专利名称：纤连蛋白结合蛋白；单克隆抗体以及它们对防止细菌粘附的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的多肽和单克隆抗体，它们的制备以及在防止伤口、外科移植和其它内置器械(如导管)部位的感染方面的应用。本发明还涉及编码这个多肽的核酸的分离以及将编码这个多肽的DNA转化重组的宿主细胞。
与移植材料和内置器械的临床应用相关的主要并发症之一是细菌感染。特别是葡萄球菌经常影响到与医疗装置相关的感染(Dankertet al 1986，CRC Rev Biocompatability 2，219-301)。感染一旦发生实际上是不能治愈的而导致移植失败。
有人曾经提出微生物对表面的粘附是形成这类感染的最初步骤(Quie and Belani，1987，J.Infec.Dis 156543-547)，而且目前有证据表明外体感染的发病机理是一种特殊的粘附机制(Vaudaux，et al，1990，J.Biomat.Appl.5134-153)。内置材料，如用于静脉插管和假体移植的材料，在与血液接触不久，便马上被覆盖一层细胞外基质蛋白(Cottanaro et al 1981，Transactiohs of the American Society for Artificial InternalOrgans 27391-395)，特别是该层包含血浆纤连蛋白，而且葡萄球菌被认为能够通过细菌细胞表面受体蛋白-纤连蛋白结合蛋白(Fbp)与纤连蛋白结合。然而，一些研究表明血液蛋白不促进葡萄球菌对生物材料的粘附(eg.Muller et al 1991，Infect.Immun.593323-3326)，因此阻止了对这些细菌和这些蛋白相互作用的研究，而它有可能成为防止对生物材料粘附的手段。
纤连蛋白结合蛋白已从金黄色酿脓葡萄球菌中分离出来，继而核苷酸顺序也得到确定[Signas，C.et al，(1989)Proc.Nat.Acad.Sci 86，699-703，Jonsson，K.et al，(1991)Eur.J.Biochem.202，1041-1048](分别是FbpA和FbpB)。这个蛋白主要的纤连蛋白结合区已确定是一个同源单位(一般是38个氨基酸)重复三次(D1-D3区域)，部分重复第四次(D4区域)。
阻挡葡萄球菌对移植体粘附先试验了为阻挡蛋白的粘附而进行的对假体材料表面的修饰，如覆盖一层“无粘性”的材料(如PTFE)，或表面联上抗生素(Kamal et al，1991，J.Amer.Med.Assoc.265，2364-2368)。
也有建议使用非甾类抗炎药物来阻止葡萄球菌对医疗聚合物的粘附(Farber and Wolff 1992，J.Infect.Dis.166861-865)。
EP 0163623，EP 0294349，EP 0397633和WO92/02555公开了某些从金黄色酿脓葡萄球菌分离的纤连蛋白结合多肽。
本发明采用的一个方法是用一种结合在基质结合蛋白如纤连蛋白结合蛋白的单克隆抗体，来阻断细菌对基质蛋白的粘附。
因此，本发明在一个广义的方面是指一种单克隆抗体(Mab)的应用，或者它的一个片段，它们与基质结合蛋白的一个或多个抗原决定簇结合以防止细菌尤其是革兰氏阳性菌的粘附，也可与内置设施或伤口的细胞外基质蛋白结合。本发明特别涉及这些用途的药剂的制作。
单抗或其片段的作用是封闭与基质蛋白的结合有关的基质结合蛋白上的部件。
内置设施包括外科移植、假体设备和导管即导入病人身体并在某个部位保留一段持续时间的装置。这种装置包括例如人工关节、心脏瓣膜、起搏器、血管移植、血管导管、脑脊髓液体分流器、尿导管、连续非卧床腹膜透析(CAPD)导管等。
本发明特别涉及单克隆抗体的应用，它将阻止如金黄色酿脓葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌以及表皮葡萄球菌等葡萄球菌对这些内置设施之粘附。因此，该单克隆抗体最好针对从这些细菌分离的基质结合蛋白的抗原决定簇。
该单克隆抗体识别的基质结合蛋白最好是纤连蛋白结合蛋白。已知纤连蛋白结合蛋白中D1-D4区域尤其适于与纤连蛋白结合(Signas.C.et al.1989 op.cit)。
因此，在优选的实施例中单克隆抗体对应纤连蛋白结合蛋白D1-D4结构域上的某抗原决定簇或它的某一组成单元。
上述新的单克隆抗体以及它们的片段构成发明的另一方面。
抗体可以是分子量约为150,000的完整抗体或一个它的衍生物，比如象Skerra，A.and Pluckthun，A(1988)Science 240 1038-1040.所述的Fab片段或Fv片段。如果存在两个抗原结合区域，每个区域可对应不同的抗原决定簇——称作“双特异”抗体。
该抗体或其衍生物可由常规方法制得，如通过已建立的单抗技术(Kohler，G.and Milstein，C.(1975)，Nature，256，495-497)或用重组方法如建立文库(Huse，W.D.et al.，(1989)Science246，1275-1281)。
优选该抗体或其衍生物通过在一个合适的表达系统编码目的抗体的DNA多聚体的表达制得。表达系统的载体选择一部分由宿主决定，宿主可以是原核细胞如大肠杆菌(最好是B株)sp.链霉菌或者真核细胞，如小鼠C127、小鼠骨髓瘤、人Hela细胞、中国仓鼠卵巢细胞、丝状或单细胞霉菌或昆虫细胞。宿主也可以是转基因动物或转基因植物[如Hiatt，A et al，(1989)Nature 34，76-78所述]。合适的载体包括质粒、噬菌体、装配型质粒以及如从杆状病毒和牛痘中分离来的重组病毒。
Fab片段也可以通过酶处理从其母体单抗得到，例如用香本瓜酶从Fc部分切割Fab部分。
单抗最初可利用纤连蛋白结合蛋白或其D1-D4区域作免疫原得到。
金黄色酿脓葡萄球菌的纤连蛋白结合蛋白已知存在于至少两个变异株Fbp A和Fbp B中[Jonsson et al，(1991)，op.cit.]。
上述纤连蛋白结合蛋白任一种的结合区域都可用作免疫原来产生本发明的一种Mab。
我们相信我们已确证金黄色酿脓葡萄球菌J2385的一种新纤连蛋白结合蛋白是一个新化合物(特见实施例2)。
特别是我们已经分离到一种新化合物，一种基本包含金黄色酿脓葡萄球菌J2385 Fbp的D1-D4区域的多肽。
金黄色酿脓葡萄球菌J2385已存放在National Collection ofIndustrial and Marine Bacteria Ltd.(NCIMB)，阿伯丁，苏格兰，号码为NCIMB 40532，日期为1992年12月18日。
D1-D4区域具有列于下面表2的氨基酸顺序。
这种新的Fbp和D1-D4多肽以及它们抗原性或免疫学上等同的衍生物形成本发明的一个更深入的方面。
在此使用的术语“抗原上等同的衍生物”包含一种肽或其等价物，它们能特异地被某种抗体识别，依据本发明当抗体聚集多肽时，可阻止葡萄球菌对内置医疗设施的粘附。
在此使用的术语“免疫学上等同的衍生物”包含一种肽或其等价物，当它们被用于一种合适的组合在某种脊椎动物中产生抗体，则该抗体起到阻止葡萄球菌对内置医疗设施的粘附。
特别地，比本发明肽链稍长或稍短的衍生物也可以使用。除此之外，在肽链合成前或后一个或多个氨基酸残基被修饰也可使用。这些肽可以通过如取代、加成、或氨基酸重排或它的化学修饰来制备。所有这些取代和修饰作用基本上被肽化学领域的技术人员熟知。
D1-D4多肽可以通过质粒pBROC520在大肠杆菌中的表达得到。这种质粒的制备以及D1-D4多肽的表达和纯化在下面的实施例中描述。
编码此多肽的DNA是本发明的另一方面。核苷酸顺序在下面表1中列出。
其它D1-D4多肽，如FbpA和FbpB的D1-D4多肽能类似地通过从染色体DNA得到合适质粒的类似物而得到表达。
编码FbpA D1-D4多肽的DNA见下面表1。
该D1-D4多肽或某种抗原性或免疫学上等同的多肽或它的某种融合蛋白作为一种抗原用于免疫小鼠、或如大鼠、鸡的其它动物。融合蛋白提供对多肽的稳定性。抗原可通过如结合与某种免疫原载体蛋白，如牛血清清蛋白(BSA)或锁眼帽贝血蓝蛋白(KLH)结合。或者由多拷贝的D1-D4多肽或其抗原性或免疫学上等同的多肽组成的某种多抗原肽也可有足够的抗原性来改善免疫原作用以排除载体的使用。
用Kohler和Milstein(1975Nature256，495-497)的方法，被免疫哺乳动物中的含有抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合产生分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。
该杂交瘤经过筛选，选择一种与其它葡萄球菌属有高结合亲合力和较好交叉反应的细胞株，用一种或多种原始Fbp、D1-D4多肽和/或融合蛋白来筛选。选好的细胞株被培养来得到需要的Mab。
分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株是本发明的另一方面。
此外，噬菌体显示技术也能用来选择具有对Fbp或D1-D4结合活性的抗体基因，它可从已筛选具有抗Fbp的人淋巴细胞经PCR扩增的全部v-基因或原文库中选择(McCafferty，J.et al.，(1990)，Nature348，552-554；Marks，J.et al，(1992)Biotechnology10，779-783)。这些抗体的亲合性也能通过链混合提高(Clackson，T.et al，(1991)Nature 352，624-628)。
抗体或其衍生物最好经修饰，在病人体内具较小免疫原性。例如，假如病人是人，抗体最好是“人性化”的；在此，杂交瘤产生的抗体的互补决定区移植到人的单克隆抗体中，实例见Jones，P.et al(1986)，Nature 321，522-525或Tempest et al.，(1991)，Biotechnology 9，266-273。
修饰不必限于一种“人性化”，也可用其它的灵长目动物序列(实例见Newman，R.et al.1992，Biotechnology，10，1455-1460)。
抗体应该再次筛选，以对Fbp，D1-D4多肽和/或融合蛋白具高亲合力。
如上所述，要制备最终抗体的一个片段。
人化单克隆抗体或它的具有结合活性的片段形成本发明的另一方面。
在另一更广的方面，本发明提供了从金黄色酿脓葡萄球菌Fbp中分离D1-D4多肽和它在防止细菌尤其是革兰氏阳性菌对内置设施或伤口的细胞外基质蛋白的粘附。本发明进一步涉及此用途药剂的制作。
特别地，革兰氏阳性菌包括葡萄球菌如金黄色酿脓葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌如表皮葡萄球菌。
分离的D1-D4多肽是指一种序列上包含整个D1、D2、D3和D4区任选在PIVP终止并且从金黄色酿脓葡萄球菌Fbp的1-5壁区(WR)中任选的多肽。
依宿主表达系统，多肽可包含一个N-末端蛋氨酸残基。
对应下列FbpA区的上述区域在Signas et al.(1989)，op.cit.描述D1 G709-H746 WR1 P843-T856D2 G747-H784 WR2 P857-T870D3 G785-S823 WR3 P871-T884D4 G824-P838 WR4 P885-K898WR5 P899-K912最好的情况下，多肽包含最多三个壁区。优选实施例包括对应金黄色酿脓葡萄球菌FbpA G709到T886和G709到P838(P838→T任选)的残基。Fbp优选自金黄色酿脓葡萄球菌J2385具有表2所给序列。
本发明也提供编码多肽的分离的核酸分子，包括mRNAs，DNAs和cDNAs。
本发明还提供重组载体，如在多肽的重组生产和包含新核酸序列的原核和/或真核细胞重组中有用的克隆和表达质粒。
本发明还提供包含编码多肽的一种核酸分子的转移基因非人的动物。
“复制子”是任何遗传元件(如质粒、染色体、病毒)，其功能为体内DNA复制的独立单位；即能够自主复制。
“载体”是一个复制子，如质粒、噬菌体或装配型质粒，另一个DNA片段可以连接到它上面从而使连接片段得到复制。
“双链DNA分子”指脱氧核苷酸(碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)在一种双链螺旋(松驰和超螺旋)的聚合形式。这个术语只指分子的一级和二级结构，并不限制其特殊的三级形式。因此，这个术语包括发现的双链DNA，特别在线性DNA分子(如限制性片段)、病毒、质粒和染色体。在讨论尤其是双链DNA分子的结构中，这里描述的序列依据通常惯例只给沿DNA非转录链5′到3′方向的序列(即具有该序列的链与mRNA同源)。
某种蛋白的DNA“编码序列”或“编码核苷酸序列”是当置于适宜的调节序列控制下能转录和翻译成某多肽的DNA序列。
“启动子序列”是一个在细胞中能结合RNA聚合酶并启动下游编码序列(3′方向)转录的DNA调节区。为了限定本发明，启动子序列通过编码序列的翻译起始密码子(如ATG)连在3′末端并向上游(5′方向)延伸，包含在高于背景的可检测水平上启动转录所必需的最小数量的碱基或元件。在启动子序列中将发现一个转录启动部位(用核酸酶S1可方便地确认)和结合RNA聚合酶的蛋白结合区域(交感序列)。真核细胞的启动子通常但不总是包含“TATA”盒和“CAT”盒。原核细胞的启动子除10和-35交感序列外包含Shine-Dalgarno序列。
DNA“控制序列”总指启动子序列、核糖体结合部位、多聚腺苷化信号、转录终止序列、上游调控区、增强因子和其它在宿主细胞中为表达(即转录和翻译)某编码序列所需的类似成份。
控制序列在细胞中指导编码序列的表达，这时RNA聚合酶与启动子序列结合并将编码序列转录到mRNA，然后翻译成编码序列的多肽。
“宿主细胞”是一种已被转化或转染或者能被外源DNA序列转化或转染的细胞。
当某种外源DNA导入细胞膜时，该细胞便被该外源DNA“转化”。外源DNA可以或也许不整合到染色体DNA上构成细胞的基因组。例如在原核细胞和酵母中，该外源DNA可以保留在一个附加元件中，如质粒。而对真核细胞，一个稳定转化或转染的细胞其外源DNA已整合到染色体中，这样通过染色体复制将其遗传到子代细胞。这种稳定性通过真核细胞建立包含带有外源DNA的子细胞群的细胞株或克隆的能力得到证明。
“克隆”是从单个细胞或有丝分裂的共同祖先得到细胞群。“细胞株”是能在体外稳定生长数代的原代细胞的克隆。
DNA构成物的“异源”区是一个DNA的可辨别片段，它包含于或连在另一个DNA分子中实际上出现没连在其它分子上。
本发明提供编码多肽的核酸分子。分离的核酸尤其是DNAs能通过将DNA有效地连接到基因表达所需的表达控制区(如调节区)，而导入表达载体。载体可通过本领域所知的方法(Ausubel et.al，supra)导入合适的宿主细胞，如原核细胞(如细菌)或真核细胞(如酵母、昆虫或哺乳动物)。已制备或分离的目的蛋白的编码序列能被克隆入一个合适的载体或复制子。许多克隆载体已被本领域的技术人员熟知，合适克隆载体选择只是一个选择的问题。用于克隆的重组DNA载体以及可转化的宿主细胞的实例包括噬菌体入(大肠杆菌)，pBR322(大肠杆菌)，pACYC177(大肠杆菌)，pKT230(革兰氏阴性菌)，pGV1106(革兰氏阴性菌)，pLAFR1(革兰氏阴性菌)，pME290(非大肠杆菌的革兰氏阴性菌)，pHV14(大肠杆菌和枯草杆菌)，pBD9(杆菌)，pIJ61(链霉菌)，pUC6(链霉菌)，YIp5(酵母)，一个杆状病毒昆虫细胞系统，YCp19(酵母)。总见“DNACloningVols.I&II，Glover et.al.ed.IRL Press Oxford(1985)(1987)和；T.Maniatis et al.(“Molecular Clonig”Cold Spring Harbor Laboratory(1982)。
基因可位于启动子的控制、核糖体结合部位(细菌表达)及任意操纵子(在此总指控制元件)之下，以便编码目的蛋白的DNA序列在被含有此表达结构的载体转化的宿主细胞中转录为RNA。编码序列可含有或不含有一信号肽或先导序列。本发明的多肽可用如大肠杆菌tac启动子或蛋白A基因(spa)启动子和信号序列表达。先导序列在宿主翻译过程中能被细菌宿主移去。见如U.S.Patent Nos.4,431,739；4,425,437；4,338,397。
除控制序列外，最好加上调节序列，它利于调节有关宿主细胞生长的蛋白质序列的表达。调节序列为本领域技术人员所知，例如包括对化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)的反应使某基因的表达开启或关闭。载体中还可存在其它类型的调节元件，如增强子序列。
构建表达载体使特殊编码序列与合适的调节序列位于载体中，相对于控制序列的编码序列的位置和方向应为编码序列在控制序列的“控制”下转录(即在控制序列与DNA分子结合的RNA聚合酶转录编码序列)。编码序列的修饰对获得此目的是需要的。例如，在某些情况下也许有必要修饰该序列使它以合适的方向与控制序列相连接，即保持阅读框架。控制序列和其它调节序列在插入某载体前可连接到编码序列上，克隆载体如上所述。或者编码序列直接克隆到已含有控制序列和合适限定部位的表达载体上。
在某些情况下，最好加入使多肽从宿主体中分泌出来的序列，并随后切掉分泌信号。
一些原核表达载体在本领域已知。见，如U.S.Patent Nos.4,578,355；4,440,859；4,436,815；4,431,740；4,431,739；4,428,941；4,425,437；4,41 8,1 49；4,411,994；4,366,246；4,342,832；see also U.K.Patent Appl ications GB2,121,054；GB 2,008,123；GB 2,007,675；and EuropeanPatent Application103,395。酵母表达载体也在本领域已知，见如U.S.Patent Nos.4,446,235；4,443,539；4,430,428；see also European Patent Applications 103,409；100,561；96,491。pSV2neo(见J.Mol.Appl.Genet 1327-341)用SV40后启动子在哺乳动物细胞表达或pCDNA 1neo，从pCDNA1(Mol.Cell.Biol.74125-29)分离的载体，用CMV启动子驱动表达。后面两种载体都可在哺乳动物细胞中暂时或稳定表达(用G418抗性)。昆虫细胞表达系统，如果蝇也有用，见PCT applications WO90/06358和WO92/06212和EP application EP0290261 。
依赖于所选宿主和表达系统，本发明的多肽可通过上述表达载体转化的生长的宿主细胞在目的多肽表达的条件下制得，该多肽然后从宿主细胞中分离出来并纯化。如果表达系统将多肽分泌到培养基中，则多肽可直接从培养基中纯化。如果多肽不被分泌，则从细胞溶胞产物中分离或从细胞膜成分中回收。合适生长条件的选择和回收方法见本工艺技术。
本发明的另一方面是包含上述D1-D4多肽或Mab、活性片段及药物可接受载体的药物组成。
在治疗和预防剂中，D1-D4多肽或Mab或片段可作为可注射成分给病人使用，如灭菌水溶性分散，最好等渗。
或者该成分配制来局部使用，如软膏、乳剂、乳液、眼用软膏、滴眼液、滴耳液、漱口、浸渍敷料、缝线和烟雾剂，还可含有合适的常规添加剂，包括如防腐剂、帮助药物渗透的溶剂、软膏和乳剂中的润滑剂。这些局部配方还可含有适合的常规载体，如乳剂或软膏主剂，乳液里的乙醇或油醇。这些载体可占配方重量的1％到98％；最常见的是最多占到配方重量的约80％。
本发明的成分可通过注射给药在放入内置设施之前基本抵御相应的细菌。手术后在装置存留体内的时间里可持续用药。此外，该成分还可用于外科技术的扩大手术前后的覆盖物以防止葡萄球菌对伤口感染。
许多矫形外科医生考虑到装有假关节的病人在治牙前应考虑到抗生素预防，否则会产生菌血症。晚期深度感染是一种严重的并发症有时导致失去假关节，而且常伴有严重的发病率和死亡率。在这种情形下，有可能扩展D1-D4多肽或某种治疗的单抗的应用作为预防抗生素的替代品。
病人服用时，活性成分的每日剂量水平可从0.01到10mg/kg，局部大约1mg/kg。在任何情况下，医生应使实际剂量对每个病人是最合适的，并因病人的年龄、体重和特殊性而异。上述剂量是一般情况下的范例。当然个别情况下的较高或较低剂量范围是允许的，这点也在本发明的范围之内。
在所示剂量范围下，没观察到本发明的化合物的相反毒副作用，那将妨碍对适宜病人的用药。
除上述的治疗外，本发明的组成可一般用于伤口处理剂以防止细菌对暴露在伤口组织的基质蛋白，尤其是纤连蛋白的粘附，而且在治疗牙齿时替代或与预防抗生素并用起预防作用。另外，本发明的组成可在插入前不久用来浸洗内置装置。浸洗伤口或内置装置时，活性剂优选浓度为1μg/ml到10mg/ml。
上述Mabs或片段也可作为诊断试剂，用来检测含有Fbp的细菌、Fbp本身、Fbp的D1-D4多肽的存在。
虽然本发明的单克隆抗体方面在用Fbp的D1-D4多肽产生抗体上已基本阐述，当然Fbp本身在起始免疫计划中也可用作抗原。
下列实施例解释用作抗原和抗粘附剂的D1-D4多肽的制备。实施例用于制备、分离和分析D1-D4多肽以及归属实施例的主要试剂a)pBROC413载体的构建pT7-7质粒[Tabor，S(1990)，Current Protocols inMolecular Biology，F.A.Ausubel，Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，J.A.Smith，and K.Struhl，eds.]pp.16.2.1-16.2.11.Greene Publ ishing and Wiley-Interscience，New York.]含有相应pBR322的2065-4362核苷酸的DNA并如pBR322那样能在第三种质粒ColK存在下通过连接质粒被诱动。ColK编码的诱动蛋白作用于nic位点的pBR322第2254核苷酸从这一点起始动用。pT7-7经LspI和BglII消化并用DNA聚合酶I的Klenow片段补上5′突出端。质粒DNA片段用琼脂糖凝胶电泳纯化，平端相连接用Bio-Rad Gene Pulset并接制造商推荐条件通过电穿孔转入大肠杆菌DH1中。得到的pBROC413(
图1)通过质粒DNA的限制性酶分析鉴定。
pBROC413中从φ10启动子上游的Lsp I位点到pT7-7第434核苷酸的BglII位点的缺失，缺失了相应于pBR322第2065-2297核苷酸的DNA。nic位点及相邻序列被缺失，因此使pBROC41 3不能诱动。b)生物素化纤连蛋白探针的制备纤连蛋白(FN)在Gelatin Sepharose上从人血浆成分(Dr.D.Pepper，Scottish Blood Transfusion Service赠送)中纯化，基本上按Miekka et al(1982)Thromb.Res.27，1-14所述。11.2mg FN(2.0ml)溶于0.05M Tris/0.1M NaCl pH7.5加入9.2ml0.05M Na2B4O7pH8.6缓冲液制成1.0mg/ml。加入在干燥二甲基甲酰胺中浓度为5.0mg/ml的N-羟基丁二酰亚胺生物素(AmershamUK)80μl，该混和物室温下孵育并搅拌1小时。反应通过将缓冲液换成含有0.1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的Dulbecco′s“A”磷酸盐缓冲液，用5个Sephadex G25柱(PD10，Pharmacia)终止。c)纤连蛋白Sepharose CL4B的合成上述纯化的100mg人纤连蛋白在室温下依制造商建议，加入7g溴化氰活化的Sepharose CL4B(Pharmacia)，得到25ml基质胶。FN-Sepharose使用前用下面纯化中使用的所有缓冲液冲洗。实施例中氨基酸残基的编号在下列实施例中氨基酸残基的编号依照Sigmas et.al(1989)op.cit相应于FbpA的残基。FbpA709-838残基对应于表2中所列的金黄色酿脓葡萄球菌J2385序列的1-130残基，FbpA709-886残基对应于1-174残基。实施例1从金黄色酿脓葡萄球菌J2385分离编码纤连蛋白结合蛋白的纤连蛋白结合区的DNAS.aureus J2385是Cookson et.alTHELANCET ofAugust 15th，page387所述的B株。它是从一种皮肤损伤中分离到的临床株。染色体DNA的制备是通过将细胞在培养基中过夜振摇收集后用溶葡球菌酶裂解并用酚/氯仿除去细胞蛋白。从这种未纯化的DNA制品中，编码纤连蛋白结合蛋白的纤连蛋白结合区的DNA片段用PCR扩增反应获得。PCR反应中使用的寡核苷酸引物是FIB15’-GGGAATTCATATGGGCCAAAATAGCGGTAACCAGTC-3′FIB25’-GCGGATCCTTACGTTGGTGGCACGATTGGAGGTG-3′PCR扩增使用S.aureus J2385染色体DNA(10ng)，FIB1(1micrcmolar)，FIB2(1micromolar)，Tris-HCl pH8.3(10mM)，KCl(50mM)，MgCl2(1.5mN)，明胶(0.001％)，NadGTP(200micromolar)，NadATP(200micromolar)，NadTTP(200micromolar)，NadCTP(200micromolar)及Taq DNA聚合酶(2.5units)用蒸馏水定容至100microlitres。该水溶液用80microlitres液体石蜡封面，进行94℃(1min)、60℃(1min)、72℃(2min)循环30次以使扩增进行。扩增后当10microlitres反应水溶液通过1.5％琼脂糖凝胶电泳(含溴化乙锭0.5micrograms/ml)检测时，通过与已知大小的DNA片段样品比较出现得到一种大约500碱基对的DNA片段。实施例2用FIB1和FIB2引物通过PCR扩增S.aureus J2385染色体DNA得到的DNA片段的序列的获得实施例1所述的条件下获得的PCR片段的大小(约500bp)并非如引物FIB1和FIB2预期设计的与S.aureus纤连蛋白结合蛋白基因(如Signas C.，et al.P.N.A.S.USA Vol86，699-703所述)各位点同源，据报道存在大约400bp的区别。为了鉴定DNA片段的实质，该片段克隆入pUC19并测序。从一个PCR反应中得到的DNA与EcoRI和BamHI限制性酶温育并克隆到相似处理的pUC19中(Yanisch-Perron，C.et al(1985)Gene，33，103)并测序产生pBROC519a。因为PCR过程有时在扩增的DNA中有缺失和碱基替换，J2385 DNA的类似克隆被保留与pBROC 519a一起测序，以证明结果。pBROC519a用从United States Biochemical得到的SEQUENASE II kit将两条链进行了测序。得到的序列显示编码S.aureus J2385 DNA 524bp的克隆片段。该序列与Signas et.al(loc.cit.)公布的相比较时，很明显它与S.aureus基因的2350-2885区很大同源，但具有主要区别(见表1)。特别地，推知的氨基酸顺序与公布的序列在残基752(ASN→ASP)、803(SER→ASN)、821(LYS→GLN)、825(GLN→HIS)表现出氨基酸差异，并有4个氨基酸缺失(838→841)，见表2。这些差异通过对单独克隆的PCR扩增DNA进行测序而证实。当推知的S.aureus J2385 DNA的氨基酸顺序与S.aureus纤连蛋白结合蛋白的A型蛋白(Signas et al(1989)和B型蛋白(Jonsson et al.(1991)EUR.J.BIOCHEM.vol202pages1041-1048)的相应区域比较时，很清楚S.aureus J2385蛋白的纤连蛋白结合区与A型和B型蛋白各自的区域十分相似，但与两者均不相同(表2)。这便提示S.aureus J2385蛋白应表示为C型。实施例3大肠杆菌BL21(DE3)中pBROC520的制备为了表达由S.aureus J2385 DNA编码的蛋白片段，使用如Tabor.S.所述的T7聚合酶/启动子表达系统(see CurrentProtocols in Molecular Biology[F.A.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，J.A.Smith and K.Struhl，eds.]pp.16.2.1-16.2.11.Greene Publishingand Wiley-Interscience，New York)。宿主是可诱导表达T7聚合酶基因的大肠杆菌BL21(DE3)(见Studier F.W.and MoffatB.A.J.Mol.Biol.vol.189，113-130)。
通过限制性酶切和低熔点琼脂糖电泳，从pBROC519a(3microgrammes)中分离到S.aureus J2385来源DNA的0.5Kb BamHI/NdeI片段。它(100nanogrammes)再用来与BamHI/NdeI切的pBROC413DNA(500nanogrammes)进行连接反应。连接的DNA电转染入E.coli Delta M15(see Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiatis，T.editorsMolecular Cloning，A LaboratoryManual(second edition)page 2.57for details of the lacZDelta M15 mutation)，转化株在含有氨苄青霉素(50microgrammes/ml)的LB琼脂上筛选。
从五个氨苄抗性克隆中制备质粒DNA，并通过限制性酶切图谱显示均为含有S.aureus来源DNA片段的pBROC413。一种质粒制品(指明pBROC520)用于转化E.coli BL21(DE3)以给出期望的表达构建/宿主组合。pBROC520编码SEQ ID NO6给出的肽，此后指D1-D4(709-886)。实施例4 pBROC520在E.coli BL21(DE3)中表达的J2385D1-D4(709-886)多肽的表达、分离和纯化a)表达载有pBROC413(非编码)质粒或pBROC520(编码D1-D4(709-886))的E.coli BL21(DE3)单克隆接种到含有下列成分的带盖容器(universals)中。10ml NZCYM培养基(1％(w/v)Bactotryptone，0.5％(w/v)Baeto yeast extract，0.5％(w/v)NaCl，0.1％(w/v)酪蛋白水解物和0.2％(w/v)MgSO4·7H2O pH7.0)和75μg/ml氨苄。培养液在37℃、230rpm保温过夜。过夜培养液再接种到250ml NZCYM培养基中(含150μg/ml氨苄)。该培养液在37℃ 230rpm保温至A600达0.5吸收单位。然后将培养液用1mM IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导并在相同条件下再保温4小时。取出诱导前及诱导后1、2、3、4小时的样品各1ml。每份样品在eppendorf管中离心1分钟，去除上清。沉淀再悬于100μl还原缓冲液中(50mM Tris.HCl pH6.8，100mM二硫苏糖醇(DTT)，0.1％(w/v)溴酚兰，2％(w/v)SDS，10％(w/v)甘油)或非-还原液中(省去DTT)。样品在90℃加热3mins然后贮存于-40℃。b)表达产物的检测含有pBROC413(非编码质粒)或pBROC520(编码D1-D4(709-886))的E.coli重悬样品在含有4-20％聚丙烯酰胺的十二烷基硫酸钠凝胶中分离(Novex British Biotechnology Ltd.)，基本如制造商所述。分离的蛋白用Sartoblot II印迹装置依制造商说明转移到Immobilon(Millipore(UK)Ltd.)上。印迹中未反应的部位通过在10mM NaH2PO4/0.15M NaCl/0.02％(w/v)Ficoll/0.02％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮/0.1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)pH7.4中室温不断搅拌保温1小时来封闭。印迹用生物素化的纤连蛋白200μg/ml作探针，缓冲液为0.02M NaH2PO4/0.3M NaCl/0.5％(w/v)Tneen80/1.0％(w/v)BSA pH7.4，于室温不断搅动反应4小时。使用Streptavidin Gold/Silver染色系统(AmershamUK)依制造商说明进行显带。称为D1-D4(709-886)多肽在pBROC520泳道中证明是一条新带。c)增溶的D1-D4(709-886)的分离基本上按a)中所述制备E.coli BL21(DE3(pBROC520))的冻存细胞沉淀，并使用3h的诱导阶段然后在4℃2h冻融并悬于50mM Tris/50mM NaCl/1mM EDTA/0.1mM PMSF pH8.0(30ml)。悬液转至一个100ml玻璃烧杯中超声破碎(加热系统-UltrasonicsW380；70Watts，50×50％pulse，脉冲时间＝5秒)。超声后马上离心(6000g/4℃。/10min)弃沉淀。含有增溶的D1-D4(709-886)的上清调至pH7.4，-40℃保存。d)D1-D4(709-886)产品的纯化(i)上述制备的D1-D4(709-886)上清上样至用Dulbecco′s“A”磷酸盐缓冲液(PBS)/0.4M NaCl/0.1mM PMSF平衡的FN-Sepharose柱(1.6×13.2cm)。D1-D4(709-886)用PBS/2M胍·HCl从柱中洗脱，然后使用滤过分子量为10,000的膜(Amicon)超滤浓缩至4.0ml。此D1-D4贮留液用2根Sephadex G25柱(PD10，Pharmacia)将缓冲液换为PBS配入产品中。通过RP-HPLC和SDS PAGE鉴定纯度为1.5mg＞90％，得到D1-D4(709-886)产品；通过N-末端测序和Western blotting(用生物素化的纤连蛋白作探针)证实该材料为D1-D4(709-886)。这种分离纯化的多肽用电子喷射质子光谱测得分子量为19,970。理论分子量为19,969。SDS PAGE的分子量分析显示D1-D4(709-886)多肽具有与大约35000(非还原)或40,000(还原)的蛋白相应的迁移率这里使用的蛋白分子量标准是Low Molecular Weight kit(pharmacia)。(ii)还建立了另一种纯化方法基本按实施例4c所述制备的D1-D4(709-886)1∶1稀释于0.1M NaH2PO4pH7.6(最终pH调至7.6)并上样于已由0.1MNaH2PO4pH7.6平衡好的Q Sepharose(Pharmacia)柱(i.d.7.8cm；h，5cm)。 D1-D4(709-886)吸收到柱中并用0.1MNaH2PO4/0.5M NaCl pH7.6洗脱。然后用滤过分子量为10,000的膜(Amicon)进行超滤浓缩至30ml。到这一步D1-D4(709-886)纯度约为50％。该D1-D4(709-886)贮留液用一根SephadexG25(Pharmacia)柱(id2.6cm，h21cm)换成50mM甲酸缓冲液，共得40ml产物。D1-D4(709-886)产物进一步通过走4次反相HPLC进行纯化。因而，10ml D1-D4(709-886)上样到用0.1％三氟乙酸(TFA)平衡的Aquapore C4柱(AppliedBiosystems)(id1cm，h10cm)D1-D4(709-886)从柱上用0.085％TFA/70％丙腈、0到100％线性梯度、大约4-5个柱体积的缓冲液洗脱。重复四次流程得到的含D1-D4(709-886)组分收集起来象上面超滤浓缩至30ml。该D1-D4(709-886)贮留液换成50mM甲酸缓冲液(如上)并冷冻干燥后配入终产品。
用反相HPLC分析柱和SDS PAGE测得纯度50mg≥95％，得到了D1-D4(709-886)；该材料通过N-末端测序和Westernblotting(探针为生物素化的纤连蛋白)证实为D1-D4(709-886)。当再溶到水或50mM甲酸中时，冷冻干燥的D1-D4(709-886)产品的溶解度为35-40mg/ml。(iii)建立另一个替换C4反相步骤的纯化方法如(ii)所述从Q Sepharose柱上洗脱下来的D1-D4(709-886)(48ml)与4M(NH4)2SO4(16ml)混和，上样到用1.0M(NH4)2SO4/0.1M NaH2PO4pH7.0(Buffer A)平衡的Toyopcarl Butyl柱(TosoHaas)。该柱用大约三倍床体积的BufferA冲洗。被基质吸附的D1-D4(709-886)从柱上用大约3倍柱体积的0.1M NaH2PO4pH7.0在Buffer A中以30％到100％的线性梯度洗脱。含D1-D4(709-886)组分用SDS PAGE鉴定后，收集起来用滤过分子量10,000的膜(Amicon)进行超滤浓缩至20ml。D1-D4(709-886)贮留液用Sephaelex G25柱(Pharmacia)(id2.6cm；h，21cm)换成50mM甲酸缓冲液，冷冻干燥后配入最终产品。
得到的D1-D4(709-886)产品用反相HPLC和SDS PAGE测得纯度为50mg≥98％。实施例5D1-D4(709-886)多肽的发酵生物反应器从含50μg/ml氨苄的LB琼脂培基中复苏E.coli BL21(DE3)pBROC520单克隆，并接种2×100ml含75μg/ml氨苄的菌种培基(NCYZM)。第一和第二次菌种阶段发酵在500ml振摇烧瓶中进行，每批量为100ml NCYZM培基。第一和第二菌种发酵条件如下37℃，在50mm摆度的轨道振摇器上230rpm。初始菌种温育时间为9小时。将它再用来接种到6份100ml第二阶段菌种培养基(NCYZM)中(0.1％v/v)，保温14.5小时。
两个15升Biolafitte发酵器，每只每批用10升NCYZM培养基和0.01％(v/v)Dow Corning DC1510抗泡沫。加培养基的容器用121℃蒸气消毒45分钟。氨苄用微孔滤膜灭菌(0.2μm)无菌加入容器的培基中，终浓度为150μg/ml。发酵器按第二次菌种培基2.5％(v/v)水平接种。最后阶段温育条件为37℃，振荡300rpm，空气流动5 L/min(0.5vvm)。最后阶段的发酵在接种前、接种后0小时及后面的大约每个小时无菌取样。样品用来检测光密度(550nm)的增加。当OD550≥1.0时，加入IPTG使终浓度为1mM。发酵再保温大约3小时。
每次离心7000g 35分钟或在15000g连续离心收集细胞。细胞总产量为73.5克，用1.0升Oxoid磷酸盐缓冲液(Dulbecco“A”)pH7.2洗一次。离心并冲洗的细胞冷冻在-20℃，等待下一步操作。
NCYZM培养基组成Difco Bacto胰酶体胨 10g/lFisons AR NaCl 5g/lDifco Bacto酵母提取物 5g/lDifco Bacto酪蛋白水解物 1g/lFisons AR MgSO4·7H2O 2g/l去离子水 950ml用5M NaOH调pH至7.0，然后定容至1000ml。实施例6 pBROC533的构建，一种表达主要含有S.aureus J2385纤连蛋白结合蛋白D1-D4区多肽的质粒。
下列寡聚多核苷酸(A)及其互补序列在Pharmacia LKB GereAsscmbler Plus DNA合成仪上合成CGGAATTCGT CAACAAACGA TTGAAGAAGA TACAACGACGTAAGATCTGG ATCCGCATGC GAATTCCG这两种寡核苷酸制品(每种0.14μg)混合后，加热至94℃5分钟，然后37℃退火10分钟。双链DNA用EcoRI酶消化然后克隆到pUC19的EcoRI位点(2μg EcoRI消化载体/连接)得到pBROC528在E.coli Dclta M15中。
然后将BamHI消化的带有卡那霉素抗性标志的pUC4K(从Pharmacia获得)，编号27-4958-01)克隆入得到的构建质粒pBROC528中唯一的BglII位点得到pBROC529。
pBROC529质粒DNA(5μg)在E.coli Delta M15中生长，具有HincII/SphI双酶切位点。编码卡那霉素抗性基因的大约1.4kbDNA片段，由原来合成的寡核苷酸编码的纤连蛋白结合蛋白部分用低熔点琼脂糖分离。该DNA与被HincII部分消化、被SphI完全消化的pBROC519a(见实施例2)质粒DNA进行连接反应。连接产物电转移入E.coli Delta M15，进行卡那霉素抗性筛选。用这种方法证明分离pBROC530的可能，该质粒通过葡萄球菌DNA HincII位点间的测序以及限制片酶切图谱确定，它载有编码S.aureus J2385纤连蛋白结合蛋白D1-D2-D3-D4区(表2中1-129残基)的DNA片段。该DNA片段在多肽的C末端还编码一个苏氨酸残基。
然后，pBROC530的葡萄球菌DNA通过对质粒DNA制品NdeI/BamHI酶切从质粒载体移出克隆到相似消化的pBROC413中(见主要试剂a)得到pBROC531。
pBROC531在E.coli Delta M15的转化株中生长，然后用SalI酶切移去卡那霉素抗性基因再连接产生pBROC533。完成这一步是为了防止pBROC531中从T7启动子的卡那霉素抗性基因不必要的过度表达，因为它会不利于葡萄球菌DNA的最大表达。
pBROC533转入E.coli BL21(DE3)组装E.coli BL21(DE3)，pBROC533。
质粒pBROC531的变株还可用下列寡聚多核苷酸(B)及其互补链构建CGGAATTCGT CAACAAACGA TTGAAGAAGA TACAACGCCGTAAGATCTGG ATCCGCATGC GAATTCCG末端苏氨酸被脯氨酸置换后，它给出与上面相同的多肽。实施例7 E.coli BL21(DE3)中pBROC533表达的D1-D4(709-838(P838T))多肽的表达、分离和纯化a)表达这一步的完成是使用实施例4a)所述的方法，只是实施例6中的质粒pBROC533换成pBROC520。b)表达产物的检测使用实施例4b)的方法完成。D1-D4(709-828(P838T))在pBROC532泳道确定为一个新带。c)分离此步基本按实施例4c)所述进行，只是用E.coli BL21(DE3)(pBROC533)细胞沉淀，起始培养体积为1.2升，细胞沉淀悬于32ml缓冲液。最终上清体积为40ml。d)纯化上述制备的D1-D4(709-828(P828T))上清液用0.1MNaH2PO4pH7.6 1∶1稀释并用HCl调pH至7.6，上样于用0.1MNaH2PO4pH7.6平衡的Q Sepharose(Pharmacia)柱(id，4.1cm；h4.7cm)。多肽被该柱吸收，用0.1M NaH2PO4/0.5N NaCl pH7.6洗脱。从Q Sepharose洗脱下来的多肽溶液(50ml)与4M(NH4)2SO4(16ml)混和，上样到用1.0M(NH4)2SO4/0.1MNaH2PO4pH7.0(BufferA)平衡的Toyopeal Butyl柱(TosoHaas)(id1.6cm；h15cm)。该柱用大约三倍床体积的Buffer A冲洗。吸附到基质的多肽用至少3倍柱体积的0.1M NaH2PO4pH7.0在Buffer A中以30％到100％的线性梯度洗脱。含有多肽的组分用SDS PAGE鉴定，收集起来用滤过分子量10,000的膜(Amicon)进行超滤浓缩至20ml。该贮留液用一个Sephadex G25柱(Pharmacia)(id2.6cm；h21cm)将缓冲液换成50mM甲酸，冷冻干燥后配入最终产品。
冷干品的一部分溶解，该材料在非还原条件下SDS PAGE上显示一条大约Mr＝22000的主带。
生物学评价A.D1-D4(709-886)对体外葡萄球菌对涂有纤连蛋白的多聚甲基异丁烯酸酯(PMMA)盖片的粘附的作用(i)细菌株金黄色酿脓葡萄球菌8325-4(实验室标准株)金黄色酿脓葡萄球菌J-2385表皮葡萄球菌(SE902和SE903，两种从临床上外体感染分离到的菌株)。(ii)粘附试验如Vaudaux et al，Infection and Immunity 45768-774，1984所述的体外粘附试验通常被用于测量葡萄球菌对包被纤连蛋白表面的粘附作用以及测定D1-D4(709-886)多肽的抗粘附性质。(iii)细菌的制备葡萄球菌株在Mucller-Hinton Broth中37℃生长过夜(MHB，Difco Laboratorics)。总量为2×107cfu的过夜培养物与100μCi[甲基-3H]-胸腺嘧啶(Amersham)在1ml MHB中保温，在37℃生长3小时至1×108-2×108cfu/ml。通过两次洗涤(3000×g，10分钟)去除未结合的放射活性，标记的菌株悬于1ml 0.15M NaCl。(iv)纤连蛋白对PMMA盖片的吸附将所有PMMA盖片(0.75×0.75cm)浸在37℃ 95％乙醇中10分钟，然后干燥并于120℃加热30分钟。盖片于室温下先在明胶(1mg/ml，Difco Laboratorics)中预保温60分钟，用PBS(无Ca2+、Mg2+，Gibco Laboratories)润洗。盖片再浸于含有纯化的人纤连蛋白的溶液中，有两种浓度0.5μg/ml用于S.aureus株，4μg/ml用于S.epidermidis株，37℃保温60分钟。盖片再转至含有PBS的新管中冲洗。(v)粘附试验D1-D4(709-886)多肽稀释到需要的浓度(从100μg/ml到100pg/ml)，用补充以阳离子(Gibco Laboratories)和白蛋白(20％，Sigma)(PBS++/HSA)的PBS稀释。洗过的放射性培养物(40μ1)加到塑料管中960μl的已稀释的D1-D4(709-886)多肽。包被纤连蛋白的盖片加到细菌悬液中，37℃保温60分钟并不断振摇(100圈/分钟)。
排出液体，盖片转到新管中，用盐(1ml)在室温洗两次，每次5分钟和30分钟。液体排干，将盖片转入加有5ml闪烁液的闪烁瓶中并计数。(iv)每种菌株的cpm和cfu评价部分3个小时放射性标记的培养物(10μl)在闪烁瓶中计数。一份100μl的以1∶10,000稀释并将20μl铺在Mueller-Hinton琼脂上，并将存活的计数。此外，100μl稀释菌(用于粘附试验)的cpm含量也进行测定，使你可以计数粘附于包放纤连蛋白PMMA盖片的cfu′s数目。(vii)结果
*盖片包被0.5μg/ml纤连蛋白**盖片包被4.0μg/ml纤连蛋白S.aureus8325-4是一个标准株，它对包被人纤连蛋白的不同材料的粘附能力已被广泛研究。该菌对包被纤连蛋白表面的粘附含因包被表面纤连蛋白浓度的增高而加快。因此，S.aureus8325-4作为一种合适的菌株被选用于测试可能阻断葡萄球菌和纤连蛋白包被表面相互作用的试剂的作用。
D1-D4(709-886)是一种S.aureus8325-4对包被纤连蛋白盖片粘附的潜在抑制剂。当D1-D4(709-886)的浓度降至10ng/ml时，仍可测到最高95％的粘附抑制率。纯化的人IgG(Pierce)用来做对照，因为用这个试验(Vaudaux et al J.Invest.Sury，2397-408 1989)早先已显示出它对S.aureus与包被纤连蛋白表面粘附的抑制作用，在1mg/ml抑制70％。
此外，当增加用于包被PMMA盖片的纤连蛋白的浓度时，S.aureus J2385对包被纤连蛋白盖片的粘附也加快了。然而，标准操作方法中盖片的明胶预处理被删去了，因为它导致一些菲特异性结合，从而干扰粘附试验。证明该菌株对非流动的纤连蛋白的粘附是重要的，因为该研究所用的重组D1-D4(709-886)多肽是从S.aureusJ-2385中得到的。D1-D4(709-886)多肽能够抑制S.aureus J2385对包被纤连蛋白表面的粘附。
当用于包被盖片的纤连蛋白的浓度增加时，S.epidermidis的粘附也加快了。注意到与S.aureus8325-4(0.5μg/ml)相比，需要高浓度(4μg/ml)的纤连蛋白才使显著数目的细菌粘附。D1-D4(709-886)多肽也抑制S.epidermidis对纤连蛋白(1μg/ml时95％粘附)的粘附提示我们D1-D4(709-886)能做为-种治疗剂来抵抗凝固酶-阴性葡萄球菌，具有抗粘附活性。B.对S.aureus与皮肤基质粘附的抑制作用(i)介绍本研究用的皮肤组织是从试剂盒(Skin2)从Advanced TissueSciences(La Jolla，California，USA)得到。此人工皮肤生长的全部细节随试剂盒提供。该人工皮肤通过接种人新生成纤维细胞到一个中性医用级尼龙网上形成。成纤维细胞粘到网上在网的小间隙内繁殖。在这个过程中，他们分泌天然可见的生长因子并淤积细胞外基质蛋白如纤连蛋白和胶原，从而形成了人工皮肤。这个模型已被成功地用于代替皮肤组织暴露在伤口上。(ii)体外S.aureus8325-4的皮肤粘附实验该程序基本与上面A中描述的相同，只是人工皮肤替代了包被FN的盖片。S.aureus8325-4在Mueller-Hinton Broth(MHB，Difco)中生长过夜。从过夜培养物中取总量为2×107cfu在1ml MHB中与100μCi[甲基-3H]-胸腺嘧啶保温，37℃生长3小时至1×108到2×108cfu/ml。两次离心(3,000×g，10分钟)除去游离放射活性，标记的菌株悬于0.5％HSA(Sigma)中防止对细胞/基质蛋白的非特异结合。皮肤基质在加入放射性标记细菌前用无血清培养基和PBS冲洗。(iii)D1-D4(709-886)对皮肤基质粘附的作用D1-D4(709-886)多肽在补充阳离子(Gibco Laboratories)和人血清白蛋白(20％，Sigma)(PBS++，HSA)的PBS中稀释至所需浓度。洗过的细菌(40μl)加到稀释的D1-D4(709-886)(960μl)样品中。然后将皮肤组织加到含D1-D4(709-886)的细菌悬液中，振摇(100圈/分)37℃保温。液体排出，将皮肤组织转到试管中，室温下用盐溶液(1ml)分别洗5和30分钟。液体排出并将皮肤组织转至加有5ml闪烁液的闪烁瓶中计数。(iv)结果D1-D4(709-886)对S.aureus8325-4和皮肤组织的粘附具有浓度-依赖的抑制作用。D1-D4(709-886)的浓度降至1μg/ml仍有显著粘附抑制作用。这些结果显示与包被纤连蛋白PMMA盖片的粘附实验获得的结果有良好的相关性。此外，结果证实了皮肤组织上存在的纤连蛋白与S.aureus相互作用的重要。作为此观察的结论，D1-D4(709-886)多肽局部用药以防止手术中的伤口感染是预防上有用的。C.给大鼠皮下移植时的葡萄球菌和尼龙插管粘附的抑制作用(i)体内外作感染实验模型体重230-250g的雄性CD大鼠(Charles River(UK)Limited)用来作此研究。在无菌条件下，每只大鼠皮下移植3或4只柔韧的乙烯插管(1.5mm×2cm)。动物用Hypnorm(0.05ml)i.m然后0.05mli.m valium麻醉。脊柱背面中间作1cm切口，用钝器分离打开皮下区域。移植插管，切口用小夹夹住。在麻醉苏醒前，伤口喷洒木卡因。小夹6天后移去。在插入插管时通过向伤口内放细菌培养物(见下)，使移植部位感染。(ii)用于感染模型的细菌的制备细胞过夜生长于MHB(Difco)。过夜培养物(20μl)用来接种新鲜MHB(1ml)，培养物在37℃生长3小时或16小时(指数期培养)。细菌洗涤2次(9000×g，10分钟)并悬于0.85％PBS(1ml)得到8.3log10cfu/ml。细菌悬液1比10稀释得到大约7log10cfu/ml，0.1ml该悬液用于感染大鼠。因此，每个伤口用约6log10cfu感染。
为了测试D1-D4(709-886)在体内对粘附的作用，在加到伤口部位前，先将D1-D4(709-886)多肽加到细菌悬液中使终浓度为500μg/ml。因此，每个伤口部位施以50μg D1-D4(709-886)。(iii)在D1-D4(709-886)多肽存在下，在体内细菌粘附/移生的评价感染后1，6，24，72.168，192和240小时，每组取一只大鼠通过腹腔注射0.5ml Expiral处死。取出所有插管，用灭菌PBS润洗并将每个放到1ml新鲜PBS(磷的盐缓冲液，0.9％)中，在超声水浴中超声2分钟以除去附着的细菌。取出样品铺到Maeller-Hinton琼脂上计数粘附的、活的细菌数。(iv)结果在大鼠皮下移植过程中，D1-D4(709-886)多肽抑制S.aureus8325-4对插管的粘附。移植6小时后取出的插管，四分之三完全没有粘附的细菌，粘附到第4根插管的细菌数比对照组(没加D1-D4(709-886))也少得多。虽然移植8天后插管上发现有些粘附细菌，但有D1-D4(709-886)处理的导管上的细菌数(3.0±1.3log10cfu)比未处理的对照组少得多(5.4±1.4log10cfu)。考虑到用于感染伤口的细菌数是106，这应该超过手术时操作区污染生物的数目。
D1-D4(709-886)感染后至少10天内抑制S.aureus I20(一种临床分离的致病力强的)的粘附。感染后6、24、72、168、240小时取出插管，在未处理的插管中在持续研究时间内可见细菌数在4到6log1cfu。然而，在任何时间内D1-D4(709-886)处理的插管上没发现或几乎没有发现细菌。
在两株S.epidermidis中也看到类似结论。尽管这些菌株的粘附有一个明显的延迟，但是未处理的插管感染后10天可见高数目的细菌，有5-6log10cfu。这时D1-D4(709-886)处理的插管上未见细菌。因此，D1-D4(709-886)局部使用用于预防时，能有效地阻止葡萄球菌对内置医疗装置的粘附。D.D1-D4(709-838(P838T))对葡萄球菌粘附的作用(i)体外粘附实验实验条件同A中评价D1-D4(709-886)多肽所述的相同。(ii)结果D1-D4(709-838(P838T))多肽能抑制S.aureus8325-4和S.epidermidis SE902对包被纤连蛋白盖片的粘附。D1-D4(709-838(P838T))的粘附抑制作用与用D1-D4(709-886)所观察到的相同。在此研究中，100ng/ml多肽能抑制S.aureus8325-4粘附达9 5％，100μg/ml多肽能抑制S.epidermidis SE902粘附达85％。(iii)体内粘附实验试验条件与C中评价D1-D4(709-886)多肽所述的相同。(iv)结果D1-D4(709-838(P838T))多肽在大鼠皮下移植过程中能抑制S.aureus I20和S.epidermidis SE902对乙烯插管的粘附。到实验的第10天，与未处理的对照组相比D1-D4(709-838(P838T))处理的插管上未出现粘附生物，而对照组发现S.aureusI20 4.5log10cfu及S.epidermidis SE902 6log10cfu。表1.编码S.aureus纤连蛋白结合蛋白A型的纤连蛋白结合区DNA与S.aureus J2385 DNA序列的比较- - - - -1 GGCCAAAATAGCGGTAACCAGTCATTCGAGGAAGACACAGAAGAAGATAA 50 - J2385|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||+||2350 GGCCAAAATAGCGGTAACCAGTCATTCGAGCAAGACACAGAAGAAGACAA 2399 Typc A- - - - -51 ACCTAAATATGAACAAGGTGGCAATATCCTAGATATCGATTTCGATAGTG 100 J2385||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||+|||||||2400 ACCTAAATATGAACAAGGTGGCAATATCGTAGATATCGATTTTGATAGTG 2449 Type A- - - - -101 TACCTCAAATTCATGGTCAAAATAAAGGTGATCAGTCATTCGAAGAAGAT 150 J2385|||||||||||||||||||||||||||||*|||||||||||||+||||||2450 TACCTCAAATTCATGGTCAAAATAAAGGTAATCAGTCATTCGAGGAAGAT 2499 Type A- - - -151 ACAGAGAAAGACAAGCCTAAATATGAACATGGTGGTAATATCATTGATAT 200 J2385|||||+||||||||+|||||+|||||||||||+|||||+|||||||||||2500 ACAGAAAAAGAGAAACCTAAGTATGAACATGGCGGTAACATCATTGATAT 2549 Type A- - - - -201 CGACTTCGACAGCGTGCCACATATTCATGGATTCAATAAGCACACTGAAA 250 J2385||||||||||||+||||||||||||||+||||||||||||||||||||||2550 CGACTTCGACAGTGTGCCACATATTCACGGATTCAATAAGCACACTGAAA 2599 Type A- - - - -251 TTATTGAAGAAGATACAAACAAAGATAAACCAAATTATCAATTCGGTGGA 300 J2385|||||||||||||||||||+|||||||||||||*||||||||||||||||2600 TTATTGAAGAAGATACAAATAAAGATAAACCAAGTTATCAATTCGGTGGA 2649 Type A- - - - -301 CACAATAGTGTTGACTTTGAAGAAGATACACTTCCACAAGTAAGTGGTCA 350 J2385||||||||||||||||||||||||||||||||||||*|||||||+||+||2650 CACAATAGTGTTGACTTTGAAGAAGATACACTTCCAAAAGTAAGCGGCCA 2699 Type A- - - - -351 TAATGAAGGTCAACAAACGATTGAAGAAGATACAAC............GC 388 J2385*|||||||||||||||||||||||||||||||||||||2700 AAATGAAGGTCAACAAACGATTGAAGAAGATACAACACCTCCAATCGTGC 2749 Type A- - - - -389 CGCCAACACCACCAACACCAGAAGTACCAAGTGAGCCGGAAACACCAACA 438 J2385|+|||||+|||||+||||||||||||||||||||||||||||i||||||+2750 CACCAACGCCACCGACACCAGAAGTACCAAGTGAGCCGGAAACACCAACG 2799 Type A- - - - -439 CCACCGACACCAGAAGTACCAAGTGAGCCGGAAACACCAACACCGCCAAC 488 J2385|||||+||||||||||||||||||||||||||||||||||||||+||+||2800 CCACCAACACCAGAAGTACCAAGTGAGCCGGAAACACCAACACCACCGAC 2849 Type A- - -489 ACCAGAGGTACCAAGTGAGCCGGAAACACCAACACC 524 J2385||||||+||+||+||||||||+|||||+||||||||2850 ACCAGAAGTGCCGAGTGAGCCAGAAACTCCAACACC 2885 Type A+同义突变氨基酸改变表2.比较金黄色酿脓葡萄球菌(如公布的)和金黄色酿脓葡萄球菌J2385的纤连蛋白结合蛋白的纤连蛋白结合区的氨基酸顺序。
金黄色酿脓葡萄球菌顺序a包含709-886氨基酸残基(如Signas et al.loc.cit.)1→ D1 -→ D2 50J2385 GQNSGNQSFE EDTEEDKPKY EQGGNIVDID FDSVPQIHGQ NKGDQSFEEDStaphaGQNSGNQSEE EDTEEDKPKY EQGGNIVDID FDSVPQIHGQ NKGNQSFEEDStaphbGQNSGNQSFE EDTEEDKPKY EQGGNIVDID FDSVPQIHGQ NNGNQSFEED51 -→ D3 100J2385 TEKDKPKYEH GGNIIDIDFD SVPHIHGFNK HTEIIEEDTN KDKPNYQFGGStaphaTEKDKPKYEH GGNIIDIDFD SVPHIHGFNK HTEIIEEDTN KDKPSYQFGGStaphbTEKDKPKYEQ GGNIIDIDFD SVPHIHGFNK HTEIIEEDTN KDKPNYQFGG101 -→ D4 -→ WR1 146J2385 HNSVDEEEDT LPQVSGHNEG QQTIEEDTT. ...PPTPPTP EVPSEPETPTStaphaHNSVDFEEDT LPKVSGQNEG QQTIEEDTTP PIVPPTPPTP EVPSEPETPTStaphbHNSVDFEEDT LPQVSGHNEG QQTIEEDTTP PIVPPTPPTP EVPSEPETPT174J2385 PPTPEVPSEP ETPTPPTPEV PSEPETPTStaphaPPTPEVPSEP ETPTPPTPEV PSEPETPTStaphbPPTPEVPSEP ETPTPPTPEV PTEP....
图1是pBROC413质粒的图示。Bla表示氨苄抗性基因，φ10表示T7RNA聚合酶启动子，rbs表示核糖体结合位点。φ10和bla的箭头给出了转录方向。多接点位点已表示出来。质粒未按比例画，其尺寸是近似的。
列出序列SEQ ID NO1FIB 1GGGAATTCAT ATGGGCCAAA ATAGCGGTAA CCAGTCSEQ ID NO2FIB 2GCGGATCCTT ACGTTGGTGG CACCATTGGA GGTGSEQ ID NO3寡核苷酸(A)CGGAATTCGT CAACAAACGA TTGAAGAAGA TACAACGACG TAAGATCTGGATCCGCATGC GAATTCCGSEQ ID NO4寡核苷酸(B)CGGAATTCGT CAACAAACGA TTGAAGAAGA TACAACGCCG TAAGATCTGGATCCGCATGC GAATTCCGSEQ ID NO5GGCCAAAATA GCGGTAACCA GTCATTCGAG GAAGACACAG AAGAAGATAAACCTAAATAT GAACAAGGTG GCAATATCGT AGATATCGAT TTCGATAGTGTACCTCAAAT TCATGGTCAA AATAAAGGTG ATCAGTCATT CGAAGAAGATACAGAGAAAG ACAAGCCTAA ATATGAACAT GGTGGTAATA TCATTGATATCGACTTCGAC AGCGTGCCAC ATATTCATGG ATTCAATAAG CACACTGAAATTATTGAAGA AGATACAAAC AAAGATAAAC CAAATTATCA ATTCGGTGGACACAATAGTG TTGACTTTGA AGAAGATACA CTTCCACAAG TAAGTGGTCATAATGAAGGT CAACAAACGA TTGAAGAAGA TACAACGCCG CCAACACCACCAACACCAGA AGTACCAAGT GAGCCGGAAA CACCAACACC ACCGACACCAGAAGTACCAA GTGAGCCGGA AACACCAACA CCGCCAACAC CAGAGGTACCAAGTGAGCCG GAAACACCAA CACCTCCAAT CGTGCCACCA ACGTAA -SEQ ID NO6 D1-D4(709-886)GQNSGNQSFE EDTEEDKPKY EQGGNIVDID FDSVPQIHGQ NKGDQSFEEDTEKDKPKYEH GGNIIDIDFD SVPHIHGFNK HTEIIEEDTN KDKPNYQFGGHNSVDFEEDT LPQVSGHNEG QQTIEEDTTP PTPPTPEVPS EPETPTPPTPEVPSEPETPT PPTPEVPSEP ETPTPPIVPP TSEQ ID NO7 D1-D4(709-838(P838T))(实施例7)GQNSGNQSFE EDTEEDKPKY EQGGNIVDID FDSVPQIHGQ NKGDQSFEEDTEKDKPKYEH GGNIIDIDFD SVPHIHGFNK HTEIIEEDTN KDKPNYQFGGHNSVDFEEDT LPQVSGHNEG QQTIEEDTTTSEQ ID NO8 D1-D4(709-838)GQNSGNQSFE EDTEEDKPKY EQGGNIVDID FDSVPQIHGQ NKGDQSFEEDTEKDKPKYEH GGNIIDIDFD SVPHIHGFNK HTEIIEEDTN KDKPNYQFGGHNSVDFEEDT LPQVSGHNEG QQTIEEDTTPSEQ ID NO9 J2385 DNA(表1)GGCCAAAATA GCGGTAACCA GTCATTCGAG GAAGACACAG AAGAAGATAAACCTAAATAT GAACAAGGTG GCAATATCGT AGATATCGAT TTCGATAGTGTACCTCAAAT TCATGGTCAA AATAAAGGTG ATCAGTCATT CGAAGAAGATACAGAGAAAG ACAAGCCTAA ATATGAACAT GGTGGTAATA TCATTGATATCGACTTCGAC AGCGTGCCAC ATATTCATGG ATTCAATAAG CACACTGAAATTATTGAAGA AGATACAAAC AAAGATAAAC CAAATTATCA ATTCGGTGGACACAATAGTG TTGACTTTGA AGAAGATACA CTTCCACAAG TAAGTGGTCATAATGAAGGT CAACAAACGA TTGAAGAAGA TACAACGCCG CCAACACCACCAACACCAGA AGTACCAAGT GAGCCGGAAA CACCAACACC ACCGACACCAGAAGTACCAA GTGAGCCGGA AACACCAACA CCGCCAACAC CAGAGGTACCAAGTGAGCCG GAAACACCAA CACCSEQ ID NO10 J2385(表2)GQNSGNQSFE EDTEEDKPKY EQGGNIVDID FDSVPQIHGQ NKGDQSFEEDTEKDKPKYEH GGNIIDIDFD SVPHIHGFNK HTEIIEEDTN KDKPNYQFGGHNSVDFEEDT LPQVSGHNEG QQTIEEDTTP PTPPTPEVPS EPETPTPPTPEVPSEPETPT PPTPEVPSEP ETPT
权利要求
1.从一种金黄色酿脓葡萄球菌Fbp分离的D1-D4多肽。
2.根据权利要求1的多肽，在序列上。它由完整的D1、D2、D3和D4区组成任意在PIVP终止，并且任选金黄色酿脓葡萄球菌Fbp的1至5壁区(WR)。
3.根据权利要求2含有最多3个壁区的多肽。
4.根据权利要求3的多肽，它由对应于金黄色酿脓葡萄球菌FbpA的G709到T886加PPIVPPT残基，G709到P838或G709到P838(P838→T)残基组成。
5.根据前面任何权利要求的多肽，其中Fbp是来自S.aureusJ2385，DNA序列为SEQ ID NO5。
6.根据权利要求1，具有SEQ ID NO6，SEQ ID NO7或SEQ ID NO8序列的多肽。
7.权利要求1至6中任意一种编码多肽的分离的核酸。
8.SEQ ID NO5的DNA。
9.权利要求7或8包含分离核酸的重组质粒。
10.用权利要求9的载体转化的宿主细胞。
11.制备权利要求1至6任意一种多肽的方法，包括编码所述多肽DNA的表达和表达产物的回收。
12.结合到基质结合蛋白的一个或多个抗原决定簇的单克隆抗体(Mab)。
13.根据权利要求12的单克隆抗体，其中基质结合蛋白是葡萄球菌的一种细胞表面蛋白。
14.根据权利要求13的单克隆抗体，其中基质结合蛋白是纤连蛋白结合蛋白(Fbp)。
15.根据权利要求14的单克隆抗体，它与Fbp的D1-D4区上的一个抗原决定簇结合。
16.根据权利要求13、14、或15的单克隆抗体，其中细菌是S.aureus或S.epidermidis的一个株。
17.根据权利要求12的单克隆抗体，用下述各项作抗原均可得到Fbp，或Fbp的D1-D4区，或与Fbp或D1-D4区衍生物的免疫学上或抗原性上相同的多肽。
18.根据权利要求12的单克隆抗体，用下述各项作抗原均可得到S.aureus J2385(NCIMB 40532)上的Fbp，或Fbp的D1-D4区的一个多肽。
19.根据权利要求12到18中任意一种已被人性化的单克隆抗体。
20.根据权利要求12到19任意一种包含Mab结合区的多肽，它是该单克隆抗体的一个片段。
21.存在于S.aureus J2385(NCIMB 40532)上的一种Fbp的多肽，它具有氨基酸顺序为SEQ ID NO6的D1-D4区。
22.根据权利要求6或21多肽的衍生物并具有相同免疫学或抗原活性的多肽。
23.制备单克隆抗体的过程，其中动物用根据权利要求1至6、21或22中任意一种多肽进行免疫，该动物产生抗体的细胞与一个连续细胞株融合，该杂交瘤细胞被克隆并筛选出产生根据权利要求12至18中任意一个的抗体的克隆。
24.分泌根据权利要求12至18中任意一种抗体的杂交瘤细胞株。
25.质粒pBROC520或pBROC533。
26.一种从样品中纯化正如权利要求1至6或20到22定义的任意一种多肽的方法，包括将能够特异地结合所述多肽的单克隆抗体固定在一种基质上，在合适的条件下将样品与固定的单克隆抗体接触使多肽与所述抗体结合，再分离未结合样品并从固定的单克隆抗体上将多肽洗脱下来。
27.权利要求12至19中所定义的任一种单克隆抗体的用途，用于定量或定性地测定正如权利要求1至6或20至22定义的任何一种多肽。
28.测定权利要求1至6或20至22所定义的任意一种多肽的测试试剂盒，包括根据权利要求12至19的任意一种单克隆抗体以及任选其它的单克隆或多克隆抗体和/或附属物，它们在一个合适的包装中。
29.包含根据权利要求12至19中任意一种单克隆抗体或根据权利要求1至6或20的任意一种多肽以及一种药物可接受载体的一种药物组合物。
30.根据权利要求1至6或20的任一种多肽或根据权利要求12至19任一种Mab在制做一种药剂中的用途，它用于防止细菌对内置装置上的细胞外基质蛋白或伤口上的细胞外基质蛋白的粘附。
31.一种防止细菌与内置装置上细胞外基质蛋白粘附的方法，它包括用有效量的某种多肽或某Mab在手术内置装置的前、后或过程中处理病人，该多肽是根据权利要求1至6或20的任一种，Mab是根据权利要求12至19的任一种。
32.一种防止细菌与伤口上的细胞外基质蛋白粘附的方法，包括用有效量的根据权利要求1至6或20的任一种多肽或根据权利要求12至19的任一种Mab处理受伤的病人。
33.根据权利要求30、31或32的用途或方法，其中该细菌是革兰氏阳性菌。
全文摘要
一种能与基质结合蛋白的一个或多个抗原决定簇以及一种从金黄色酿脓葡萄球菌分离到的D1-D4多肽结合的单克隆抗体(Mab)或它的一个片段；以及它们在防止细菌(尤其是革兰氏阳性菌)对内置装置上的细胞外基质蛋白或伤口中的基质蛋白粘附方面的用途。
文档编号C12P21/02GK1119026SQ94191388
公开日1996年3月20日 申请日期1994年2月4日 优先权日1993年2月5日
发明者M·K·R·宾汉姆, I·乔普拉, I·A·克里奇利, D·J·C·诺里斯 申请人:史密丝克莱恩比彻姆有限公司