中国仓鼠卵巢细胞系、幼年大鼠肾细胞系、昆虫细胞系、鸟细胞系和猴细胞系。用于这些细胞系的表达载体包括复制起点、启动子、翻译起始位点、RNA拼接位点(如果应用了基因组DNA)、多聚腺苷酸化位点和翻译终止位点。这些载体也通常含有选择基因或扩增基因。适宜的表达载体可以是质粒、病毒或携带启动子的逆转录病毒，该启动子来自如腺病毒、SV40、微小病毒、牛痘病毒或细胞肥大病毒等。适宜的表达载体的代表性例子包括pCDNA1;pCD(参见Okayama等(1985)Mol.Cell Biol.51136-1142;pMClneo Poly-A(参见Thomas等(1987)Cell 51503-512;如pAC373或pAC610的棒状病毒载体。
常常希望在能提供特异的或确定的糖基化模式的系统中表达PfEMP3。在这种情况下，通常的模式自然由表达系统提供的模式。然而，该模式可通过将例如非糖基化形式的多肽与导入异源性表达系统中的适宜糖基化或去糖基化酶接触予以修饰。例如，可以用一种或多种编码哺乳动物的或其它的糖基化酶的基因共同转化所说基因。利用这种新方法，能够在原核细胞或其它细胞中获得某些哺乳动物的糖基化模式。
Ⅳ.抗体结合蛋白质可以获得针对天然存在形式或重组形式的不同PfEMP3蛋白及其片段的抗体。另外，也可获得针对活性形式或非活性形式的PfEMP3的抗体，其差别在于针对活性形式的抗体更可能识别仅以天然构象存在的抗原决定簇。本发明也对抗个体基因型抗体进行了研究。
通过带有免疫原蛋白的片段结合物对动物进行免疫，可以获得包括结合片段和单链形式的抗PfEMP3蛋白预定片段的抗体。由分泌所需抗体的细胞制备单克隆抗体。筛选出与正常或有缺陷的PfEMP3(如天然的或变性的PfEMP3)结合的抗体，或者筛出阻断功能活性的抗体。这些单克隆抗体通常以至少约100μM的KD结合，更通常至少约30μM，典型地至少约1μM，更典型地至少约300 nM，优选至少约100 nM，更优选至少约10 nM，或更好。虽然前面强调了PfEMP3，但也可获得针对其它PfEMP3品系变异体或相关蛋白的抗体。
包括抗原结合片段在内的本发明的抗体具有显著的诊断和治疗价值。它们是结合至PfEMP3蛋白并抑制其它蛋白结合的强效拮抗剂，从而抑制了球状物发挥生物功能的能力。它们也可用作非中和抗体并能与毒素或放射性核素偶联，以便在抗体结合至细胞受体上时杀死细胞。进一步说，这些抗体可通过连接物直接或间接结合至药物或其它治疗剂上。
本发明的抗体在诊断应用中也有用。作为俘获或中和抗体，它们可结合至PE上，抑制或不抑制内皮细胞结合。作为中和抗体，它们也可用于竞争性结合测定。它们也可作为诊断试剂用于检测或定量PfEMP3蛋白。
PfEMP3蛋白片段也可与其它物质结合，尤其是多肽，如用作免疫原的融合或共价结合的多肽。PfEMP3蛋白及其片段可以融合或共价结合至许多免疫原上，如锁眼
血蓝蛋白、牛血清白蛋白、破伤风类毒素等。参见Microbiology，Hoeber Medical Division，Harper and Row，1969，Landsteiner(1962)Specificity of Serological Reactions，Dover Publications，New York，和Williams et al.(1967)Methods in Immunology and Immunoch-emistry，Vol.1，Academic Press，New York，均引入本文作参考，以便描述制备多克隆抗血清的方法。典型的方法包括用抗原对动物进行的超免疫。然后在重复免疫后不久收集动物血液，并分离γ球蛋白。
有时需要从许多哺乳动物宿主制备单克隆抗体，这些动物如小鼠、啮齿类、灵长类、人类等。描述制备这些单克隆抗体的方法见于如Stites et al.(eds)Basic and Clinical Immunology(4thed.)，Lange Medical Publications，Los Altos，CA，及其引用的文献;Harlow and Lane(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，CSH Press，Goding(1986)Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice(第2版)Academic Press，New York;尤其是Kohler和Milstein(1975)刊登于Nature 256495-497的文章，他们讨论了制备单克隆抗体的一种方法。上述文献均引人本文作参考。概括地说，该方法包括以免疫原注射动物，然后处死动物并从其脾脏中取出细胞，将细胞与骨髓瘤细胞融合。结果产生了能够在体外增殖的杂交细胞或“杂交瘤”。选择性培养基能阻止亲本骨髓瘤细胞存活。对杂交瘤细胞群体进行筛选以分离单一克隆，每一种克隆分泌针对免疫原的单一种类的抗体。按照这种方法，所获得的独特的抗体种类是源于免疫动物不死的和克隆化的单一B细胞对所识别的免疫原上的特异位点发生应答的产物。
其它合适的技术包括在体外将淋巴细胞暴露给抗原性多肽或者另外暴露给噬菌体或相似载体中的抗体文库的选出物。参见Huse等(1989)“Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda”，Science 2461275-1281;Ward等(1989)Nature 341544-546;文献均引入本文作参考。本发明的多肽和抗体可以用或不用包括嵌合体或人化的抗体进行修饰而加以应用。常常，通过以共价或非共价形式连接提供可检测信号的物质来标记多肽和抗体。已经知道多种标记和连接技术，并且这些技术在科学和专利文献中已被广泛地予以报告。适宜的标记物包括放射性核素、酶、底物、辅助因子、抑制剂、荧光组成部分、化学发光部分、磁微粒等。有关这些标记物应用的专利包括美国专利3，817，837;美国专利3，850，752;美国专利3，939，350;美国专利3，996，345;美国专利4，277，437;美国专利4，275，149和美国专利4，366，241。而且，也可制备重组免疫球蛋白;参见Cabilly，美国专利4，816，567。所有这些专利引人本文作参考。
本发明的抗体也可用于分离蛋白的亲和层析。将层析柱制成含有连接于固相支持物(如琼脂糖、交联葡聚糖等颗粒)上的抗体;将细胞溶胞产物过柱，洗涤层析柱，然后用弱变性剂以逐渐增加的浓度过柱，洗脱纯化蛋白。
抗体还可用于筛选特定表达产物的表达文库。通常在这一步骤中应用的抗体通过抗体结合方式标记有可容易测出抗原存在的部分。
所获得的针对每一种受体的抗体也用于获取抗个体基因型抗体。它们将用于检测或诊断有关各个PfEMP3表达的各种免疫条件。
Ⅴ.诊断应用本发明也提供了诊断宿主的疟疾状态的组合物和方法。具体地说，它可以确定恶性疟或相似感染的定性和定量状态。
定性诊断建立于对DNA顺序蛋白表达、或对免疫应答(如抗体)等这些感染的特征的检测之上。定量诊断可以利用所说的所有方法。进一步说，蛋白的表达一般反映感染的状态并可以很好地、更迅速地指示同时发生的感染的发展情况。个体的免疫史可由可溶性或细胞性免疫产物的滴定度和记忆成分测出。
DNA诊断可用合适的探针进行，如选自表3或其相关侧翼顺序的适宜长度的顺序。聚合酶链反应(PCR)技术可用于扩增信号。编码PfEMP3或相关蛋白的核酸的出现应为感染的诊断指标，而定量测定将提供感染过程的更多的信息。
疟疾蛋白产物的出现是感染的诊断指标，并且常反映宿主感染的状态。蛋白的定性或定量测定正常地是通过标记技术而完成。这些测定可以通过抗体样特异性结合试剂、或通过分离和培养源自宿主的存活疟原虫而进行的。也可以进行对疟原虫核酸的相似诊断性检测。
用标准技术可以对抗体或免疫系统进行评价。用标准免疫测定技术可以计算出抗体对PfEMP3抗原决定簇的滴度。用适宜的标定和标记技术可以进行细胞反应的估评。相似的方法可用于测定疟原虫或PE的存在。
Ⅵ.试剂盒本发明也研究了PfEMP3蛋白、其片段、肽以及它们的融合产物在多种诊断试剂盒中的应用，以及检测蛋白或蛋白的抗体存在的方法。典型的试剂盒容有已定义的PfEMP3肽或基因片段或可识别肽或基因片段的试剂。
测定样本中如PfEMP3蛋白浓度的优选试剂盒典型地包括标记化合物(如已知对抗原有结合亲和性的抗体)、一种PfEMP3(天然产生或重组的，作为阳性对照)以及将结合物从游离的标记化合物中分离出来的方法，例如用固相物质阻止PfEMP3迁移。含有试剂的试剂盒和说明书将正常地予以提供。
针对PfEMP3或片段的特异性抗体(包括抗原结合片段)在检测PfEMP3蛋白和/或其片段的存在或对其定量的诊断应用方面非常有用。这种诊断测定可以利用溶胞产物、活细胞、固定的细胞、免疫荧光、细胞培养物、体液，并且进一步可以包括检测相关于血清中抗原的抗原。诊断测定可以是同源性的(在游离的试剂和抗原抗体复合物之间无分离步骤)，或是异源性的(有分离步骤)。有多种商用测定方法，如放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、酶扩增免疫测定技术(EMIT)、底物标记荧光免疫测定(SLFIA)等。例如，借助进行了标记和能识别针对PfEMP3蛋白或其特定片段的抗体的第二抗体的使用，便可以应用未标记的抗体。这些测定法已在文献中广泛地进行了讨论。参见，如Harlow和Lane(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，CSH Press，Cold Spring Harbor，New York;Coligan等(1991和periodicsupplements)Current Protocols in Immunology。
抗个体基因型抗体在诊断针对PfEMP3蛋白的抗体存在方面可能有相似的用途，因为这种抗体可能对包括早先接触在内的各种状态具有诊断意义。
试剂盒中也可使用检测寄生虫感染所特有的核酸成分的试剂。多种探针或引物可以引入试剂盒。
在试剂盒中经常提供诊断性测定所用的试剂，以便获得最优的检测灵敏度、操作简便性或可重复性。对于本发明而言，依赖于测定方法的本质、测定程序和标记物而提供标记或未标记的抗体、或标记的抗原以及其它物质，尤其是这样一些试剂如缓冲剂、稳定剂以及产生信号所必需的物质，如酶的底物等。试剂盒最好还包括有关正确使用试剂盒以及使用后内容物处置问题的说明书。试剂盒一般有盛放每种有用试剂的隔间。所希望的是，每种试剂以冻干的干粉形式提供，以便进行测定时能在水性介质中重配成适宜浓度。
前面所提到的诊断性测定中的任何一种成分均可不经修饰加以应用，也可以多种方式进行修饰。例如，可以共价或非共价结合一个直接或间接提供可检测信号的部分而实现标记。在任何一种测定中，可以直接或间接地标记抗体、试验化合物、抗原或针对抗原的抗体。直接标记的可能性包括标记基团放射标记物(如125I)、酶(美国专利3，645，090)如过氧化物酶和碱性磷酸酶、以及荧光标记物(美国专利3，940，475)，这种荧光标记物能监视荧光强度、波长漂移或荧光极化的改变。这两篇专利都引入本文作为参考。间接标记的可能性包括对一种成分生物素化，继而结合至与上述标记基团之一偶联的抗生物素蛋白上。
也有多种方法将结合物与游离配体、或将结合物与游离的试验化合物分离。受体能固定于各种基质上，然后对其进行洗涤。适宜的基质包括塑料，如ELISA板、过滤器和小珠。使受体在基质上固定的方法包括但不限于直接粘附于塑料上以及使用俘获抗体、化学偶联剂和生物素-抗生物素蛋白。这种方法的最后一步涉及借助包括使用例如有机溶剂(如聚乙二醇)或盐(如硫酸铵)的方法在内的几种方法中的任何一种来沉淀抗体-抗原复合物。其它适宜的分离技术包括但不限于由Rattle等人(1984)Clin.Chem.30(9)1457-1461描述的荧光素抗体可磁化粒子法以及在美国专利4，659，678中描述的双抗体磁性粒子分离法，两篇文献均引入本文作参考。
将PfEMP3蛋白或其片段与多种标记物连接的方法已在文献中广泛地进行了报道，在此不需对应用于PfEMP3的情况作详细讨论。许多这类技术需要活化的羧基(通过应用碳化二亚胺或活化酯)以形成肽键、活化的卤素取代基(如氯乙酰基中的)以通过与巯基反应生成硫醚、或活化的双键(如马来酰亚胺中的)用于连接等等。融合蛋白在这些应用中也会有用。
本发明的另一诊断方面涉及应用从编码PfEMP3蛋白的DNA顺序中得到的寡核苷酸或多聚核苷酸顺序。这些顺序可用作检测可能有疟疾感染病人体内PfEMP3蛋白水平的探针。RNA和DNA核苷酸顺序的制备、顺序的标记以及顺序的优选大小已在文献中进行了大量描述和讨论。通常，寡核苷酸探针应至少有约14个核苷酸，通常至少有约18个核苷酸，而且多核苷酸探针可多至数千个碱基。可以采用多种标记物，最常用的是放射性核素，特别是32P。然而，也可应用其它技术，如用生物素修饰核苷酸以导入多核苷酸。生物素然后成为结合抗生物素蛋白或抗体的位点，抗生物素蛋白或抗体可用多种标记物标记，如放射性核素、荧光物质(fluorescers)、酶等。另外可以应用能识别特异性双链体的抗体，所说双链体包括DNA双链体、RNA双链体、DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白双链体。抗体本身也可被标记并进行测定，在测定中双链体结合至表面，这样，双链体在表面形成后就可检测结合在双链体上的抗体。对新的反义RNA的探针的应用可以以任何常规技术完成，如核酸杂交、加减筛选、重组探测、杂交释放翻译(HRT)和受杂交抑制的翻译(HART)。这也包括扩增技术如聚合酶链反应(PCR)。
本发明还研究了也能对其它标记物的存在进行定性和定量检测的诊断试剂盒。诊断或预后可能依赖于对用作标记物的多种指示作用的综合考虑。因此，试剂盒可以检测标记物的组合。参见，例如，Viallet等(1989)Progress in Growth Factor Res.189-97。
Ⅶ.治疗应用本发明提供了具有显著治疗价值的试剂。PfEMP3蛋白值(天然存在的或重组的)及其片段和其抗体，与鉴定为对它们有结合亲和性的化合物一起在治疗疟疾感染或预防应用方面(如疫苗)有用。参见Cohen(1993)Scienee 2591691-1692;Ulmer等(1993)Science 2591745-1749，这两篇文献也提供了通过细胞转化作用进行接种。
重组PfEMP3本身或PfEMP3抗体可被纯化，然后应用于病人。这些试剂可与例如存在于常规可药用载体或稀释剂中的另外的活性成分以及生理上无害的稳定剂和赋形剂结合进行治疗应用。这种结合物可过滤除菌并制成剂型，如在剂量小瓶中冻干，或以稳定的水性制剂中贮存。本发明也研究了不能结合补体的抗体或其结合片段的应用。特别是也研究了其它抗疟药物与本发明组合物的联合应用。
用PfEMP3蛋白或其片段可进行药物筛选，以鉴定出与该蛋白有结合亲和性从而潜在地阻碍球状物功能的化合物。本发明进一步研究了PfEMP3蛋白片段在阻断内皮细胞结合位点方面的治疗用途。
进行有效治疗所必需的试剂用量依赖于许多不同因素，包括服药方法、靶部位、病人的生理状态和服用的其它药物。因此，治疗剂量应通过滴定确定以保证最为安全和有效。典型地，体外用的剂量为确定原位应用这些试剂的剂量提供了有用的指导。用于治疗特定疾病的有效剂量的动物试验可进一步提供人用剂量的推测量。已有人描述了多种推算方法，例如，Gilman等编(1990)Goodman和Gilman′sThe Pharmacological Bases of Therapeutics，第8版，Pergamon Press;及Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版，(1990)，Mack Publishing Co.，Easton，Penn.;每篇文献均引入本文作参考。在这里和下面讨论了给药的不同方法，例如口服、静脉内、腹腔内或肌肉内给药，透皮弥散和其它给药方式。可药用的载体包括水、盐水、缓冲液和例如在Merck Index，Merck & Co.，Rahway，New Jersey和Kaplan等人(1984)Clinical ChemistryTheory，Analysis and Correlation.C.V.Mosby Co.，St.Louis中描述的其它化合物，这些文献引入本文作参考。也参见Avis等人(1992)Pharmaceutical Dosage FormsParenteral Dosage Forms(第2版)第1-3卷，Dekker，N.Y.;Lieberman等人(1990)Pharmaceutical Dosage FormsDisperse Systems第1-3卷，Dekker，N.Y.;Lieberman等人(1990)Pharmaceutical Dosage FormsTablets(第2版)第1-3卷Dekker，N.Y.。一般所希望的剂量范围的数量应少于100 mM的浓度，典型地少于约10 mM，通常少于约100μM，优选少于约100 mM，最优选少于约1 pM，并带有合适的载体。缓释制剂或缓释装置也常用于持续给药。
PfEMP3蛋白、其片段和针对蛋白或其片段的抗体可直接给药于需治疗的宿主，或者依赖于化合物的大小，在用药前合乎需要地将其与如卵清蛋白或血清白蛋白的载体蛋白混合。治疗制剂可以以任何常规剂量制剂服用。鉴于活性成分可以单独服用，优选将活性成分制成药物制剂。制剂包括至少一种上述的活性成分，还有一种或多种其可接受的载体。每种载体从与其它成分相容的意义上讲必须是在药物和生理上可以接受的，并且不对病人造成损害。制剂包括适于口服、直肠、鼻腔或肠胃外(包括皮下、肌肉、静脉内和皮内)用药的制剂。制剂可方便地制成单位剂型，并可以以任何药物学领域熟知的技术制备。参见，如Gilman等人编(1990)Goodman和GilmanThe Pharmacological Bases of Therapeutics，第8版，Pergamon Press;Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版(1990)，Mack Publishing Co.，Easton，Penn.;文献均引入本文作参考。本发明的蛋白和抗体可与其它化疗剂或化学预防剂结合或一起使用。
PfEMP3蛋白和其片段或类似物可用作作为疫苗或进行治疗性或预防性抗体治疗的基础。疫苗可包括PfEMP3的全部或部分顺序，PfEMP3可作为融合蛋白或以其它形式与其它疟疾蛋白联合应用。参见，如Spriggs等人编(1991)Topics in Vaccine Adjuvant Research，CRC Press;Cryz(1990)Vaccines and Immunothera-py;Pergamon Press，New York;和Plotkin等人(1988)Vaccines，Saunders，Philadelphia，PA;均引入本文作参考。
另外，可以发展或鉴定出破坏细胞骨架或PfEMP3与其它蛋白的其它联系的多种化合物。这些化合物可干扰疟疾蛋白，尤其是PfEMP3蛋白本身的细胞粘附或交换途径，或者可以影响膜的完整或膜的特性以致干扰了疟原虫正常感染或成熟过程。抗体分子是这些化合物的基本候选对象。
实施例下面的实施例用于说明本发明。载体和宿主的选择、试剂的浓度、温度和其它可变因素的值仅仅是为了举例说明本发明的应用而不能被认为是对本发明进行限制。下面的实验在优先权申请日后已在公开出版物上进行了描述;参见Handunnetti等人(1992)Molecular and Biochemical Parasitology 54231-246;和Pasloske等人(1993)Molecular and Biochemical Parasitolo-gy 5959-72。
实施例1所获得的针对大分子PE表面蛋白的单克隆抗体表现出两种类型的Western吸印反应性抗体和蛋白质 小鼠IgG MAb 8B7.4以腹水形式应用;参见Howard等人(1987)J.Cell.Biol.1041269-1280。由斯德哥尔摩的Dr.K.Berzins慷慨地提供人IgM MAb 33G2，其形式为0.5μg/ml的纯化MAb，并以4μg/ml用于Western吸印;参见，Mattei等人(1989)Parasite Immunol.1115-30;和Udomsangpetch等人(1989)J.Immunol.1423620-3626。由克隆IR202腹水中纯化的对照大鼠IgM骨髓瘤蛋白来自Zymed Laboratories，South San Fran-cisco，CA(Catalog no.02-9800)。人血红蛋白获自Sigma Chem-ical Co，St.Louis，MO(Catalog no.H7379)。
寄生虫培养和纯化 实验采用2种培养基适应型疟原虫进行，它们是Malayan Camp系(MC)和FCR-3克隆C-5;参见Degowin等人(1965)Am.J.Trop.Med.Hyg.14519-528;和Green等人(1985)Am.J.Trop.Med.Hyg.3424-30。
体外培养的方法，以疟原虫表型的维持选择方案以及Malayan Camp株恶性疟原虫的同时发生的情况由Handunnetti等人(1992)Am.J.Trop.Med.Hyg.46371-381进行了描述。这些疟原虫为球形物阳性(K+)、C32黑色素瘤细胞、CD36和thrombospondin(TSP)粘附阳性以及玫瑰花结阳性(＞80%)的成熟无性繁殖期PE带有2个以上的形成玫瑰花结的E);参见Handunnetti等人(1992)Am.J.Trop.Med.Hyg.，和Handunnetti等人(1990)PP.249-265 in Cellular and Molecular Biology of Normal and Abnormal Erythroid Membranes，A.R.Liss，lnc。在纯化PE前，用溶于PBS的100单位/ml肝素(Sigma Chemical Co.)于37℃洗涤血液15分钟，经过这种处理以破散玫瑰花结。通过在Percoll/山梨醇梯度上离心或于37℃在溶于RPMI 1640 的 0.7%w/v明胶(Sigma Chemical Co，约300布鲁姆)中进行单位重力沉淀，纯化成熟滋养体期PE至少有大于85%的细胞含有疟原虫。
FCR-3克隆C5在含有RPMI 1640、2 mM谷胱甘肽、24 mM NaHCO3、25 mM HEPES、0.44mM次黄嘌呤、21.1 mM葡萄糖、66mg/ml庆大霉素和10%v/v人血清的培养基中生长。这种疟原虫为球形物阳性、粘附于表达CD36的CHO细胞并无可检测的玫瑰花结。用明胶法每4-5天筛选球形物阳性PE一次。为获得高度同步的FCR-3培养物，在1%w/v明胶上分离PE以富集成熟K+PE。在培养10-12小时后，其中在3小时的疟原虫再感染，用5%w/v山梨醇处理PE，并且将所获得的环状期疟原虫培养至裂殖体期。这些PE以25%的红细胞压积装入65% Percoll等级中并以2200 rpm离心10分钟;将富含裂殖体PE的上层带用3倍RPMI洗涤并培养以进行再感染。在感染开始的3小时内，反复用5%w/v山梨醇处理以清除任何残存的裂殖体。通过这些环状期PE的培养获得同步产生的成熟PE。
寄生虫生长动力学 PE在滋养体期的生长是同步的。将这些PE与溶于RPMI 1640的100μg/ml胰蛋白酶(Sigma Chemical Co，Catalog no.T9395)于37℃孵育45分钟以破坏玫瑰花结。加入胎牛血清至10%v/v并且用RPMI洗涤疟原虫。用明胶纯化PE，以RPMI1640洗涤PE，并将PE加回至有6%的细胞含疟原虫的培养物中。经过再感染，12%细胞含疟原虫。加入新鲜培养基并在感染后的6、18、27、35和41小时时取等份试样。
去污剂提取依次用1 ml的溶于PBS的1% Triton X-100和1 ml的溶于PBS的2% SDS 提取5×108PE 以进行免疫吸印或免疫沉淀实验。
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳按照Laemmli的使用Mini Protean Ⅱ Electrophoresis Cell(Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA)的方法，在还原条件下通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白。表现Mr用在同一凝胶上进行电泳的预先染色标准品(肌球蛋白，205KD;β-半乳糖苷酶，116.5KD;磷酸化酶B，106KD;牛血清白蛋白，80KD;卵清蛋白，49.5KD;碳酸酐酶，32.5KD;大豆胰蛋白酶抑制剂，27.5KD(Bio-Rad Laboratories))制成的标准曲线推算获得。
单克隆抗体的同型测定 ELISA板用溶于PBS的超声处理的PE提取物(5×107PE/ml)包被，置于4℃下过夜，用溶于PBS的1%BSA(不含球蛋白，Sigma Chemical Co，Catalog no.A7638)于22℃封闭1小时，并用PBST(含0.05%吐温20的PBS)洗涤。将单克隆上清液在小孔内于22℃孵育45分钟。将小孔以PBST洗涤并且用大鼠Mono-ID/SP试剂盒(Zymed Laboratorieslnc.，South San Francisco，CA)测定其同型。纯化大鼠黑色素瘤标准品板(Zymed，Catalog no.90-9551)用作对照。
大鼠单克隆抗体制备用准备好的5% SDS-PAGE对纯化的滋养体/裂殖体期PE的2% SDS 提取物进行分离。将凝胶用考马斯亮蓝染色。将凝胶上端与红细胞膜内蛋白1.1条带之间的区域切成1-2mm的7个薄片，用蛋白染色方式保证各薄片本身含有同样的蛋白带。各薄片用PBS分别制成均浆。将不同的蛋白带在弗氏完全佐剂中乳化，然后通过腹腔注射对雄性Lewis大鼠进行免疫。在第41天用弗氏不完全佐剂(FIA)对动物再次免疫。每次免疫均含有从2×108PE中提取的等量蛋白。在第二次免疫后，收集8天的抗血清。一只大鼠在第150天进行第三次免疫。四天后将动物的脾脏细胞与鼠细胞系P3-X63-Ag8.653融合以产生杂交瘤细胞系;参见Abrams等人(1988)J.Immunol.140131-137。在融合后第14天测定杂交瘤上清液与PE提取物的反应性。用超声处理的E或滋养体/裂殖体PE制备物包被于聚氯乙烯微滴定板(Dynatech，Chantilly，VA)之上(2×106细胞/孔)，在碳酸盐缓冲液(15 mM Na2CO3，35 mM NaHCO3，0.02% NaN3，pH 9.6)中4℃过夜。滴定板用PBST冲洗，用溶于PBS的1% BSA于22℃封闭1小时，然后向小孔中加入杂交瘤上清液(以PBST 13稀释)或溶于PBST的大鼠血清稀释液，在4℃下保存4小时。滴定板用PBST冲洗，然后与结合有溶于含0.1% BSA的PBST中的11000羊抗鼠IgG(整个分子)(Cappel/Organon Teknika)的碱性磷酸酶于23℃保温1小时。冲洗滴定板并用含4-磷酸硝基苯的ELISA碱性磷酸酶底物试剂盒(Bio-Rad Laboratories，Catalog no.172-1063)处理滴定板。加入10 mM EDTA停止反应，测定在450 nm处的吸收度。杂交瘤细胞产生的上清液与PE提取物反应可以产生大于或等于2倍的与E提取物反应的吸收度，将这种杂交瘤细胞分散并再进行筛选。将按此标准仍然表现为阳性的细胞分散至24孔板上并用胎牛血清(JR Scientific，Woodland，CA)和10% DMSO(Sigma Chemical Co.)冻存。筛选出的杂合子通过有限稀释法克隆两次。杂交瘤克隆41E11和12C11通过连续适应在RPMI/FCS和HB101混合物中生长从而适应在HB101无血清基质(Irvine Scientific)中生长。通过以1000×g的离心和用0.2μm膜的过滤，收集这些克隆的培养上清液，用PBS或RPMI透析这些培养上清液的浓缩样本并使样本分别含有1.5mg/ml的MAb 41E11和2.0mg/ml的MAb 12C11。其总蛋白含量约为1%。
实施例2MAb显示两种Western吸印反应模式。
聚丙烯酰胺凝胶上的放射性分析干燥含有125I标记的或生物合成标记的疟疾蛋白凝胶，并借助适用的Amplify(Amersham，Arlington Heights，IL)通过放射自显影法或荧光法分析放射性的分布。
从制备性凝胶上切下7个1-2mm的大分子蛋白质区段，应注意每一个主要的染色带要仅在一个凝胶段上。将每组切片匀浆，先用弗氏完全佐剂，再用弗氏不完全佐剂注射给两只Lewis大鼠。在两次免疫后，测定血清在ELISA上与PE抗原的总超声处理物的反应性、血清凝集未经固定的未受损的PE的能力以及PE玫瑰花结破散的情况。ELISA测定只有7组动物中的两组(组A和组B)中的每只动物的血清才有反应。组B中两只大鼠的血清破散玫瑰花结达30-33%并凝集未受损PE。无任何免疫前血清具有反应性。将这些动物(B2)中的一只的脾脏与P3-X633-Ag8.653鼠细胞系融合以制备杂交瘤。由ELISA测定九种不同的杂交瘤上清液与总PE超声处理的提取物的反应相当地好于与E提取物的反应(OD分别大于2和小于0.01)。这些上清液中的某些也可以凝集未受损PE。用未感染人的E和纯化的PE的相继进行的Triton X-100和SDS提取物对每种杂交瘤上清液进行Western吸印。将丙烯酰胺凝胶电泳2小时，使凝胶中的较小分子走出该颗粒以便对大分子蛋白进行高分辨比较。九种杂交瘤上清液与PE蛋白但不与E蛋白反应。有八种杂交瘤与PE反应为同一方式。其中之一用于通过有限稀释克隆法获取一个克隆细胞系，称为41E11。余下的杂交瘤上清液在进行Western吸印时显示有不同的反应性，并且同样地用于获取称为12C11的克隆细胞系。由这些细胞系产生的单克隆抗体称为MAb 12C11(一种IgM(λ))和MAb 41E11(一种IgM(κ))。
实施例3MAb的凝集作用和玫瑰花的破散。
玫瑰花结破散和PE凝集作用的测定对抗体破散围绕PE的E玫瑰花结或引起PE凝集的能力按所描述的方法进行测定;参见David等人(1988)Am.J.Trop.Med.Hyg.38289-297，和Marsh等人(1986)J.Immunol.Meth.91107-115。
在向含有围绕Malayan Camp株PE的E玫瑰花结的血液中加入来自免疫的非洲成年人的人血清，可形成只含PE的大凝集体。这些凝凝集体的大小从含数十或数百PE不等，并且可包括血清中几乎所有PE。这些样本最初在有多于两个粘附的E/PE的玫瑰花结中包含了大于90%的PE，但在加入免疫非洲成年人血清后，未在少数所见未凝集PE中检测出玫瑰花结。因此，这显示在PE周围所有的E玫瑰花结已被破散。推测玫槐花结破散发生在抗体介导的PE凝集之前。
在玫瑰花结中含有＞90%成熟PE的Malayan Camp 株疟原虫的样本中，MAbs 12C11和41E11均可凝集PE。这些抗体产生了在其核心中紧密排列的数十至数百的PE的凝集物。仅有少数PE(估计＜PE总数的10%)用至最高的抗体浓度(高至500μg/ml)才凝集。这两种抗体均不凝集E。与用人免疫血清所见的凝集物不同，这些凝集物可以保持某些仍粘附PE的、已形成玫瑰花结的E，尤其是在凝集物的外围。然而，在用同样浓度的对照大鼠IgM抗体(得自大鼠血清的多克隆IgM或单克隆IgMs)进行的一些实验中，PE也可被有效地凝集。鉴于这种作对照的、偶发的PE凝集以及所试验的抗体，未再进一步进行凝集试验。
在实验中试验了MAbs对玫瑰花结的破散作用，其中以15稀释的人免疫血清仅破散了80-90%的玫瑰花结。两种抗体在浓度为1-500μg/ml时于37℃在60分钟孵育期中不影响玫瑰花结(已能检出＞10%)玫瑰花结破散)。
通过间接免疫荧光法也进行了鉴定这些抗体与未受损PE表面的反应性的工作。该方法是用第二或第三免疫标记物鉴定结合的MAb。虽然某些PE能观察到弱的荧光，但这并不是能再现的发现。对这些MAbs是否有一种可阻断PE对表达CD36的稳定CHO细胞转化物的粘附的作用进行了试验。大约半数的10-500μg/ml 浓度所试验的MAb12C11确实阻断了PE粘附(为20-70%)，而MAb 41E11则无此作用。对照IgM抗体未影响粘附作用。然而，在其它的实验中，MAb 12C11对粘附无影响。其后，未能获得MAbs 12C11或41E11对PE表面的可重现的反应性。
实施例4MAb 12C11的Western吸印反应性免疫吸印为进行免疫吸印实验，将源自约4×107PE的疟原虫提取物加至一预备的小孔(72×0.75mm)中。在凝胶电泳后，用Mini Trans-Blot Cell(Bio-Rad Laboratories)在转移缓冲液(192 mM甘氨酸25 mM Tris碱20%甲醇，pH 8.3)中于80伏电压下经1小时将蛋白转移至Immobilon-P(Millipore，Bedford，M，Catalog no.IPVH 00010)上。Immobilon膜用溶于TBS(10 mM Tris碱;150 mM NaCl，pH 8.0)的20%胎牛血清于23℃封闭30分钟，用1倍浓度的杂交瘤上清液或用溶于TBST(含有0.05%吐温20的TBS)的、稀释度为1500的MAb 8B7.4腹水(特异性针对PfEMP2)于23℃孵育30分钟，并且用TBST洗涤两次。膜与下列用TBST稀释(15，000)的碱性磷酸酶结合抗体中的一种于23℃孵育30分钟这些抗体或是羊抗小鼠IgM(整个分子)(Cappel/Organon Teknika，West Chester，PA)、μ-链特异性羊抗人IgM(Cappel)，或μ链特异性羊抗大鼠IgM(Jackson Immunoresearch Laboratories，West Grove，PA);用TBST洗涤两次，然后用含有5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐和氮蓝四唑的Western吸印碱性磷酸酶结合底物盒(Bio-Rad Laboratories，Catalog no.170-6432)染色。
用在疟原虫由环形期至裂殖体期同时发生的体外生长期间于不同时刻收集的无性繁殖期PE的Triton X-100和SDS提取物进行Western吸印，检测这些MAbs与蛋白抗原的反应性。用碱性磷酸酶连接的检测系统检测结合的抗体，识别出几条反应性的条带。
MAb 12C11主要与四种约为310、145、117和95KD的疟疾蛋白(分别称为抗原(Ag)12A、12B、12C和12D)反应(参见Handunnetti等人(1992))。Ag 12A总是一条与MAb 12C11反应的优势条带。在某些实验中Ags 12B、12C和12D标记程度较低。用MAb 12C11 也可检测出约15个的其它很弱的反应条带，但仅限于某些实验中。
MAb 12C11直至早期的滋养体期(18小时)时才结合高分子量的抗原。在Triton X-100和SDS提取物两者中均检测出约为310KD的MAb 12C11反应条带。为简化起见，这两条带被称为Ag 12A，尽管有可能这两条带为完全不同的蛋白质或同一蛋白质的具有不同去污剂提取特性的不同形式。Ag 12A主要作为Triton X-100可溶性抗原最初在早期滋养体期表达，在SDS提取物中有小的反应性。当疟原虫成熟时，在SDS去污剂提取物中总的MAb 12C11 反应性的比率增加，以至在35个小时进入无性繁殖循环后，这种形式的Ag 12A在Ag 12A条带上占优势。Ag 12A在这里也称为PfEMP3。Ag 12B(145KD)和Ag 12C(117 KD)主要是作为Triton X-100可溶性产物进行测定的，而Ag 12D(95KD)为Triton X-100不溶性。
由MAb 12C11在裂殖体期疟原虫的15%丙烯酰胺凝胶上所识别的少量PE抗原对(45和47KD)也被检测出，称为Ag 12E。用来感染的正常E未检测出Ag 12E。在无性繁殖循环期间，Ag 12E最初在中滋养体期表达。Ag 12E不能被Triton X-100提取，但可用SDS提取。
MAb 12C11也可与能在15%丙烯酰胺凝胶上被检测出的40和30KD的两种人E抗原反应。这两种抗原(分别称为Ag 12F和Ag 12G)在正常人E以及所有疟原虫期的PE的Triton X-100提取物中检出，因而它们不是疟疾蛋白。也检测了商业生产的、纯化的人血红蛋白是否能与MAb 12C11反应。人血红蛋白与MAb 12C11 的Western吸印在与Ag 12G共同迁移的30KD处产生了很强的反应条带。
此抗原并不与PfEMP3或任何由MAbs 33G2 或41E11识别的抗原相对应。
推测Ag 12G是血红蛋白二体，或者是不被SDS所解离的加合物(它呈棕色)，或者是另一种源于E细胞质的共同纯化的蛋白质。在16KD处的单体血红蛋白带反应非常弱，即使其量由棕色颜色程度判断大大超过了30KD Ag 12G条带。
实施例5MAb 41E11 的Western吸印反应性对于成熟滋养体感染的PE，MAb 41E11主要与5种＞1000、320、175、160和138KD的抗原(分别称为Ags 41A、41B、41C、41D和41E)反应。由Western吸印检测的Ag 41B与由MAb 41E11免疫沉淀的Ag41B共同迁移。用MAb 41E11进行的Western吸印可以检出约25种其它的弱反应性条带，尽管并不是所有的这些条带在每一个实验中都很明显。
Ag 41A直至滋养体期才可测出，而抗原41B、41C和41D在所有时期均可表达。Ag 41E只在Triton X-100分离物中才能检出，而Ag 41A-D存在于两种去污剂提取物中，但所含比例不同。Ag 41B主要在Triton X-100的可溶性分离物中。Ags 41C和41D在环形期主要为Triton X-100可溶的，而在那之后主要以Triton X-100不溶形式出现。
MAb 41E11不与来自未感染细胞的去污剂提取物反应，也不识别低于138KD的Ag 41E的疟疾蛋白。
由MAb 41E11鉴定的PE抗原与用人IgM MAb 33G2 [24-26]通过邻接凝胶泳道的Western吸印广泛地鉴定了的抗原进行了比较。除了在Ag 41A和Ag 41B之间迁移的较大的MAb 33G2抗原缺乏MAb 41E11图型外，用这两种MAbs鉴定的抗原有同样的迁移率。
与MAbs 12C11和41E11有反应性的抗原的名称及其去污剂溶解性总结于表5中。
表5与大鼠MAb 12C11和41E11有反应性的恶性疟原虫无性阶段抗原aMAb 抗原 表观 去污剂提取性Mrb6小时 18小时 41小时(kD) TX-100 SDS TX-100 SDS TX-100 SDS12C11 12Af310 - - ++ + + ++12B 145 - - ++ + ++ +12C 117 - - ++ - ++ -12D 95 - - - - - ++12E 45/47c- - - - - +12Fd40 + - + - + -12Gd30 + - + - + +/-41E11 41A 2.5×103e- - - - + ++41B 320 ++ - +++ + +++ ++41C 175 ++ - - ++ - +41D 160 ++ + + ++ + ++41E 138 - - - - ++ -
a 在结合抗体的Western吸印和ELISA检测后与抗原的反应性-，无反应性;+/-，弱阳性;+，阳性;++强阳性;+++非常强的阳性。
b 除非另外加以注明，公称Mr仅用于比较目的，它基于还原条件下的5%SDS-PAGE的结果以及对标准曲线的内推和外推。
c 得自还原条件下的15% SDS-PAGE和用低分子量标记物的标准曲线进行内推的双体的Mr。
d 虽然Ag 12F和Ag 12G不是恶性疟原虫抗原，但它们代表了正常人的红细胞对MAb 12C11反应的成分，所以包括在此表中。
e 由Petersen等人(1990)Abstract 24 in Proc.38th Mtg.，Am.Soc.Trop.Med.Hyg.对称为Pf 11.1、现称为Ag 332的一种无性阶段蛋白进行测定。
f Ag 12A这里也注明为PfEMP3(恶性疟原虫红细胞膜蛋白3)。
MAb 41E11通过Western吸印可与Triton X-100提取物和Triton X-100不溶物质的SDS提取物中的至少15种抗原条带反应，其主要条带为160、175、320和＞1000KD。这些条带并不与PE外膜相关蛋白PfEMP1或PfEMP2相符。大多数由MAb 41E11所定义的抗原与由33G2人IgM MAb所定义的抗原共同迁移。
实施例6用MAbs 12C11 和41E11进行免疫沉淀细胞表面的碘化、生物合成标记和免疫沉淀作用除用肝素破散玫瑰花结，然后进行明胶筛选的方法纯化PE以外，Malayan Camp品系的成熟滋养体期PE用乳过氧化物酶法进行纯化(85-90%细胞含疟原虫)和表面碘标。在生物合成标记疟疾蛋白的其它实验中，于含有正常水平的10%的适宜氨基酸的培养基中，以100μCi/ml [35S]蛋氨酸或3H异亮氨酸培养PE由环形体至滋体。在对PE的35S标记的去污剂提取物进行免疫沉淀，除在加入蛋白A琼脂糖前，将兔抗大鼠IgG(整个分子)和兔抗大鼠IgM(m-特异性)(Jackson Laboratories)与提取物于23℃孵育30分钟以外。
用Triton X-100提取物和Triton X-100不溶物的SDS提取物检测了MAb 12C11和41E11对放射碘标PE表面蛋白的免疫沉淀作用。在人免疫血清或Aotus猴血清可以产生125I-标记的PfEMP1特异性免疫沉淀的实验中，两种MAb均不能免疫沉淀125I-PfEMP1。考马斯亮蓝染色显示第一抗体(大鼠IgM)和第二抗体(兔IgG)在这些实验中均被吸收至蛋白-A琼脂糖凝胶上)。
用同样的去污剂提取步骤产生Triton X-100和SDS提取物，以35S蛋氨酸生物合成放射标记蛋白进行免疫沉淀。PE在从疟原虫环形期至晚期滋养体期的生长过程中与放射标记氨基酸一起孵育。MAb 12C11不能免疫沉淀任何标记蛋白。MAb 41E11可特异性免疫沉淀来自SDS提取物中的＞1000KD的生物合成放射标记的条带(称为Ag 41A)和来自Triton X-100去污剂提取物的320KD的生物合成放射标记条带(称为Ag 41B)。其它低Mr的条带不能总被MAb 41E11免疫沉淀。以鼠MAb 8B7.4[4]进行免疫沉淀所定义的PfEMP2与Ag 41B有差异。首先，在7.5%丙烯酰胺凝胶上，Ag 41B具有比PfEMP2稍快的迁移率。其次，Ag 41B也在其从Triton X-100提取物中而不是SDS提取物中的回收方面区别于PfEMP2。
环形期疟原虫(感染后4个小时)的固定IFA显示MAb 12C11只标记疟原虫。对于滋养体(大于12小时)和更成熟期疟原虫，固定的IFA反应可见于疟原虫处和集聚在宿主细胞质并扩展至PE浆膜的抗原中。在Western吸印上，MAb只与早期滋养体(12个小时)和更成熟期疟原虫中的疟疾蛋白反应。
MAb 41E11其它的特性，如反应性的时期特异性和间接免疫荧光(IFA)图型，非常类似于以前对共同拥有EEXXEE顺序基序抗原描述的特性。与MAb 33G2不同的是，MAb 41E11免疫沉淀了一种320KD的生物合成放射标记蛋白。MAb 41E11不能免疫沉淀任何细胞表面碘标蛋白。通过Western吸印和固定细胞的IFA，MAb 41E11可与所有无性繁殖期细胞反应。IFA反应位于宿主红细胞质中的膜性结构、PE的浆膜以及细胞内疟原虫处。由MAb 41E11鉴定的抗原的另外的一个共同特点是随着丙烯酰胺浓度的增加，它们在SDS-PAGE凝胶上的相对迁移率也增加。
实施例7丙烯酰胺浓度对MAb 41E11反应性抗原相对迁移率的影响滋养体PE的SDS提取物以4%和7.5%SDS-PAGE进行分离，并以MAb 12C11、41E11和8B7.4(抗PfEMP3)进行免疫吸印。在两种凝胶中，PfEMP2迁移率稍快于PfEMP3(Ag 12A)，并且相关于Ag 12A的PfEMP2的迁移率在1.1处无改变(见表6)。然而，MAb 41E11反应性抗原的迁移率在丙烯酰胺浓度减少时与PfEMP3(Ag 12A)的迁移率相比明显受到抑制。在凝胶的已知Mr或在Mr 205KD处肌球蛋白标准标记物的红细胞膜内蛋白条带以上的区域，不可能通过标准曲线的内推测出这些条带的Mrs，因此，与PfEMP3比较了相对迁移率。例如，在7.5%丙烯酰胺凝胶上，Ag 41滞后于PfEMP2和PfEMP3。当丙烯酰胺浓度由4%改变为7.5%时，与PfEMP3相比，Ag 41A和41B的相对迁移率增加了1-4倍(表6)。
表6丙烯酰胺浓度对MAb 41E11反应性抗原和PfEMP2与PfEMP3相比较的迁移率的影响抗原 迁移率指数:a 迁移率指数比(疟疾蛋白抗原:PfEMP3) 7.5%:4.0%丙烯酰胺百分比 丙烯酰胺4.0 7.512A 1.0 1.012B 2.1 5.6 2.7PfEMP2 1.1 1.1 1.041A 0.2 0.8 4.741B 0.9 1.8 2.041D 1.8 5.6 3.1肌动蛋白标记物 1.6 4.4 2.8a 每种抗原移动距离以mm为单位计量，从走电泳的凝胶的顶端量至免疫反应条带的前端。计算了以PfEMP3(抗原12A，Ag 12A)为标准的相对迁移率;注明为迁移性指数。每种抗原移动距离以在同一凝胶上的PfEMP3移动距离相除。
实施例8固定的感染红细胞的间接免疫荧光测定固定的PE的间接免疫荧光测定 用PBS洗涤含有同时产生的无性繁殖疟原虫的感染血液，悬浮细胞使其为5μl/ml。将35μl这种悬浮液加入以Cell-Tak(Collaborative Research lnc.，Bedford，MA)包被的盖玻片中，细胞于37℃粘附60分钟。用产生同样结果的溶于37.5 mM磷酸钠、10 mM 高碘酸钠、74.5 mM D，L-盐酸赖氨酸的1%或2%多聚甲醛w/v进行固定1-20小时。通过用溶于PBS的0.5mg/ml的NaBH4洗涤3次，继而用PBS洗涤3次进行淬火。在其它的实验中，样本用100%丙酮在-20℃下处理2分钟以固定。在应用任一固定方法之后，将盖玻片与溶于PBS的5%v/v人血清于22℃孵育30分钟。将前面所描述的杂交瘤上清液的浓缩样本用溶于PBS的5%w/v正常人血清在150和1500之间稀释并加至固定的细胞上，于22℃孵育60分钟。用PBS洗涤3次后，加入将商用包装(1.0mg/ml)的第二抗体(羊抗大鼠IgM，荧光素异硫氰酸盐或Texas Rad标记的，Fisher Biotechnic Division)用溶于PBS的5%w/v 人血清以150或1100的稀释度稀释所得到的第二抗体，于22℃孵育30分钟。然后将样本用PBS洗涤3次，并用溶于PBS的50%甘油装样进行共焦显微术。
共焦显微术 用共焦荧光映象显微术测定固定的PE中与MAbs反应的抗原的分布。应用了Bio-Rad MRC 600这种仪器，在测定FITC标记的抗体时，其激发波长为488 nm，并以515 nm的长程滤光片进行发射检测;在测定Texas Red标记的抗体时，其激发波长为514 nm，并以600 nm的长程滤光片进行发射检测。空间分辨率约为0.2μm，Z轴分辨率约为0.8μm。
对最初用丙酮或多聚甲醛处理固定的PE进行免疫荧光测定(IFA)，定位由MAbs识别的抗原。用共焦荧光映象显微术测定由荧光标记的第二抗体产生的荧光的分布。用FCR-3疟原虫的K+R-C-5克隆获得了实际上相同的荧光分布。两种MAb进行IFA时均不与存在于同一样本中的未感染人红细胞反应。缺少第一MAb或者第二抗体的对照为阴性。无论用多聚甲醛还是丙酮，与两种MAb之中任一反应的结果无显著差别。
在4个小时感染后的幼环形期疟原虫中观察到MAb 41E11 与无期繁殖疟原虫的反应。此期最强的标记在疟原虫内。宿主的E膜也显示出被标记了。某些细胞中，在宿主E的整个胞浆中存在着弥散的标记，而在其它的细胞中，尤其是在红细胞膜上则存在着碎片似的和强的荧光分布。当疟原虫成熟至晚期环状体期/早期滋养体期时(感染后12-18小时)，较幼疟原虫特征性的IFA图型仍存在于某些细胞中，但此时的大多数细胞有抗原反应集聚体在细胞周边，在宿主E胞浆中和在红细胞膜上。这些集聚体直径大小从0.2到0.5μm。在10个小时时出现在疟原虫和外层细胞膜之间扩展结构上的强MAb 41E11反应代表了PE浆膜的折叠。晚期滋养体和早期裂殖体显示出在宿主E胞浆中具有抗原反应的集聚体的数目和大小的显著增加。首先在环形期疟原虫时期所见的外层细胞膜的均匀分布的标记图型在29小时时的成熟疟原虫时期已减少。对于成熟裂殖体和裂殖体，与MAb 41E11的反应强度降低，包括在疟原虫处和在外层细胞膜处的集聚体的反应。
通过IFA的MAb 12C11反应也见于早期环形期(感染后4小时)，但对比于MAb 41E11，MAb 12C11只标记疟原虫，而在宿主细胞浆内或在外层细胞膜处无标记。随着疟原虫的成熟，检测出宿主细胞浆内的弥散性着色，并且在15个小时时，在疟原虫和外层细胞膜之间出现了反应性抗原集聚体。这可以在比较同一细胞的亮背景和荧光时的显示时清楚地看见。这些集聚体直径约为0.2-0.5μm。在滋养体感染的细胞中，在宿主细胞浆中的集聚体数目增加，但这些集聚体的数目和其大小(直径为0.2-0.3μm)小于在27小时时用MAb 41E11的同样疟原虫制备物中所见的集聚体。应用MAb 12C11时值得特别注意的是在许多很小的集聚体中出现了囊泡性荧光反应。这些小集聚体似乎直径为0.2μm，但由于光镜的X-Y空间分辨率＞0.2μm，所以它们可能更小。这些集聚体产生于疟原虫之外而且显示出分布于整个PE，扩展至外层细胞膜。用MAb 41E11未见类似的小集聚体。
实施例9抗原在PE表面的位置通过检测抗体与PE细胞表面反应的标准试验试验了MAbs凝集作用、IFA、玫瑰花结破散作用、细胞粘附作用丧失和表面放射性碘标蛋白的免疫沉淀等实验。尽管某些个别实验给出了表明与细胞表面的特异性抗体反应在该实验内一致的数据，但这些结果在各实验间不能重复得出。这些MAbs弱的或不可重复的作用表明或者抗原的非折叠形式、疟原虫的表型变异体优先反应，或者某些大鼠IgMs的非特异性细胞结合特性。这些MAbs不是能确定解决靶抗原是否在细胞表面存在的最佳试剂。然而，他们是对按本文所说的方法进行克隆的优良试剂。
实施例10这些新抗原与PfEMP1的关系PfEMP1是一种与PE粘附于宿主细胞相关的蛋白质。MAb 41E11与一种大分子疟疾蛋白(称为D260/Ag 41B)反应，该蛋白可以依据不同的去污剂提取特性和其在高分辨率的SDS-PAGE上的电泳迁移率与PfEMP1明确地加以区别。然而应用MC株疟原虫，MAb 12C11可以与一种具有适宜的去污剂提取性特征和在SDS-PAGE上与PfEMP1有相称大小的抗原反应。125I-PfEMP1被抗Malayan Camp株Aotus血清免疫沉淀并被转至Immobilon膜上。PfEMP3，如与Mab 12C11反应所定义的以及用酶性方法检测的，可产生与用同一吸印的放射自显影检测到的125I-PfEMP1条带具有同样迁移率的一条带。然而，用不同疟原虫进行的详细生化研究表明PfEMP3(Ag 12A)和PfEMP1是不同的和独特的蛋白质。在FVO株中，PfEMP3和125I-PfEMP1可被SDS-PAGE完全溶解。
这些研究部分弄清楚了由两种IgM大鼠MAbs所定义抗原的特征，特别着重于对在300KD大小范围的大分子疟疾抗原进行研究，这样大的分子迄今很难进行系统研究。这些MAbs其中之一的41E11可与以前研究过的一组蛋白反应。MAbs为这些分子的研究提供了一种新的、可能有价值的特性，也就是其特异性免疫沉淀D260/Ag 41B的能力，这些能力表明其天然蛋白的识别作用。
MAb 12C11定义了迄今未有描述的一种疟疾蛋白抗原，这里称为Ag 12A(PfEMP3)、12B、12C、12D和12E，其大约的Mr分别为310、145、117、95和47/45KD。由于PfEMP3(Ag 12A)相应于一种极高分子量的完全新的疟疾蛋白，所以它具有特别的重要性。
实施例11文库构建和筛选疟原虫株及培养体外培养具有K+C+的Malayan Camp品系和玫瑰花结阳性的表型以及K-C-和玫瑰花结阴性的表型，虽然K-品系在10%(v/v)人血清中生长。克隆7G8得自David kaslow，National Institnte of Health，Bethesda，MD。
噬菌斑抗体纯化 通过在λgt11重组体上进行吸附和洗脱，从来自加纳成年人的5种不同免疫血清池中纯化抗体。
单克隆抗体 MAb 12C11是前面描述的一种大鼠IgM。MAb 89是识别HRP1的一种小鼠IgG2a，Taylor等人(1987)Mol.Bi-Ochem.Parasitol.25165-174以前也对它进行了描述，MAb 8B7.4是识别MESA/PfEMP2的一种小鼠IgG1(κ)，Howard等人(1987)J.Cell.Biol.1041269-1280对它进行了描述。
DNA的RNA纯化滋养体期PE在140 mM NaCl、1.5 mM MgCl2、10 mM Tris、0.5% NP-40、20 mM氧钒硫酸核苷复合物(pH 8.0)中裂解，冷却至4℃，以2000×g离心5分钟。将SDS和EDTA(pH 8.0)加入含有RNA的上清液中，其终浓度分别为1%(w/v)和10mM。用苯酚抽提RNA上清液直至苯酚/水相界面清晰并进行RNA沉淀。
由前面提取的含有基因组DNA的核微球在50 mM Tris、15 mM EDTA、0.5% SDS、0.5mg/ml蛋白酶K(pH 8.0)中于55℃孵育2至10小时。用苯酚提取DNA并用乙醇沉淀。
文库构建和筛选根据Vernick等人(1988)Nuc.Acids Res.166883-6896的条件，在35%或者40%甲酰胺存在的情况下，用5、10或15单位的绿豆核酸酶(Promega Corp.，Madison，WI)消化每个反应2μg的基因组DNA。将6个不同的反应结合并用T4DNA聚合酶(GIBCD-BRL，Gaithersburg，MD)处理以钝化DNA末端。用EcoRI甲基化酶和S-腺苷甲硫氨酸(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)使EcoRI限制位点甲基化，然后通过EcoRI接头(NEB)的连接作用，使之连接至DNA片段并用EcoRI消化。经过两次精胺沉淀及随后的将DNA两次通过大小选择-400旋转柱(Pharmacia LKB Biotechnology，Piscataway，NJ)去除接头。将DNA连接至λgt11臂上并用Gigapack II Packaging ExtractsGold II(Stratag-ene Cloning Systems，La Jolla，CA)依照生产商的说明进行包装。
用Protoblot λgt11 Immunoscreening System(Promega)按照生产商的说明，以在0.5倍的培养上清液浓度的MAb 12C11 筛选初级分子库，除了将碱性磷酸酶连接的羊抗大鼠IgG(Cappel/Organon Teknika，West Chester，PA)用作第二抗体外。
实施例12λ12.1.3的分离和顺序分析以大鼠单克隆抗体MAb 12C11 筛选用恶性疟原虫MC株K+C+R+的基因组DNA构建的λgt11表达文库。分离了13个阳性克隆。特异性针对每一克隆的人抗体从免疫血清库中由噬菌斑纯化出来，并通过进行免疫吸印与滋养体PE的去污剂提取物反应。由λ12.1.3洗脱的抗体与一种约为315KD的抗原反应，该抗原被称为PfEMP3。与MAb 12C11不同，这些洗脱的抗体只与PfEMP3反应并且不与由MAb 12C11识别的许多其它低分子量蛋白反应。
一种强免疫反应性克隆λ12.1.3含有用λgt11引物通过聚合酶链反应的方法确定的1.4Kb插入段。邻近于β-半乳糖苷酶基因3′末端的克隆DNA片段的EcoRI位点在λ12.1.3中被破坏，从而使含有克隆DNA的2.4 kb 的EcoRI/KpnI片段亚克隆入SK-(Stratagene)以制备重组质粒P12、1.32。用核酸外切酶器产生不定向缺失突变株，并用双脱氧链终止法和T7 DNA聚合酶(U.S.Biochomicals，Cleve-Land，OH)进行测序。
在UNDP/World Bank/WHO-TDR疟疾顺序数据库(第二版)中检索顺序同源物，并也在Swiss Prot 版和NBRF版蛋白顺序数据库中进行检索。参见(1992)Nucl.Acids Res.202019-2022;和Barker等人(1992)Nucl.Acids Res.20S2023-2026。
在这一基础上，用标准方法对来自λ12.1.3的DNA插入片段测序，并且发现该DNA插入段为一与λgt11的β-半乳糖苷酶基因在同一码内的新基因。见表3。
应用例如PCR和/或染色体步移技术，通过标准探针方法分离出完整的基因顺序。参见，如，Current Protocols in Molecular Biology。本发明也提供了cDNA克隆p2b1和p12-1的顺序。
质粒p12.1.32和p12-1已于1991年9月26号保藏于ATCC，其保藏号分别为ATCC 75108和ATCC 75109。
实施例13PfEMP3与来自重组蛋白和肽免疫的动物血清进行的免疫吸印免疫原的制备和动物免疫在大肠杆菌Y1089中制备λ12.1.3的溶原性细菌，并进行β-半乳糖苷酶融合蛋白的诱导和表达。用5% SDS-PAGE分离诱导的λ12.1.3溶原性细菌的全细胞提取物，并用考马斯亮蓝染色。将160KD的融合蛋白从凝胶上切下并贮于-20℃。用弗氏完全佐剂(GIBCO)乳化丙烯酰胺凝胶片以进行第一次注射，或用弗氏不完全佐剂(GIBCO)乳化以进行下一次免疫。以两周的间隔对雌性Lewis大鼠进行腹腔和皮下注射，并且对四种不同单模标本的B10-同类系雄性小鼠[5×D2/N，4×S(9R)，3×M，和5×BR]进行腹腔注射。对雌性新西兰大白兔第一次免疫用皮下注射，之后的注射用肌肉注射。强化免疫间隔3周，其它免疫间隔2周。对于每次免疫，每只大鼠和兔接受等同于由2.5×109个大肠杆菌溶原性细菌表达的融合蛋白的注射，而每只小鼠接受7×108个大肠杆菌溶原性细菌的等同量。
首先，将1毫克的肌球蛋白连接的肽类似地注入兔体内，接着用0.5mg剂量进行第二次注射。
PE的免疫吸印和去污剂提取 用SDS-PAGE对蛋白的分离以及免疫吸印技术是按照前面的描述进行的。大鼠和小鼠血清稀释1500，而兔血清稀释1200。MAb 12C11 在1倍上清液浓度下进行吸印。碱性磷酸酶连接的第二抗体购自Cappel或Jackson Immun-oresearch Laboratories(West Grove，PA)并以15000的稀释度应用。
依次用1 ml溶于PBS的1%(v/v)Triton X-100和1 ml溶于PBS的2%(w/v)SDS提取5×108PE。
为证实λ12.1.3的基因产物是PfEMP3，用λ12.1.3的β-半乳糖苷酶融合蛋白免疫大鼠、小鼠和兔。所有免疫大鼠(8/8)和小鼠(4/4单模标本)反应良好，产生了在用成熟PE的SDS提取物进行免疫吸印时能与PfEMP3反应的血清，而只有半数的兔(2/4)产生了抗PfEMP3的抗血清。大鼠和小鼠血清具有非常高的特异性，只与PfEMP3反应，这与大鼠MAb 12C11 可以鉴定出许多其它低分子量抗原形成对比。
用源自推测的融合蛋白顺序之N末端顺序的三种不同肽-肌红蛋白结合物免疫兔。所有三种肽产生了在进行免疫吸附时与PfEMP3反应的血清，免疫前血清则不能与之反应。
测定了血清对成熟K+PE的表面碘标的去污剂提取物的免疫沉淀作用。在这些血清中，只有一种兔血清(05-75)能够一致地免疫沉淀PfEMP3。所有血清进行Western吸印时均与PfEMP3反应，大多数在1200至1500稀释度时反应很强。
实施例14免疫吸印K-和K+品系肽的合成和与载体蛋白的连接基于克隆DNA所推测的氨基酸顺序合成了下列肽
CRDMKNKELLNKDLSNEDMK[Cys-Arg-Asp-Met-Lys-Asn-Lys-Glu-Leu-Leu-Asn-Lys-Asp-Leu-Ser-Asn-Glu-Asp-Met-Lys](P1-18)，CNKDLSNEDMKNKELLNKDI[Cys-Asn-Lys-Asp-Leu-Ser-Asn-Glu-Asp-Met-Lys-Asn-Lys-Glu-Leu-Leu-Asn-Lys-Asp-lle](P9-27)，和CGQQNTGLKNTPNERQQNTG[Cys-Gly-Gln-Gln-Asn-Thr-Gly-Leu-Lys-Asn-Thr-Pro-Asn-Glu-Arg-Gln-Gln-Asn-Thr-Gly](P52-70).起源顺序不包括划底线的残基。将半胱氨酸加至肽的N末端以使其与载体蛋白连接。应用t-boc化学法，在Applied Biosystems 430型肽合成机上通过固相合成产生肽。用无水HF在-5℃和10%苯甲醚存在的条件下，将肽从树脂上裂解下来，在醚中沉淀，以0.25 M乙酸溶解并冻干。
按下面的步骤将肽连接至肌红蛋白上。将肌红蛋白与0.12 M碘乙酰胺和0.1 M碳酸氢钠于25℃孵育1小时以封闭游离巯基，而且将肌红蛋白依次用pH 8.5的碳酸氢盐缓冲液和0.5倍PBS、0.1M硼酸盐透析。然后，将50 mg磺酸琥珀酰亚胺基-(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯(Pierce，Rockford，IL)与25ml的封闭的载体(5mg/ml)于25℃孵育12小时，并以pH 8.5的PBS和0.5倍PBS、0.1M硼酸盐透析。将每种肽15 mg用1.5mlpH为8.0的0.1M二硫苏糖醇、50 mM Tris、2.5 mM EDTA溶解并于37℃孵育12小时，两次通过4ml交联葡聚糖G-10旋转柱，并与3ml激活的载体蛋白于25℃孵育12小时。连接物于4℃用PBS彻底透析。终浓度约为3.5mg/ml。
用MAb 12C11和大鼠抗RP多克隆血清对K-和K+PE的去污剂提取物进行免疫吸印。单克隆抗体和大鼠血清均不能在任一K-提取物中检测出PfEMP3，而在K+提取物中则有强的PfEMP3信号，MAb 12C11识别K-和K+提取物中的Ag 12B(145KD)和Ag 12C(117KD)。相反，大鼠血清更具有特异性，只检测K+提取物中的PfEMP3。
用MAb 8B7.4在K-和K+PE的SDS提取物中均检出MESA/PfEMP2。MAb 8B7.4与K+和K-PE的反应强度一样。因此，MAb 12C11和大鼠抗RP血清不能检出K-疟原虫的PfEMP3，这反映出PfEMP3的缺乏但其它大分子蛋白并不缺乏。应用MAb 89只在K+SDS提取物中检测出HRP1，而在K-PE的TX100或SDS提取物中应用MAb 89则测不出HRP1。这些结果与早期的结果一致并证实了K+和K-表型的电镜特征。
实施例15Southern和Northern吸印用随机引物标记盒(Pharmacia)标记DNA片段。将DNA在0.7%琼脂糖中分离、变性、中和并通过毛细作用用10×SSC转移至Nytran(Schleicher and Schuell，Keene，NH)膜上。用Stratalinker(Stratagene)将DNA交叉连接至膜上并在杂交缓冲液(50%甲酰胺，5×Denhardt′s，5×SSPE、0.1%SDS、10%硫酸葡聚糖，50 mg/ml)中于37℃孵育1小时。将探针热变性，快速冷却，加至杂交缓冲液中，于37℃孵育6小时并于50℃用0.1×SSC、0.1% SDS洗涤。将滤膜暴露于带有增感屏的Kodak X-OMAT XAR-5胶片(Sigma，St.Louis，MD)。
总RNA在1%琼脂糖、甲醛凝胶中分离，浸入10×SSC中1小时以去除甲醛，转移至Nytran膜上并如前所述进行交联。将滤膜在pH7.2的0.5 M Na2HPO4、5% SDS 中于65℃孵育1小时，并在变性探针存在和65℃条件下再孵育8小时。滤膜用pH 7.2的50 mM Na2HPO4、1% SDS 于25℃冲洗1小时。
将λ12.1.3的DNA插入段进行放射标记并通过Southern吸印与来自K-和K+PE的EcoRI消化的DNA杂交。探针杂交至K+DNA的两个15的3.4kb的片段上，但对K-DNA没有检测出信号。编码MESA/PfEMP2顺序的DNA探针杂交至在K+和K-DNA制备物中都存在的单一10 kb EcoRI片段，这显示出单拷贝基因可在K-DNA中检出。
将总RNA从K-和K+滋养体PE中分离出来并通过Northern吸印技术以λ12.1.3 DNA插入段进行探测。对于K-RNA无杂交形成，但在K+带中检测出三种为10、4.4和2 kb 的RNA，10 kb的DNA有最强的信号。
通过以脉冲场电泳和Southern吸印分离染色体的方法进行染色体定位参见，Wellems等人(1987)Cell.49633-642和Sinnis and Wellems(1988)Genomics 3287-295。
通过固定的免疫荧光和Northern吸印确定的HRP1和PfEMP3的表达在短时间内相似。对蛋白质表达的时间性进行了研究。在早期环状体期(感染后6-8小时)，对两种蛋白中的任何一种蛋白均未观察到荧光。到晚期环状体期(12-15小时)，可在疟原虫自身检测到微弱荧光，并伴有在红细胞浆中和红细胞膜处微弱的、弥散的反应。至中期滋养体期，在所有的细胞位置的染色均得到增强，并且至裂殖体期，红细胞膜有很强的荧光。从不同时期的PE中纯化总RNA并用基因特异性探针进行Northern吸印。在早期环状体期和中滋养体期可微弱地检测出信使RNA，但在最成熟期则未检测出。在晚期环状体期和早期滋养体期对两种基因的信号最强，这与用IFA对两种蛋白的最初检测的结果一致。
实施例16K-和K+品系的免疫荧光测定用共焦显微术对固定的PE的间接免疫荧光测定通过在40/70% Percoll、4% 山梨醇梯度中离心收集在40/70界面处的细胞，纯化滋养体期的PE。用RPMI洗涤细胞，并加入新鲜红细胞以调整含疟原虫细胞的比例至50%。用于IFA的细胞通过用2%多聚甲醛、74.5 mM D，L-赖氨酸和10 mM高碘酸钠于22℃固定1小时进行制备，并以溶于PBS的5%(v/v)人血清于22℃封闭30分钟。第一抗体在5%人血清和PBS中稀释成1100并加入反应1小时。将第二抗体(即连接了FITC的羊抗大鼠IgG(H+L)和羊抗小鼠IgG(H+L))在5%人血清和PBS中稀释成150加入并于22℃孵育45分钟。用PBS洗涤细胞，以溶于PBS中的90%甘油将细胞装片，并用扫描共焦映象显微镜(MRC-600，BioRad)观察。
用多聚甲醛固定K-和K+滋养体PE，以大鼠或小鼠抗RP血清染色，并用共焦荧光显微镜观察。所有试验血清的结果相同。在K+PE中，疟原虫处的荧光非常弱。在宿主细胞质中有小的弥散荧光(＜0.2μm)，由细胞内疟原虫延伸至红细胞膜。红细胞膜有很强的荧光。PE的很强的标记区域是由于宿主细胞膜的折叠。所有滋养体期PE有相似的染色。相反，K+PE只显示出对未标记细胞所观察到的一样的微弱自动荧光。
当用MAb 89针对HRP1对K-和K+株染色时，可以重复获得这些结果。K+PE具有基本上与PfEMP3一致的荧光图型，而K-PE和未感染细胞无荧光。
试图用小鼠和大鼠抗RP血清对未固定PE进行染色以测定表面反应。在进行的所有实验中结果均为阴性。
实施例17K-和K+品系的免疫电子显微镜术免疫电子显微镜术 用溶于0.1 M 磷酸盐缓冲液(pH7.4)的1%甲醛和0.2%戊二醛固定受感染的红细胞并包埋入LR White树脂(Polyscience lnc.，Warrington，PA，USA)中。将切片在0.1 M PBS、5%脱脂奶粉、0.01%吐温20中于22℃保温15分钟。将切片在用0.1 M PBS、1% BSA馏分V、0.01%吐温20(PBT)稀释2-10倍的第一抗体中于22℃孵育2小时。在PBT洗涤后，将切片用PBT稀释20倍的18 nM金亲和纯单抗小鼠IgG(Jackson)于22℃孵育1小时。用PBT洗涤切片，以2.5%戊二醛固定15分钟并以溶于50%甲醇的2%乙酸双氧铀和Reynold′s柠檬酸铅染色。用Zeiss CEM 902 电子显微镜检测样本。
用甲醛和戊二醛固定K+和K-滋养体并包埋在LR White树脂中。切片与小鼠抗RP血清或MAb 89一起保温，接着再与金标记的第二抗体一起保温。抗RP血清和MAb 89均不能与K-品系反应。在K+品系中，虽然于宿主细胞膜的细胞外侧面观察到了一些金颗粒，但MAb(抗HRP1)的反应主要发生在球状物的电子密度物质下面。小鼠抗RP血清产生了新的染色图型。金颗粒主要位于宿主细胞膜的细胞外侧面或直接位于宿主细胞膜上，它有固定的间隔分布，并通常是位于球状物之间。很少在宿主细胞膜下或球状物处观察到金颗粒。在寄生虫处或宿主细胞质内几乎未见反应。
本文引用的所有出版物和专利申请都引入本文作为参考，等于是专门地或分别地指出每个出版物或专利申请引入本文作参考。
在本文描述了许多本发明的实施方案后，很明显可以将这些实施方案加以改动以提供其它可利用本发明组合物和方法的实施方案。因此，应意识到本发明的范围包括在前面说明书中以及所附权利要求中所定义的可选择的实施方案及其相应的变化;本发明不限于本文中已以实施例的方式出现的具体实施方案。
上文中所用的标准单字母氨基酸代码如下A Ala 丙氨酸C Cys 半胱氨酸D Asp 天冬氨酸E Glu 谷氨酸F Phe 苯丙氨酸G Gly 甘氨酸H His 组氨酸I Ile 异亮氨酸K Lys 赖氨酸L Leu 亮氨酸M Met 甲硫氨酸N Asn 天冬酰胺P Pro 脯氨酸Q Gln 谷氨酰胺R Arg 精氨酸S Ser 丝氨酸T Thr 苏氨酸V Val 缬氨酸W Trp 色氨酸Y Tyr 酪氨酸另外X Xaa 未知的或未确定的氨基酸
权利要求
1.一种分离的核酸，该核酸包含编码与疟疾PfEMP3蛋白的相应片段高度同源的多肽片段的顺序。
2.权利要求1的核酸，其中所说的片段具有一个抗原决定簇。
3.权利要求1的核酸，该核酸包含一个其顺序与表3所公开的顺序高度同源的片段。
4.权利要求3的核酸，其中所说的顺序编码一个选自下列顺序的多肽片段a)Lys-Asn-AAl-Glu-Leu-AA2-Asn-Lys-Gly-Ser-AA3-Gly-Leu-Lys-Glu-Asn-Ala-Glu-AA4;其中ⅰ)AA1是Lys或Asn;ⅱ)AA2是Arg或Gln;ⅲ)AA3是Asp或Glu;ⅳ)AA4是Leu或Gln;b)Asp-AA5-Lys-Asn-SEQ6-Asn-Lys-Asp-SEQ7-Asn-AA8;其中ⅰ)AA5是Met或Leu;ⅱ)SEQ6是Lys-Glu-Leu-Leu-Leu或Asn-Asp-Ile-Gln;ⅲ)SEQ7是Leu-Ser或Ile-Arg;ⅳ)AA8是Lys或Glu;c)Gln-Gln-Asn-Thr-Gly-Leu-Lys-Asn-AA9-AA10-AA11-AA12-AA13，其中ⅰ)AA9是Thr或Ala;ⅱ)AA10是Pro或Ala;ⅲ)AA11是Ser或Asn;ⅳ)AA12是Glu或Lys;ⅴ)AA13是Gly或Arg。
5.权利要求4的核酸，其中所说的片段至少重复三次。
6.权利要求5的核酸，其中所说的重复片段彼此邻近。
7.权利要求4的核酸，其中所说的片段为Gln-Gln-Asn-Thr-Gly-Leu-Lys-Asn-AA9-AA10-AA11-AA12-AA13;其中a)AA9是Thr;AA10是Pro，AA11是Ser，AA12是Gly，AA13是Gly;b)AA9是Ala，AA10是Ala，AA11是Asn，AA12是Lys，AA13是Gly;c)AA11是Asn，AA12是Glu，AA13是Arg;或者d)AA11是Asn，AA12是Glu，AA13是Gly。
8.权利要求2的核酸，其中所说的顺序编码多个所说的抗原决定簇。
9.权利要求8的核酸，其中所说的抗原决定簇由表3中所公开的核酸顺序编码。
10.一种基本纯的PfEMP3多肽。
11.权利要求10的多肽，该多肽包含选自下列顺序的氨基酸顺序a)Gln-Gln-Asn-Thr-Gly-Leu-Lys-Asn-Thr-Pro-Ser-Glu-Gly;b)与a)所定义的氨基酸顺序基本一致的肽顺序。
12.一种重组多肽，该多肽包含具有表3中公开的氨基酸顺序的一个片段。
13.一种重组多肽，该多肽含有选自下列顺序的一段氨基酸顺序a)Gln-Gln-Asn-Thr-Gly-Leu-Lys-Asn-Thr-Pro-Ser-Glu-Gly;b)与a)定义的氨基酸顺序基本一致的肽顺序。
14.一种抗体，该抗体能特异性识别疟疾PfEMP3蛋白质特有的抗原决定簇。
15.权利要求14的抗体，它能够与MAb 41E11竞争。
16.权利要求14的抗体，其中所说的抗原决定簇公开于表3中。
17.权利要求16的抗体，其中所说的抗原决定簇包含见于下列PfEMP3同源重复区的顺序Gln-Gln-Asn-Thr-Gly-Leu-Lys-Asn-Thr-Pro-Ser-Glu-Gly
18.一种诊断宿主疟疾感染的方法，该方法包括使权利要求14的抗体与得自所说宿主的样本接触。
19.一种诊断疟疾感染的方法，该方法包括检测生物体中存在疟疾PfEMP3蛋白的步骤。
20.一种带有一个隔间的试剂盒，该隔间包含选自下列试剂的试剂a)对PfEMP3蛋白具有特异性的结合蛋白;b)PfEMP3蛋白或其片段。
21.一种治疗组合物，该组合物包含有效量的权利要求14的抗体，以及另一种抗疟治疗剂或一种可药用载体。
22.权利要求21的组合物，该组合物配制成单位剂量。
23.一种疫苗，该疫苗包含a)一种分离的核酸，它含有一段编码与疟疾PfEMP3蛋白的相应片段高度同源的多肽片段的顺序;b)一种基本纯的PfEMP3多肽;c)一种抗体，它能特异性识别疟疾PfEMP3蛋白特有的抗原决定簇;或d)一种疟疾PfEMP3肽的抗个体基因型抗体。
全文摘要
本发明公开了一种来自疟原虫表面并被命名为PfEMP3的肽。本发明还提供了能识别PfEMP3和存在于被寄生的红细胞上的其它大的表面蛋白质的单克隆抗体，以及编码所说寄生虫蛋白质的核酸。本发明还公开了用于疟疾感染诊断和治疗的方法。
文档编号C12P21/08GK1084855SQ9310936
公开日1994年4月6日 申请日期1993年8月6日 优先权日1992年8月7日
发明者S·M·汉杜尼蒂, R·J·霍华德, B·L·帕斯洛斯克, M·R·范施拉文迪克 申请人:先灵公司