有机化合物的或涉及有机化合物的改进的制作方法

专利名称：有机化合物的或涉及有机化合物的改进的制作方法
技术领域：
本发明涉及适于从组织培养中再生整个植株的改进的体细胞胚形成方法，更具体地讲，涉及使用液体培养基本身通过体细胞胚形成而获得体细胞胚的改进方法。
人们认为有效利用体细胞胚形成方法的商业化比(例如)有机生成的克隆更合乎需要，并且从经济上讲，它更吸引人，因为它具备在相对短的时间间隔内得到更高产量的植物的潜力。
已知当某些植物细胞在合适的植物组织培养基中培养时，它们具有分化为整个植株的潜力。这样的培养基通常含有无机盐、碳源(如蔗糖、肌醇、硫胺素等等)。普遍使用的植物组织培养基的实例是Murashige and Skoog(MS培养基)、Gamborg的Lindsmaier and Skoog(B5培养基)，等等。
为了使所用的特定的植物细胞进行最佳生长，可以改变植物组织培养基的组成。几乎所有植物细胞都需要植物激素，如生长素或类似生长素的化合物，如吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸或2，4-D，和/或细胞分裂素(如苄基腺嘌呤、玉米素、激动素)等。为了保证最理想的生长，加入如烟酸、吡哆素等维生素或其他组分(如椰子奶、酪蛋白水解产物等)也可能是有用的。
过去，真正的体细胞胚的形成需要使用愈伤组织材料，该愈伤组织材料含有具有非常大的液泡且未分化的细胞团粒以及较小的有非常小的液泡的圆细胞，以该愈伤组织材料作为最初生长阶段材料并可从中衍生出细胞胚。但是在体细胞胚形成中使用这样的材料作为起始材料有许多缺陷，已证明，在获得大量具有基本相似的表型和/或在倍性水平方面基本一致的植物时，它的使用受到限制。起源于愈伤组织的植物，其体细胞克隆在倍性水平方面显示有变异和/或不整齐。(Chaleff R.S.(1983)Science 219676-682;Larkin P.J.(1987)Iowa State Journal of Research 61(4)393-434;De Klerk G-J(1990)Acta Bot.Neerl.39(2)129-144;Karp A.& Bright S.W.J.(1985)Oxford Surveys of Plant Molecular & Cell Biology 2199-234;Custers J.B.M.et al (1990) Acta Bot.Neerl.39(2)153-161(cucumis sativus L.);Kysely W.et al(1987)Plant cell Reports 6305-308(pisum sativum L.);Ezura H.(1992)Plant Science 85209-213(cucumis melo);and Kiviharju E.et al(1992)Plant Cell，Tissue，and Organ Culture 28187-194(Cyclamen persicum Mill)]已有已知的专利申请实例描述了愈伤组织材料在体细胞胚形成中的应用。例如，WO 90/01058(Plant Genetics Inc)描述了使用愈伤组织材料来获得体细胞胚，同时考察了使用多种合成生长素的效果。将合适的外植体材料在固体培养基中培养和/或再次培养许多星期后即形成或长成愈伤组织，然后通过将愈伤组织转移到含有诸如2，4-D或它的一种类似物的植物激素的培养基中即开始体细胞胚形成。没有提及体细胞胚的倍性水平或获得的植物的倍性水平。在体细胞胚形成中使用愈伤组织材料可能有助于获得植物，其中获得的体细胞克隆变体或许对丰富有用的基因库有意义，但对简单希望获得具有基本相同的基因型的销售量植物的种子商人和育种者来说则无甚用途。
公知已从由分生组织细胞组成的微团将胡萝卜细胞系进行了克隆并研究了他们生成胚的能力(P.Coutos Thevenot等，Plant Cell Reports(1990)8∶605-608)。
该作者报导了使用由在含有生长素2，4-D的植物组织培养基中的家用胡萝卜(Sl品系)的下胚轴得到的一种初始细胞悬浮液，用过滤法分离细胞团粒，再将细胞团在含有生长素2，4-D的植物组织培养基中悬浮以增加团块数的密度，将从分离的细胞团得到的细胞集落转移到装有含有2，4-D和1%细菌用琼脂的固体植物组织培养基的培养皿中，以诱导细胞集落的形成，并将其在含2，4-D和1%细菌用琼脂的第2代固体培养基中在培养S1品系愈伤组织附近沉积，再将它在含2，4-D的植物组织培养基中分离成单个细胞集落。在含2，4-D的植物组织培养基中再培养所获得的培养物，随后分析根据这个方法所获得的细胞系，结果表明在40个细胞系中有13个是能进行胚形成的，但这些细胞系的大多数随时间进行而失去胚形成的潜力，只有一个细胞系在经过更长时间内有相当恒定的胚形成潜力。根据流式细胞计数分析，后者的细胞系是二倍体。
本发明提供了通过悬浮培养物获得体细胞胚的方法，该方法的技术简单，不需要在愈伤组织附近沉积细胞系，因此利用本发明的方法可以以商业规模生产体细胞胚。本发明的体细胞胚能够被用来提供销售量的具有基本一致基因型的植物。
迄今，已表明在获得植物方面体细胞胚形成是潜在的有力手段，但是，利用从愈伤组织材料开始的体细胞胚形成的非实用性阻止了这一技术的成功开发。
现在已惊奇地发现可通过使用液体培养技术本身，并且不需要使用固体培养基和/或愈伤组织，或获得销售量的真正的体细胞胚。也发现在液体培养基中提高PEMs的生物量是可能的，因此液体培养基有生产销售量的体细胞胚的能力，使用这种液体培养技术消除了采用愈伤组织培养/愈伤组织再培养步骤的必要性，且首次提供了获得具有均一的倍性水平的体细胞胚群体的手段。
本发明提供了通过体细胞胚形成获得体细胞胚的方法，该方法基本上减少或根除了获得体细胞克隆变体的风险。
它提供了非胡萝卜属体细胞胚悬浮培养物，其中所包含的体细胞胚的倍性水平基本上是一致的。
本发明进一步提供了具有基本一致的倍性水平的植物(如二倍体植物或四倍体植物)，该植物由基本具有所需倍性水平的体细胞胚悬浮培养物衍生得到。
本发明提供了从外植体材料中获得销售量真正体细胞胚的更可靠方法，它不依赖于使用愈伤组织和/或使用固体培养基作为所说方法的基本材料。
通过阅读下列描述和实施例将很容易理解上述内容以及本发明的其他目的。
本发明提供了促进由外植体材料形成原胚形成群(PEM)的方法，其中的PEMs能够产生存活的体细胞胚，该方法的特征在于将非愈伤组织植物组织放置于含有有效量的生长素或生长素混合物的液体植物组织培养基中。
促进原胚形成群(PEM)的形成是指可以诱导PEM形成和/或可以增加PEM的生物量。
使用的外植体材料可以是单子叶植物或双子叶植物种。优选的是，外植体材料从双子叶植物得到。典型的是，体细胞胚从原胚形成群(PEMs)得到。从形态学上讲，该结构同愈伤组织材料明显不同并且还已知它是分生组织束。PEMs具有与它们由之得到的外植体材料相同的倍性水平。因此，当从双倍体植物获取含有双倍体和四倍体细胞的外植体材料时，在液体培养基中继续培养前，必须通过过筛、细胞分选等方法分离得到的二倍体和四倍体细胞。
PEMs含有基本上分化的正在生长的植物组织，它可被认为是真正体细胞胚的前体。在光学显微镜下(40倍至100倍)，PEMs显现为小的、圆的、含有小液泡的富含细胞质的细胞团。依比，本发明的PEMs可被认为在遗传方面与植物亲代细胞基本相同，其中PEMs由此衍生得到并可最终长大成真正的体细胞胚，该胚被确认为具有二极性，即具有从分生组织的根和芽组织中长大为根的芽的能力。因此，当使用本领域内通常使用的方法作合适的进一步处理时，一个存活的真正的体细胞胚也是一种可以长大成至少一个小植物的胚，从遗传上说，该小植物与其由之衍生的外植体前代细胞材料基本相同。
适合于本发明的方法的植物组织材料是可从任何植物器官或部分，或其他合适的植物分化组织(如原生质体)得到的外植体材料。这样的组织选自于茎、叶、花瓣、下胚轴区、顶端分生组织、子房、合子胚本身、块茎、维管束、中柱鞘、花药丝等等。另外，合适的外植体材料可以是体细胞胚本身。植物组织可以从所需的任何植物种得到，包括选自单子叶植物或双子叶植物的植物组织，在籽苗评估手册(J.Bekendam 和R.Grob，ISTA，Zurich，Switzerland 1979，28-29页，以及在索引122-126页进一步举例说明，这里引入本文作为参考)中可发现所需植物类型的选择法。优选的植物类型包括选自仙客来属、南瓜属、番茄属(优选的是餐用或可食用的番茄)、葱属、秋海棠属、甜菜属、报春花属、芸苔属、辣椒属、菊苣属、扶郎花属、凤仙花属、莴苣属、稻属、天竺葵属、碧科茄属、堇菜属和玉蜀黍属。最优选的植物类型选自仙客来属、南瓜属、甜菜属(如甜菜普通种(糖甜菜))、芸苔属(如B.Oleracea或甘蓝型油菜)、堇菜属、天竺葵属和辣椒属。
适合用于本发明的方法的液体植物组织培养基是任何适于诱导和/或促进胚形成的液体植物培养基。本领域普遍使用的基本培养基的例子包括Gamborg′s B5培养基(B5)、Murashige和Skoog培养基(MS)和他们的变体。
本发明计划在起始诱导阶段将能够诱导PEM形成的足够量的生长素加入到含外植体或其他合适起始材料的合适的液体培养基中，在上述起始诱导阶段之后，进一步使用能促进PEM生长和繁殖的合适的液体培养基，以合适的时间间隔补充该培养基的生长素浓度。利用本领域已知的(例如)标准高效液相色谱技术监测整个时间内的生长素浓度有利于保证悬浮液的发育阶段固定在PEM水平上。不加入太多的生长素到植物组织培养基中也很重要，这样可避免可能发生的生长素的毒害副作用并保持PEMs处于存活状态。
用于PEM生长和繁殖的液体植物组织培养基可以是原始诱导阶段植物组织培养基，其中以适宜的时间间隔，简单地补充该培养基中的生长素浓度和/或其它必需成分，从而使体细胞胚形成的诱导和促进阶段能够发生;在适宜的间隔时间内，原始诱导阶段培养基也可用含适宜的生长素浓度的新鲜植物组织培养基所代替，其中的液体植物组织培养基可以是与起始使用的合适的但不同的液体植物组织培养基相同或不相同。因此，只要培养基是液体并且在合适的生长素浓度下它们能用于诱导和/或促进PEM形成，可以认为实际使用的植物组织培养基或培养基的类型对本发明而言并不关键。
也可容易了解，必需的生长素浓度因不同植物种类而变化，也可因不同植物品种而变化。用标准测试方法可测定对已给定的品种产生最佳效果的生长素的类型和浓度。根据植物品种，使用生长素混合物或许有利。适用于本发明的方法的生长素或类似生长素的化合物的例子包括吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸及其混合物。将生长素保持在这样的浓度，以促使PEMs的成长和形成。
根据PEM的数量或生物量以及所用的植物种类，生长素浓度优选保持在大约0.1mg/l到大约30mg/l的浓度。合适的生长素混合物可包括适宜浓度的NAA和2，4-D。根据所用植物的种类，萘乙酸(NAA)的有效生长素浓度大体在大约0～20mg/l的范围内，2，4-D的有效生长素浓度在大约0.1mg/l到大约10mg/l的范围内。例如，仙客来属PEMs不需要NAA的存在但需要存在2，4-D，且起始浓度大约为5～10mg/l;已发现番茄属PEMs需要起始浓度为20mg/l的NAA和起始浓度为1mg/l的2，4-D。
根据植物品种和所使用的植物组织培养基，向含生长素的培养基中加入非植物毒害量的细胞分裂素可能有利于促进生长素的吸收。
本发明也提供了在悬浮液培养基中获得具有基本相同的倍性水平的体细胞胚的方法，它包括ⅰ)在液体植物组织培养基中培养外植体材料，该液体植物组织培养基含有足以促进诱导原胚形成群(PEM)形成的有效量的生长素或生长素混合物。
ⅱ)在含合适生长素的液体植物组织培养基中使ⅰ)中获得的PEMs数量加倍。
ⅲ)收集在ⅱ)中获得的PEMs并将其置于基本无生长素的液体培养基中;和ⅳ)收集由ⅲ)中产生的PEMs衍生出的胚。
以上已经讨论了本方法的步骤1和步骤2，可按(例如)下述步骤实施将外植体材料置于诸如B5或MS等的合适液体培养基中，根据所用的植物种类，该培养基可含有浓度大约为0.1mg/l到约30mg/l的生长素或生长素混合物，这样的浓度能有效地诱导PEM形成。将外植体材料以大约0.01g鲜重/升到大约100g鲜重/升培养物，优选从1.0g鲜重/升到大约10g鲜重/升的适当密度培养几个星期，其间有PEMs出现。根据所用的植物种类，该时间阶段可从大约2周到大约14周或更多，典型的是从大约4周到大约8周。通常，(例如)通过稀释培养基或替代培养基从原始外植体材料培养物中分离出获得的PEMs并在相同的或相似的新鲜液体培养基中进一步培养。
对于那些需要诱导PEM形成的材料，在相同或相似的环境条件下，获得的PEMs能够立即进入生长或增殖阶段。为了方便起见，在这里将这个阶段称为增殖阶段，因为对PEM数量或PEM生物量的增加可以进行控制并且可以看见这种生长。
在观察到诱导PEM形成之后，监控液体植物组织培养基以使生长素浓度保持在足以促进PEM生长和增殖而无显著PEM发育的水平上。增殖阶段包括在按一定规律稀释的所选择的液体植物组织培养基上再培养，这样可将生长素水平控制于在合适的时间间隔内足以促进PEM增殖。另一方面，可将PEMs从原始外植体材料培养物中分离并将它置于含有生长素的植物组织培养基中，并通过用分批补料或连续培养系统的方法简单地使之繁殖到所需要的PEM生物量。通常，该过程包括在一段时间内保持生长素浓度在大约0.1mg/l的水平之上。依据需要将多少PEMs转化为真正的体细胞胚，可以年为单位测量增殖阶段的时间期间，然而，通常依据所需要的PEM生物质的量，以月或星期为单位测量增殖阶段的时间，如大约2-3星期。一旦处于增殖阶段，PEMs可在任何时刻收集，以便置于基本无生长素的植物组织培养基中，在该培养基中PEMs进可一步发育成为真正的体细胞胚。这还涉及这里描述的筛选，即选择某一特定尺寸的PEM部分，它可通过合适大小的筛(如一个150μm孔径的筛)但可被一个更小孔径的筛(如一个100mm孔径的筛)阻挡住。
补充适当的碳能量源，方便地补充可溶性碳水化合物，如蔗糖、葡萄糖或棉子糖于液体植物组织培养基中，可对PEM的形成和增殖产生有利的影响。
典型的碳水化合物浓度在每升植物组织培养基中在15克到90克的范围内，优选为20克至60克。
增殖阶段可以在烧瓶或在生物反应器中进行，生物反应器在本领域内已知，用于培养细胞悬浮液以生产次级细胞代谢物。然而，迄今尚没有描述将生物反应器用于PEM培养。我们发现可以用生物反应器在相对较短的时间间隔中生产大量的PEMs。
为了方便起见，将从PEM悬浮培养物中得到的聚集的细胞团接种于合适的生物反应器中的合适培养基，该培养基含有足够量的合适的碳能源，例如，依据所用的PEM种类，选用浓度为约15克/升至约90克/升或更高，优选约20克/升至约60克/升的蔗糖、葡萄糖和棉子糖。Preil W.和Beck A.[(1991)Acta Horticulturae 289，Plant Technology∶179-192页]描述了在使用振动混合器的生物反应器中进行的体细胞胚形成，但是，该项研究结果没有指明在PEMs发育为体细胞胚前完成PEM的形成和繁殖。已发现在生物反应器中进行的PEM悬浮培养中使用振动混合器可以显著提高PEMs的生命周期，有助于增加PEM生物量，减少PEM生物量的损失，并阻止PEM成团。在振动混合器上安装有一个穿孔的混合板或搅拌盘(可分别从Applikon BV、The Netherlands and Chemap AG(瑞士)获得)，并且该混合板或搅拌盘定位于生物反应器的固定平台上并使之基本上在固定平台上振动，使用该混合器可以在不显著损失PEM生物量的情况下混合或搅拌PEM悬浮培养物。
优选的是，该振动混合器在基本垂直的平面上振动。在本发明方法中使用的振动混合器的典型的操作频率为50Hz;在较实用的情况下振幅为约±6mm或更少。一旦获得能产生所需量体细胞胚的PEM生物量，可将PEMs置于基本上不含生长素的液体植物组织培养基中，PEMs能在该培养基中发育为体细胞胚。
通气对PEM悬浮培养是有利的。可以本领域内已知的方式进行通气。如果使用一个振动混合器，(例如)可使用一个多孔的喷射装置将空气喷射到振动混合反应器中。
根据上面所述及实例可以看出，对于各种参数，如生长素的类型和浓度、细胞分裂素的存在、能量(碳水化合物)来源、搅拌或振动频率、氧供应、光强度和波长的最佳条件将依据所使用的植物材料而变化。通过使用标准检测法(如实施例中所描述)可以测定这些最佳条件。
根据本发明得到体细胞胚的方法的接下来的步骤ⅲ)和ⅳ)可如下进行通过将PEMs置于无生长素的植物组织培养基中可以促使PEM发育为体细胞胚。存活的PEMs具有发育为体细胞胚的能力。在转移到无生长素的培养基中以前，最好将PEMs过筛，例如，通过一个尼龙网，以选择能最有效地产生所需体细胞胚的PEM尺寸部分。非活性PEM的含量太高将抑制体细胞胚的形成。通常，使用含有至少5%，优选至少10%，更优选至少15%的存活PEMs的PEMs是合乎要求的。利用标准的筛选试验可以测定该最适尺寸部分。
通过使用本领域内已知的(例如)过筛或任何其他的尺寸分选方法可以收集选定尺寸的PEMs。熟练的技术人员将认识到所需尺寸的PEMs(即有高存活PEMs含量的PEM部分)的具体尺寸将随种类不同而变化，如下文所详述。
通过将PEM通过一个过滤装置(如已知孔径的网筛)，例如一种尼龙网筛，以获得在给定的尺寸范围内的PEMs，采用这一方法获得了筛分的PEMs部分。依据不同的植物种类，PEMs的直径可以是高至约1mm的任何尺寸，但是，PEMs的聚集块可以大至直径为5mm。总的来说，单个PEMs的所需尺寸为μm数量级。已发现对于由PEMs衍生出单个体细胞胚而言，PEMs的尺寸是关键的。优选的是，收集到的PEM部分在合适的条件下，其中每一个PEM都能产生一个体细胞胚。当然，特定的存活的、筛分的PEM部分的尺寸随不同的植物种类而变化。例如，对于黄瓜最有用的PEM部分中PEMs的大小为约100μm至约150μm;而对于仙客来属则为约150μm至约300μm。优选的情况，PEM部分中每一个PEM能产生至少一个体细胞胚，优选的是产生一个单个的体细胞胚。
基本上不含生长素的液体植物组织培养基是一种能使PEMs发育为体细胞胚的培养基。因此，考虑到所使用的基本上不含生长素的液体植物组织培养基是一种耗尽了生长素的植物组织培养基，其中可以含有残留量的生长素，但如果含生长素，该生长素量基本上不干扰PEMs发育为体细胞胚，或者是一种不含生长素的植物组织培养基。自然，熟练的技术人员会认识到，依据所需要的体细胞胚的多少，可将基本上不含生长素的植物组织培养基置于烧瓶或合适的生物反应器中，例如安装有振动混合器的生物反应器。然后利用本领域内已知的方法可将获得的体细胞胚转化为植物。因此，通过监控PEM生物量，可以获得销售量的大量的体细胞胚。
实用的无生长素的培养基包括一种浓度为15克/升至90克/升，优选为20克/升到60克/升的可溶性碳水化合物能源。合适的碳水化合物能源包括蔗糖、葡萄糖和棉子糖。
根据顾客的要求，销售量的体细胞胚的数量范围为几百(例如500)至几百万(例如3，000，000)或更多。例如，如果需要约200，000株植物，可使PEM持续增殖，直到PEM生物量达到基本上能产生约200，000体细胞胚。然后将这些PEMs置于无生长素的液体植物组织培养基中与之接触，在该培养基中PEMs发育为体细胞胚。
一旦在基本上无生长素的植物组织培养基中发育成真正的体细胞胚，可利用本领域内普遍采用的技术从无生长素的植物组织培养基中分离出这些胚，并使之转化为植物。
在商业上销售前，可简便地将体细胞胚与无活性的PEMs分离开。可用本领域已知的技术完成这一过程。通常无活性的PEMs比体细胞胚小。例如可通过筛分或细胞分选的手工操作法将体细胞胚分离出来。
在本发明的进一步的实施方案中，提供了成批量的体细胞胚，其中含有基本上都具有相同倍性水平的体细胞胚。根据商业上的需要，批量的体细胞胚可以包括几百至几万个胚或更多。优选的是批量的体细胞胚包括基本为二倍体的体细胞胚或基本为四倍体的体细胞胚。一批体细胞胚简单地是一种从中排出了液体培养基的体细胞胚悬浮体，其中体细胞胚被置于合适的容器中。容器的周围环境有较高的相对湿度，例如100%，并维持于约0℃以上、最高到15℃的合适低温下。以这种方式贮存的体细胞胚可保持约4天。另一种方法，可将体细胞胚经过脱水干燥过程、冷冻、成粒、包裹于凝胶中等等。
本发明进一步提供了与胡萝卜属不同的体细胞胚悬浮培养物，该县浮培养物包括具有基本上相同倍性水平的体细胞胚。优选的体细胞胚是二倍体或四倍体。该体细胞胚源于双子叶或单子叶外植体材料。
现在通过下面的实施例举例说明本发明。专业人员将明白这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1 仙客来属细胞培养物胚形成的开始及由此形成的体细胞胚用70%乙醇将仙客来属“ConcertoScarlet”品种(Sluis和Groot)的种子进行表面灭菌(2分钟)，再用1.5%的次氯酸钠溶液表面灭菌(45分钟)，然后用无菌水彻底洗涤(3×)。使种子在湿纸上于23℃萌发2-4星期，并以露出来的块茎作为外植体材料。在旋转摇床(G10回旋摇床New Brunswick Scientific，Edison，N.j.VSA)上，在100rpm的转速、黑暗、23℃的条件下，将三个块茎于10ml的B5基础培养基(可从Duchefa Biochemie BV，Haarlem，The Netherlands购买)中培养，在该B5培养基中添加了20g/l蔗糖、10mg/l2，4-D、100mg/l肌醇、1.0mg/l烟酸、1.0mg/l盐酸吡哆素、10mg/l盐酸硫胺素。在7天后，用新鲜培养基替换上述培养基。再培养7天后，用新鲜培养基将该培养物稀释(5×)至体积为50ml。再培养7天后，从块茎外植体材料中分离出中央木髓，该部分包括从稀释的培养物获得的块茎外植体材料的维管束和中柱鞘，将块茎的其余部分除去，将上述分离出的材料再培养于补充了20g/l蔗糖、100mg/l肌醇、1.0mg/l烟酸、1.0mg/l盐酸吡哆素、10mg/l盐酸硫胺素、5mg/l2，4-D以及1mg/l激动素的25mlB5基础培养基中。将再培养物每周稀释2倍，共稀释4周。在约4周时出现了原胚形成群。按如上所述进一步再培养2周的时间以繁殖PEM。通过进一步在补充了20g/l蔗糖、100mg/l肌醇、1.0mg/l烟酸、1.0mg/l盐酸吡哆素、10mg/l盐酸硫胺素的无生长素和细胞激动素的B5培养基上培养，PEMs能发育为存活的、真正的体细胞胚。
实施例2仙客来属细胞悬浮培养物胚形成的开始及由此形成的体细胞胚用70%乙醇将仙客来属种子(品种Concerto Scharlaken Othello，Zaadunie BV)表面灭菌(2分钟)，再用1%次氯酸钠溶液表面灭菌(45分钟)，并用无菌水彻底洗涤(3×)。在23℃、黑暗条件下使种子在湿纸上萌发2-5星期。将露出来的块茎用作为外植体材料，并切成2-8段。根据De Laat A.A.M.等(1987)Plant Breeding 99∶303-307页描述的方法检测该外植体材料的倍性水平，并发现是二倍体。
在位于旋转摇床(100rpm)上的50ml烧瓶中，在黑暗和23℃的条件下，将来自三个块茎的外植体材料培养于补充了20g/l蔗糖、5mg/l2，4-二氯苯氧基乙酸以及1mg/l的激动素的10mlB5基础培养基(Duchefa Biochemie BV，Haarlem，荷兰)中。所有烧瓶都用铝箔覆盖。在培养一周后，在250ml烧瓶中，用补充了20g/l蔗糖、5mg/l2，4-D、100mg/l肌醇、1.0mg/l烟酸、1.0mg/l、盐酸吡哆素、10mg/l盐酸硫胺素以及1mg/l激动素的B5基础培养基将该培养物稀释5倍至体积为50ml。再培养2周后，该培养物含有PEMs，并用宽嘴吸管将该PEMs与培养物的其余部分分离开，并分开进行培养。通过肉眼观察鉴别到PEMs为细胞团块，它基本上由小而圆的胞质细胞组成。在这个阶段，鉴别到的PEMs或者为单个的细胞团，或者为相互粘附在一起的许多细胞团块。在250ml烧瓶中，利用一个宽嘴吸管，每隔两周将1ml聚集的细胞接种于B5基础培养基中至终体积为50ml，从而再培养该培养物，其中的B5培养基中补充了20g/l蔗糖、5mg/l2，4-D、100mg/l肌醇、1.0mg/l烟酸、1.0mg/l盐酸吡哆素、10mg/l盐酸硫胺素以及1mg/l激动素。通过将培养物样品在700xg离心2分钟而测得聚集的细胞团量(PCV)，即离心后的总细胞量PCV起始和PCV最后。使用Schlegel，H.G.(1981)Allgemeine Microbiologie，Thieme，Stuttgart，190页的公式，根据测得的PCV起始和PCV最后计算，通常胚形成细胞系生长约4-6天的倍增时间。将以该方法获得的胚形成细胞系维持至少45周，并且它在遗传上是稳定的，即倍性水平为二倍体，与原始外植体材料的倍性相同。
分别用孔径为250μm和100μm的尼龙网筛将PEM培养物过筛而选择PEMs。在再次培养8天后，得到最高量的PEMs/ml。该部分能进行最佳的胚发育过程，并且每个PEM培养物的PCV得到最大量的胚。所筛选到的PEMs的量的范围通常为1000到5.000PEMs/mlPCV。
在过筛后，洗涤PEMs并接种于发育培养基，即补充了浓度为174mM的蔗糖或葡萄糖的MS或B5培养基。将25至50PEMs/ml培养于用铝箔和nescofilm(Bando Chemieals Ind.LTD，日本)封口的一个烧瓶中。在3-4周后，形成了类似于合子胚的鱼雷状胚。使用该方法可生产250，000个胚。使用如DeLaat A.M.M.(上文)描述的流式细胞计数分析技术分析胚培养物的随机样品，估测500个体细胞胚的DNA含量。发现所有的胚都是二倍体。
仙客来胚的转变(即萌发)包括块茎形成接着形成不定根，并且这种转变可通过将胚培养于液体培养基中而诱导，所述液体培养基是分别含有约116mM或58mM的葡萄糖或蔗糖的MS或B5培养基。块茎形成的定义是从块茎或类似块茎结构的下胚轴进行发育。可在液体培养基或在诸如珍珠石、无菌土等的固体培养基中进一步发育生长出将形成第一片叶的子叶。
在无菌条件(存在一种碳源)或非无菌条件(未加入碳源)下将转变后的胚直接播种于珍珠石或盆载土壤中，并且在黑暗、18℃至20℃的条件下培养2-4星期后有子叶形成。采用较高的约90%的相对湿度。在无菌条件下，约90%以上的胚转变到子叶期。一旦出现子叶，便将得到的小植株置于光照条件下并锻炼植株的耐寒性，然后转移到温室中。
实施例3 蕃茄细胞培养物胚形成的开始用70%乙醇将蕃茄“Manhattan”品种(Sluis和Groot)的种子进行表面灭菌(2分钟)，并再用1.5%的次氯酸钠溶液表面灭菌15分钟，然后用无菌水彻底冲洗(3×)。将种子在浸湿的纸上，在23℃下萌发3天以上。收集完整幼苗，并将每个幼苗切成4段，然后将之用作为外植体材料。以这种方式剪切10个幼苗，并在一个旋转摇床上，在23℃、100rpm、以及16小时光照阶段和8小时黑暗阶段的循环条件下，将幼苗段在15ml液体基础B5培养基(可从Duchefa Biochemie BV，Haarlem，荷兰购买)中培养，该培养基中补充了20g/l的蔗糖、20mg/lNAA、1mg/l2，4-D、1mg/l激动素、100mg/l肌醇、1mg/l烟酸、1mg/l盐酸吡哆素以及10mg/l盐酸硫胺素。使用本领域已知的HPLC技术监测培养基中的生长素浓度。一旦生长素浓度降至0.1mg/l以下(大约在7天后出现)，即向其中加入15ml新鲜B5基础培养基(可从DuchefaBiochemie BV，Haarlem，荷兰购得)以将培养液体积补充至30ml，该B5培养基补充了20g/l蔗糖、20mg/lNAA、1mg/l2，4-D、1mg/l激动素、100mg/l肌醇、1mg/l烟酸、1mg/l盐酸吡哆素以及10mg/l盐酸硫胺素。每隔4-7天，通过使外植体材料和细胞沉降15分钟，并通过移走15ml使用过的培养基，再添加15ml新鲜培养基，使该培养物重新返鲜，从而将该培养物进行再培养。在外植体材料开始培养后约4-7周，观察到原胚形成群(PEMs)。通过按如上所述进一步再培养2周的时间以增殖PEMs。进一步将PEMs再培养于无生长素并按前面所述添加营养物，但未添加NAA、Z，4-D和激动素的B5基础培养基中，观察到真正的体细胞胚形成。
实施例4蕃茄细胞培养物胚形成的开始用70%乙醇将蕃茄种的“Majorca”品种(Sluis和Groot)的种子进行表面灭菌(2分钟)，再用1.5%的次氯酸钠溶液表面灭菌15分钟，然后用无菌水彻底冲洗(3×)。在23℃、黑暗条件下，使种子在浸湿的纸上萌发7天。采集子叶，将其剪成片段，以用作为外植体材料。将3个幼苗的6个子叶按这种方式剪切，并在旋转摇床上，在100rpm、23℃、黑暗中将上述叶片培养于15ml液体培养基A(见表1)，在A中补充了4mg/l2，4-D和0.5mg/l激动素。在14天后，加入35ml如上所述的含激素的新鲜培养基A(见表1)。每隔14天，将培养物稀释(2×)于添加了如上所述激素的新鲜培养基A(见表1)中而进行再培养。在外植体材料开始培养约4周后，观察到PEMs。通过按如上所述方法进一步进行再培养而增殖PEMs。
表1 培养基A的组成大量元素g/lNH4NO31.20(NH4)2SO40.66KH2PO40.55KNO31.01MgCl2·6H2O 0.30CaCl20.22柠檬酸 0.5蔗糖 20微量元素 2ml贮备液/l维生素Gamborg B5(1mg/l)1ml贮备液/l
用KOH(1M)将pH调至5.8微量元素(贮备液)g/lFeSO4·7H2O 6.9CuSO4·5H2O 0.65CoCl2·6H2O 0.12MnCl2·4H2O 2.97NaMoO4·2H2O 0.24KI 0.041HBO31.5ZnSO4·7H2O 4.3NiSO4·6H2O 0.39柠檬酸 2pH=2.3g24维生素Gamborg B5(Duchefa); 贮备液补充:
肌醇 100g/l烟酸 lg/l盐酸硫胺素 lg/l实施例5 黄瓜细胞悬浮培养物胚形成的开始及由此形成的体细胞胚用70%乙醇溶液将黄瓜“Pandorex”品种(Sluis和Groot)的种子进行表面灭菌(2分钟)，再用1.5%的次氯酸钠溶液表面灭菌(45分钟)，然后用无菌水彻底冲洗(3×)。在23℃将黄瓜种子在浸湿的纸上萌发2天。将从种子产生的胚根用作为外植体材料。在旋转摇床上，在100rpm、23℃、黑暗条件下，将15个胚根培养于10ml添加了20g/l蔗糖、2mg/l2，4-D以及1mg/l激动素以及维生素的MS基础液体培养基(可从DuchefaBiochemie，BV，Haarlem，荷兰购买)。利用本领域内已知的HPLC技术，监测培养基中的生长素浓度。在生长素浓度降至＜0.1mg/l(约在5天后)时，将该培养物于添加了维生素的基础液体MS培养基(可从Duchefa Biochemie，BV，Haarlem，荷兰购买)中稀释5倍至50ml，该培养基中添加了20g/l蔗糖、2mg/l2;4-D以及1mg/l激动素。通过第二周一次用添加有维生素的MS基础液体培养基(可从DuchefaBiochemie，BV，Haarlem，荷兰购买)稀释该培养物(2×)而将该培养物再培养，该培养基中添加了20g/l蔗糖、2mg/l2，4-D以及1mg/l激动素。8周后出现原胚形成群。
然后通过每隔2周将0.4ml聚集的细胞团接种于添加了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激动素的50ml培养基A(见表1)中而进一步再培养PEM培养物。按照Schlegel公式(如上文)测定的黄瓜细胞系的倍增时间约为2.7天。通过分别用孔径为150μm和100μm的尼龙网筛选该培养物而选择尺寸为100-150μm之间的PEMs。该100-150μm部分的PEM培养物的每个PCV能产生最高量的单个体细胞胚。从该细胞系得到的PEMs是二倍体或四倍体。按照用DeLaat A.A.A等人的方法(上文)测得的结果，在二年以上的时间内，在添加了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激动素的液体培养基A上二倍体细胞与四倍体细胞的比例保持不变。PEMs产生二倍体植株，也产生四倍体植株。不仅在PEMs，也在植株中反映出上述测得的二倍体与四倍体的比例。
通过在添加了20克蔗糖和5μM ABA的无生长素和细胞激动素的MS培养基中培养PEMs而将PEMs发育为真正的体细胞胚。
实施例6 处理黄瓜胚形成细胞系以获得100%二倍体或100%四倍体的悬浮培养物实施例5中的悬浮液由二倍体和四倍体PEMs组成，可以发育为有相同倍性水平的胚。
从由实施例5的方法开始培养得到的13周龄的细胞悬浮液中逐个挑选出直径约为2mm的单个PEMs。按照De Laat等人(1987)Plant Breeding 99，303-307页所述方法测量各个PEMs的倍性水平。结果显示PEMs或者是100%二倍体，或者是100%四倍体。进一步在如实施例5所述的MS基础液体培养基中将单个PEMs培养15周的时间(即每二周一次地进行再培养)，用De Laat等人的方法(上文)测得由此产生的细胞系由100%二倍体或100%四倍体组成。二倍体PEMs产生二倍体胚和二倍体植株。四倍体PEMs产生四倍体胚和四倍体植株。
实施例7 处理黄瓜胚形成细胞以获得100%二倍体或100%四倍体的悬浮培养物在无菌条件下使用实施例3的方法，培养黄瓜“Pandorex”品种(Sluis和Groot)植株。将大小约为1cm的子房用作为外植体。按照De Laat等人的方法(上文)检测倍性水平，结果表明该外植体全部是二倍体。将大约一半的果实切成厚约0.5mm的薄片，并在旋转摇床上，在100rpm、23℃、黑暗条件下，将上述薄片培养于10ml加有维生素的MS基础液体培养基(可从Duchefa Biochemie，BV，Haarlem，荷兰购买)中，该培养基中添加了20g/l蔗糖、2mg/l2，4-D以及1mg/l激动素。利用本领域内已知的HPLC技术监测该培养基中生长素的浓度。在约5天后，生长素浓度降至＜0.1mg/l时，用添加了维生素的MS基础液体培养基(可从Duchefa Biochemie，BV，Haarlem，荷兰购买)将该培养物稀释(5×)至50ml，该培养基中还添加了20g/l蔗糖、2mg/l2，4-D以及1mg/l激动素。通过每二周一次将该培养物用按如上所述添加了营养物的MS培养基稀释(2×)，从而再培养该培养物。
8周后出现原胚形成群体。按实施例5所述方法将该PEM培养物培养于添加了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激动素的培养基A(表1)中。将0.4ml聚集细胞团接种于添加了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激动素的50ml培养基A中。用Schlegel公式(见上文)测得在培养基A(表1)中黄瓜细胞系的倍增时间约为2.7天。按照De Laat等人的方法(上文)测定PEM悬浮液的倍性水平，并发现是二倍体。通过用尼龙网筛筛选培养物而挑选出尺寸为100-150μm的PEMs。通过将选择出的PEMs在不含生长素和细胞激动素并添加了20g/l蔗糖的MS培养基上培养而使PEMs发育为真正的体细胞胚。利用该方法，在四周内从该培养物制备了200，000个胚。使用DeLaat等人的方法(上文)发现随机选出的500个体细胞胚的倍性水平几乎都是二倍体。
实施例8 稳定PEM悬浮液的倍性水平的维持在添加了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激动素的培养基A(表1)中培养黄瓜PEM悬浮液。在再培养期间，在每一个再培养步骤中都将大量元素和微量元素维持于超过PEM所需量以上，以便在再培养期间(即2周)不会出现缺乏这些元素的现象。以同样方式维持生长素水平(即10mg/l2，4-D)。在再培养开始时向培养基中加入激动素(即0.5mg/l)并在4天时内使其在培养基中耗尽。使用本领域内已知的HPLC技术监测整个时间内生长素的浓度，以确保该悬浮液的发育阶段固定在PEM水平上。在添加了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激动素的培养基A(表1)中将胚形成二倍体PEM悬浮液维持至2年，并显示出稳定的倍性水平。将胚形成的四倍体PEM悬浮液维持6个月，显示有稳定的倍性水平。直至胚发育开始，始终维持于该倍性水平。
实施例9 糖甜菜PEM悬浮培养物胚形成的开始以及由此形成的体细胞胚用70%乙醇溶液将糖甜菜种子(Hilleshog AB，瑞典)表面灭菌(2分钟)，再用1.5%次氯酸钠溶液表面灭菌(45分钟)，然后用无菌水彻底冲洗(3×)。使糖甜菜种子在23℃、湿纸上萌发7至14天。将萌发种子的子叶用作为外植体材料。在旋转摇床上，在100rpm、黑暗、23℃条件下，将6个子叶培养于添加了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激动素的10ml液体培养基A(表10)中。在1或2周后，用补充了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激动素的液体培养基A(表1)将该培养物稀释5倍至50ml。每二周一次用按如上所述添加营养物的培养基A(表1)稀释该培养物或用按如上所述添加营养物的新鲜培养基A替代该培养基而将该培养物进行再培养。在4至6周后，在外植体组织上出现体细胞胚。从外植体中挑选出胚，并分别进行培养。4周后，培养的胚产生PEMs。通过补充添加了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激动素的表1中的培养基A而进一步再培养该PEM培养物。
通过首先用孔径为500μm的尼龙网，再用孔径为100μm的尼龙网筛选PEM悬浮液而收集PEMs，通常100-500μm大小的PEM部分主要产生单个的体细胞胚。将该PEMs培养于无生长素和细胞激动素并按如上所述方式添加了营养物的培养基A中并发育为真正的体细胞胚。
实施例10 辣椒PEM悬浮培养物胚形成的开始用70%乙醇溶液将辣椒(Sluisen Groot的Gedeon品种)种子进行表面灭菌(2分钟)并再用1.5×次氯酸钠溶液表面灭菌(45分钟)，然后用无菌水彻底冲洗(3×)。使辣椒种子在23℃、湿纸上萌发7-14天。用已萌发种子的子叶作为外植体材料。在旋转摇床上，在100rpm、黑暗、23℃的条件下，将6片子叶培养于补充了10mg/l2，4-D的10ml液体培养基A(表1)中。在二周后将该培养物稀释5倍至50ml。通过每二周一次按如上所述稀释培养物(2×)或用补充了10mg/l2，4-D的新鲜液体培养基A(表1)代替该培养基而再培养该培养物。在2-4周后，在外植体的切口边缘出现了胚。从外植体上拿走胚，并将胚从培养物中移走，再培养于补充了4mg/l2，4-D和0.5mg/l玉米素的液体培养基A(表1)。4周后出现原胚形成群。通过按如上所述进一步再培养而增殖PEMs。按实施例5所述将悬浮液过筛而收集PEMs。100-500μm尺寸的部分主要产生单个体细胞胚。将PEMs培养于无生长素和细胞激动素的培养基A(表1)中。
实施例11堇菜PEM悬浮培养物胚形成的开始以及由此形成的体细胞胚用70%乙醇溶液将堇菜(Sluisen Groot的Deltaviolet品种)种子表面灭菌(2分钟)再用1.5%的次氯酸钠溶液表面灭菌(30分钟)，然后用无菌水彻底冲洗(3×)。使堇菜种子在湿纸上于23℃萌发7至14天。将已萌发种子的子叶用作为外植体材料。在一个旋转摇床上，在100rpm、23℃和黑暗条件下，将6片子叶培养于添加了4mg/l2，4-D和0.1mg/l激动素的10ml液体培养基A(表1)中。在二周后用添加了4mg/l2，4-D和0.1mg/l激动素的液体培养基A(表1)稀释(5×)该培养物至50ml。通过每二周一次稀释该培养物(2×)或用添加了4mg/l2，4-D和0.1mg/l激动素的新鲜液体培养基A(表1)替代该培养基而再培养该培养物。在8-10周后，出现了原胚形成群。通过按如上所述方法进一步再培养而增殖该PEMs。按实施例5所述方法特培养物过筛而收集PEMs，所不同的是所使用的尼龙网筛孔径是50μm和250μm。在无生长素和细胞激动素并按如上所述添加营养物的培养基A中培养PEMs并发育为单个的体细胞胚。
实施例12天竺葵PEM悬浮培养物胚形成的开始用70%乙醇溶液将天竺葵种子(Sluisen Groot的Puisar red品种)进行表面灭菌(2分钟)，再用1.5%的次氯酸钠溶液表面灭菌(30分钟)，然后用无菌水彻底冲洗(3×)。使天竺葵种子在湿纸上于23℃萌发7-14天。以萌发的种子的子叶用作为外植体材料。在旋转摇床上，在100rpm、23℃温度、黑暗条件下，将6个子叶培养于添加了4mg/l2，4-D和0.1mg/l激动素的10ml液体培养基A(表ⅰ)中。在一周后，用添加了4mg/l2，4-D和0.1mg/l激动素的液体培养基A(表1)将该培养物稀释5倍至50ml。通过每二周一次用添加了4mg/l2，4-D和0.1mg/l激动素的液体培养基A(表1)将该培养液稀释(2×)或用按如上所述添加了营养物的新鲜培养基A替代该培养基而将培养物进行再培养。
在4-6周后出现了原胚形成群。按如上所述方法进一步再培养以增殖PEMs。按实施例5所述筛分悬浮液而收集PEMs，但其中使用的尼龙网的孔径为250μm和50μm。大小为50-250μm的PEM部分主要产生单个体细胞胚。将该PEMs培养于不含生长素和细胞激动素的培养基A(表1)中并发育为单个的体细胞胚。
实施例13在生物反应器中扩增PEM生物量从按实施例5所述再培养的黄瓜PEM悬浮培养物中收集4×8mlPCV并接种于4个生物反应器(ApplikonDependable Instruments B.V.)中，其中包括二个安装了旋转混合器的2升常规生物反应器以及二个安装了振动混合器(从Chemap AG购买)的生物反应器，每个反应器中含有补充了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激动素的1升培养基A(表1)。由设置在振动器杆(位置朝向反应室底部)末端的一个孔径为15μm的多孔喷射装置将空气喷到振动混合反应器中。按本领域内已知的标准技术测定其中一个振动混合反应器中溶解氧的浓度为40%，另一个反应器中为97%。垂直安装的振动混合器运转的频率为50Hz，最大振幅为±6mm。如此安装振动混合器是为了使振动混合器在垂直平面上运动并且水平方向的运动保持于最小程度。搅拌盘安装于振动杆的末端以便使液体按照从反应器四周汲取细胞悬浮液流向底部再往上翻的流动回路流动。
在常规的生物反应器中，由位于生物反应器底部的安装了一个15μm的多孔喷嘴的喷射管将空气喷到反应器中。按上面所述测得溶解氧浓度分别为40%和97%。旋转混合器的搅拌速度保持于约150rpm±50rpm。
在接种6天后测定倍增时间，从PEM悬浮液中筛分PEMs并按实施例5所述测定PEMs/mlPCV。
使用振动混合器可以在每单位体积中产生较大量的PEMs(表2，

图1)。
表2仪器 倍增时间 PEMs/ml PCV(天)旋转混合器 2.3 200(40% DO2)(1)旋转混合器 2.7 620(97% DO2)振动混合器 2.8 2284(40% DO2)振动混合器 3.3 3710(97% DO2)(1)DO2=溶解的氧实施例14在振动混合器中增殖PEM生物量从实施例3所述的经过再培养的黄瓜PEM悬浮培养液中收集2×8ml PCV并接种于二个振动混合反应器(Applikon Dependable Instruments B.V.)中，其中包括安装了可从Chemap A G.购得的振动混合器的二个2升生物反应器。一个生物反应器含有补充了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激动素的1升培养基A(表1)，另一个反应器也含有按如上所述添加营养物(不同的是蔗糖浓度为55g/l)的1升培养基A。由设置在靠近反应室底部的振动器杆末端的一个孔径为15μm的多孔喷射装置将空气喷射到振动混合反应器中。按本领域内已知的标准技术测出溶解氧的浓度为97%。振动混合器以50Hz频率以及±6mm的最大振幅运转。振动混合器的定位要能使振动在垂直平面上进行而侧面或水平方向的运动则保持最小程度。将搅拌盘固定于振动杆的末端，以使液体按照从反应容器四周汲取细胞悬浮液流向底部再向上翻的流动回路流动。
接种6天后测定倍增时间，从PEM悬浮液中筛分出PEMs，并按实施例5所述测定PEMs/mlPCV。结果示于表3中。
表3仪器 倍增时间 PEMs/ml PCV(天)振动混合器 3.3 2284(97%,20g/l 蔗糖)振动混合器 2.9 6000(97%,55g/l 蔗糖)实施例15来自搅拌生物反应器与振动混合生物反应器的PEMs的存活力随时间变化的比较从实施例5所述的经再培养的黄瓜PEM悬浮培养物中收集3×8mlPCV，并接种于3个生物反应器(ApplikonDependable Instruments B.V.)，其中包括一个安装了旋转混合器并含有添加了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激动素的1升培养基A(表1)的常规的2升生物反应器，以及2个安装有从Chemap AG购买的振动混合器的生物反应器，在后两个反应器中，其中之一含有按前面所述添加营养物的1升培养基A，而另一个也含有按前面所述添加营养物的1升培养基A，但是其中蔗糖浓度为55g/l。
由设置在朝向反应室底部的振动器杆末端的一个孔径为15μm的多孔喷射装置将空气喷到振动混合器反应器中。按本领域已知的标准技术测得振动混合器中溶解氧的浓度为97%。振动混合器以50Hz的频率以及±6mm的最大振幅进行运转。振动混合器的定位使得振动运动位于垂直平面上而水平振动运动保持于最小程度。将搅拌盘安装于振动杆的末端以便使液体按照从反应器四周汲取细胞悬浮液流向底部，然后向上翻的流动回路进行流动。
在生物反应器的底部由一个安装有孔径15μm的多孔喷嘴的喷射管将空气喷射到常规生物反应器中。按上面所述测出溶解氧浓度约为97%浓度。旋转混合器的搅拌速度维持于约定150rpm±50rpm。
PEMs/ml PCV在培养开始时测定，倍增时间在6天和14天时按实施例5所述测定。
结果表明搅拌型生物反应器中PEMs的数量随时间显著降低，而在振动混合器中当蔗糖浓度为20g/l时，整个时间内PEMs的量几乎维持不变。还表明在蔗糖浓度为55g/l时，在6天内PEM量增至3倍(表4)。
表4仪器 PEMs/ml PCV0天 6天 14天旋转混合器 2300 800 40(97%,20g/l 蔗糖)振动混合器 2300 2300 2280(97%,20g/l 蔗糖)振动混合器 2300 6000 6000(97%,55g/l 蔗糖)
实施例16在生物反应器中PEMs发育为鱼雷期的体细胞胚从实施例15所述的经再培养的黄瓜PEM悬浮培养物(55g/l蔗糖，vb/97%DO2)中收集2×100，000筛分的PEMs，并接种于2个生物反应器(Applikon Dependabie instruments B.V.)中，其中包括一个安装有旋转混合器的常规的2升生物反应器，以及一个安装有可从Chemap AG购买的振动混合器的生物反应器，二个反应器各含有1升含20g/l蔗糖，以及浓度为5.0μmABA的MS培养基。由设置在振动杆(定位于反应室底附近)的末端的一个孔径为15μm的多孔喷射装置将氧气喷射到振动混合反应器中。按照本领域内已知的标准技术测得振动混合器中的氧浓度为97%。振动混合器以50Hz频率以及±6mm的最大振幅运转。振动混合器的定位使得振动在垂直平面上进行并且水平方向的运动保持于最小程度。将搅拌盘安装于振动杆的末端，以便使液体按照从反应器四周汲取PEMs流向底部再往上翻的流动回路流动。
在常规生物反应器的底部由安装了一个孔径为15μm的多孔喷头的喷射管将空气喷到该反应器中。按上面所述测得溶解氧浓度在起始时为97%，并在7天后使之降至30%±5%。在第8天，使溶解氧浓度回升至97%，并维持于该水平。旋转混合器的搅拌速度维持于约190rpm±5rpm。
常规生物反应器中PEM发育为充分生长的有用的鱼雷期的体细胞胚的效率为10-15%。振动混合生物反应器中PEM发育为充分生长的有用的鱼雷期的体细胞胚的效率大于20%。有用的鱼雷期体细胞胚是一种产生正常外观的植株的胚。
实施例17由体细胞胚产生的仙客来植株的形态学稳定性通过将体细胞胚置于盆栽土壤中而将由实施例2的F1杂种衍生的仙客来体细胞胚转变为小植株。在第一片叶形成后，将小植株转移到温室中并生长至成熟。使植株生长到开花阶段。对开花的植株进行形态学检测，未观察到这些植株有异常情况。在植株中也未观察到由于遗传不同而产生的体细胞克隆的变异。
实施例18由体细胞胚衍生的黄瓜植株中体细胞克隆的遗传变异在Sorbarod plugs(Baumgartner papier，Switzerland)上将由F1杂种植株衍生的实施例6的体细胞胚转变为植株，并生长至结果实植株。利用De Laat A.A.等人的方法(上文)测定80个植株的倍性水平。所有植株都有相同的倍性水平并且未观察到体细胞克隆遗传变化的差异。
实施例19黄瓜体细胞胚转变为植株在装备了振动混合器的生物反应器中，在低光照强度下扩增黄瓜PEMs，过筛(100-150μm)，并以每50mlMS培养基5000PEMs的密度接种于Erlenmeyer烧瓶中，其中的MS培养基中补充了20g/l蔗糖以及5μM ABA。将PEMs分成二(2)批，使它们进一步在光照和黑暗中发育为体细胞胚。
使这二批体细胞胚均在光照条件下转变为植株。结果表明，由黑暗中培养的PEMs衍生的体细胞胚转变为植株的效率高于在光照条件下发育的体细胞胚的转变效率(表5)。
表5光照条件 总体鱼雷状胚转变为植株的效率
%光照 28.6黑暗 62.7实施例20 PEM凝集体的大小与形成适于转变为植株的单个鱼雷状胚的关系将上述实施例5中所述的用添加了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激动素的培养基获得的9天龄的PEM悬浮液(PEM浓度为50ml PCV/L)用尼龙筛过筛，并用三个不同的筛分别过筛三次，以获得三种尺寸不同的PEM部分100-150μm，150-200μm，以及200μm-250μm。在含有3μm ABA的MS培养基中，在约25-50PEMs/ml的PEM起始浓度下进行胚发育。在发育9天后，在光学显微镜下估测培养物中鱼雷期胚的数量。估测单个鱼雷状胚的数目与多体鱼雷状胚的数目的关系。鱼雷状胚/PEM的比例为5-15%。尺寸＜100μm的部分不含有PEMs。结果示于表6。
表6过筛后部分的尺寸 单个鱼雷状胚占总数的百分比(μm) %100-150 85150-200 20200-250 5用手工操作法从100-150μm尺寸部分中分离出单个鱼雷状胚，并使它们转变为单个植株。
权利要求
1.促使外植体材料形成原胚形成群(PEM)的方法，其中PEMs能够产生存活的体细胞胚，其特征在于将非愈伤组织外植体材料置于一种液体植物组织培养基中，该培养基含有有效量的足以诱导原胚形成群(PEM)形成的生长素或生长素混合物。
2.在悬浮培养物中获得具有基本上相同的倍性水平的体细胞胚的方法，该方法包括(ⅰ)将外植体材料培养于一种液体培养基中，该培养基含有有效量的足以促使诱导出原胚形成群(PEM)形成的生长素或生长素混合物;(ⅱ)在一种含有生长素的合适的液体培养基中扩增在(ⅰ)中获得的PEMs的数目;(ⅲ)收集(ⅱ)中获得的PEMs并将它们置于基本上不含生长素的液体培养基中;以及(ⅳ)收集由(ⅲ)中的PEMs产生的体细胞胚。
3.根据权利要求2的方法，该方法包括在步骤(ⅲ)中使用经过尺寸选择且富含存活的PEMs的PEMs。
4.根据权利要求1至3的方法，其中的液体培养基进一步含有一种浓度在约15g/l和90g/l之间的碳水化合物能源。
5.根据权利要求4的方法，其中碳水化合物能源的浓度在约20g/l和60g/l之间。
6.根据权利要求4或5的方法，其中碳水化合物能源选自蔗糖、葡萄糖和棉子糖。
7.根据权利要求1-6的方法，其中在振动混合器中振动含有生长素的PEM悬浮物。
8.根据权利要求7的方法，其中振动混合器在基本上垂直的平面上振动。
9.根据权利要求1至8中任一顶所述的方法，其中的外植体材料是由原生质体、茎、叶、花瓣、下胚轴区、顶端分生组织、合子胚本身、块茎、维管束、中柱鞘、子房或花药丝衍生而得。
10.从非胡萝卜属植物材料获得的体细胞胚悬浮培养物，包括具有基本上相同倍性水平的体细胞胚。
11.根据权利要求10所述的体细胞胚悬浮培养物，含有基本上为二倍体的体细胞胚。
12.根据权利要求10所述的体细胞胚悬浮培养物，含有基本上为四倍体的体细胞胚。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的悬浮培养物，其中体细胞胚由从双子叶或单子叶外植体材料产生的PEMs衍生而得。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的悬浮培养物。其中体细胞胚选自仙客来属、南瓜属、蕃茄属、葱属、秋海棠属、甜菜属、报春花属、芸苔属、辣椒属、菊苣属、扶郎花属、凤仙花属、莴苣属、稻属、天竺葵属、碧冬茄属、堇菜属以及玉蜀黍属。
15.根据权利要求14所述的悬浮培养物，它来自于双子叶外植体材料。
16.根据权利要求15所述的悬浮培养物，它选自仙客来属、南瓜属、甜菜属、芸苔属、堇菜属、天竺葵属以及辣椒属。
17.含有基本上由二倍体细胞组成的PEMs的悬浮培养物。
18.具有基本上相同倍性水平的非胡萝卜属体细胞胚。
19.根据权利要求18所述的体细胞胚，包含基本上都为二倍体的体细胞胚或基本上都为四倍体的体细胞胚。
20.由权利要求2-19所述的体细胞胚产生的植株。
全文摘要
体细胞胚的悬浮培养物以及含有体细胞胚的原胚形成群(PEMs)的悬浮培养物(该PEMs具有基本上相同的倍性水平)，由此产生的植株，以及获得所述体细胞胚的方法。
文档编号C12N5/04GK1092107SQ9410061
公开日1994年9月14日 申请日期1994年1月14日 优先权日1993年1月15日
发明者赫里特·扬范霍尔斯特, 马克·克罗伊格, 维尔特·范德梅尔, 埃里克·波斯特马, 罗布·阿比斯蒂 申请人:S及G种子有限公司