专利名称：黑槌虫草真菌及其生产方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及真菌及其工业发醇领域，特别涉及的是虫草菌种的获得及其工业化生产方法和产品的用途。
黑槌虫草(Cordyceps gracilis)也是以蝠蛾属(Hepialus)幼虫为寄主的药、食两用虫草，此与中国冬虫夏草(Cordyceps sinensis)相同，所含主要化学成分二者十分相似。在人工培养基上得到黑槌虫草的无性世代羽束梗孢(Paraisaria)，最先是通过该虫草次生子囊孢子的纯分离培养而获得，后人又从生于僵虫体外的孢梗束上采集分离到，但从不长子座的虫草菌核内进行分离，以及以工业生产为目的而选育出性状优良和稳定的典型菌株的方法还未见到。
目前，从冬虫夏草(C.sinensis)已分离到十多个无性型菌种，主要有葡萄穗霉(Stachybotry)，中国拟青霉(Paecilomyces sinensis)，虫草头孢菌Cephalorium sinensis)，蝙蝠蛾拟青霉(P.hepial)，蝙蝠蛾被孢霉(Mortierella hepial)，圆柱菌(Scydalium)等。因而认为冬虫夏草的菌物复合体中的菌不是一种而是复杂的真菌系，常常发生特异的寄生、互生或共生关系。国内厂家都是采用其中某一菌种进行发酵培养，开发出冬虫夏草的多种菌丝体产品。它们的药理、毒理及成分等与天然冬虫夏草有相似之处，但各菌种间不尽相同，且还未见反映出冬虫夏草的全部功效。例如，″至灵胶囊″(被孢霉)主治慢性肾炎，″宁心宝″(头孢菌)治心律失常，″金水宝″(拟青霉)用于慢性支气管炎、高脂血症和阳萎。而且有试验证明，中国拟青霉的毒性(LD50为准)比天然虫草大八倍以上，其与蝙蝠蛾拟青霉在临床试用中，都曾发生恶心、口干、肠胃不适等现象。上述冬虫夏草菌种经发酵形成的菌球，常易发生自溶现象和产生代谢产物，而且使滤清物带有异味，不宜直接口服；其中如被孢霉发酵培养的菌丝体，需经多次清洗，才适于烘干加工成产品。因此，它们的发酵醪液不能100％地得到利用。
本发明的目的是提供一种新的获取羽束梗孢真菌的方法；本发明的另一目的是提供一种用于工业发酵生产的羽束梗孢CGMCC新槌12菌株；本发明的又一个目的是提供一种适合于CGMCC新槌12菌株进行工业化生产，并且发酵醪液100％可利用的培养基；本发明还有一个目的是提供一种采用CGMCC新槌12进行工业化生产所得发酵醪液的用途。
本发明的技术方案是用常规技术从天然黑槌虫草中分离培养出羽束梗孢(Paraisaria)的方法，是通过取不长子座的虫草菌核组织为接种材料，在培养基上培养获得。
以不长子座的黑槌虫草菌核组织为接种材料，在培养基上培养分离并选育出羽束梗孢用于工业发酵生产的优良菌株为CGMCC新槌12。
CGMCC新槌12菌株的菌落呈半球形拱起，前期蜂窝状，后期孔窝张裂，形成绢条状的孢梗束丛，束端平切，多层次展开如洁白的菊花，直径达25～30毫米。
利用黑槌虫草的羽束梗孢真菌进行工业发酵生产，其摇瓶和发酵罐的培养基配方是葡萄糖1～3％，黄豆饼粉2～3％，玉米粉1～2％，蛋白胨或蚕蛹粉0.1～0.3％，磷酸二氢钾0.1～0.3％，硫酸镁0.03～0.1％，消泡油适量，其余为水。
发酵醪液100％利用，其滤清液与天然虫草的浸出液一致，味苦而纯正，气微香，适于人们直接口服，具有广泛的治疗、滋补和保健功能。
发酵醪液的滤清液制成品和菌丝体制成品，单用一种或两者合用，对于哮喘病的防治有显著效果。
本发明的技术效果是1.提供了一种获取羽束梗孢属真菌的新方法。
2.将从黑槌虫草分离和培养的羽束梗孢典型菌株新槌12，回接室内繁殖的健康的蝠蛾幼虫，结果获得了与天然虫草相同的外生孢梗束的僵虫体，同时排除了其他偶然分离到的杂菌，从而确定羽束梗孢为该虫草真菌唯一的无性型。新槌12菌株的性状优良而稳定，因此，它的人工发酵产物能够相对完整地反映天然虫草的功效和作用。
3.根据羽束梗孢的生理特性，经试验本发明培养基中蛋白胨或蚕蛹粉的用量，比现有冬虫夏草菌发酵培养的用量要低。为满足氮素营养的需要，相应提高了黄豆饼粉的用量，并混合一定比例的玉米粉，这不仅提高了生理效应，使之适合该黑槌虫草真菌的生长，而且它们含有丰富的营养物质，有利于发酵醪液成分的转化，同时增添了产品的风味。
4.新槌12菌株用于发酵形成的菌球，继续培养一个月或更长时间，也不会发生自溶现象，同时不产生有害代谢产物，因而发酵醪液100％可利用。发酵醪液能够相对完整地反映天然虫草的药性。味苦而纯正，菌丝体黄白色至淡棕黄色(与虫草菌核内部组织色泽一致)，而且表现出相当或高于天然虫草的功效。其滤清液味苦而纯正(与天然虫草浸出液一致)，气微香，适于人们直接口服，疗补范围和功效相当或高于天然虫草，作用比菌丝体要快，而且可配制其他饮品。因此广泛适用于食品、饮料、美容和制药行业。
5.本发明虫草菌醪液对哮喘病的防治有显著效果。据药理研究，发酵醪液能明显增强机体免疫功能，并能增强肾上腺皮质功能。止咳、祛痰、平喘，抗病毒，凡服用者几乎不会患感冒。对于多种哮喘病疾患，滤清液的作用快，短期可控制症状，菌丝体起巩固疗效的作用。长期服用滤清液或菌丝体都有效果，而两者合用，更解决了哮喘防治中最关键的问题。
下面通过实例对本发明作进一步的详细说明本发明涉及的微生物菌种，已于1997年2月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏菌种新槌12菌株，CGMCC编号0291，它的分类命名是羽束梗孢(Paraisariadubia)。
本发明是取自自然界不长子座的黑槌虫草的新鲜菌核组织为接种材料，在培养基中培养获得。其具体的分离过程是将采自新疆阿勒泰地区的不长子座的黑槌虫草的新鲜菌核(体外孢梗束尚未形成)，用清水洗净，投入0.1％的升汞溶液中浸泡5分钟，再用无菌水清涤干净。然后切取内部白净接于PDA斜面培养基上，置于25～28℃的温箱中培养1～2周，可见长出白色或灰白色的短绒状菌丝。经转管移植，在10～20℃的温度下培养，1～2个月形成圆形或椭圆形的菌落，直径达10毫米，质地较硬，边缘整齐。继续培养2～4周，多数菌落为中央隆起，长出白色成丛的孢梗束，刺状或羽毛状，不甚整齐，高达5～8毫米。但从中发现个别的菌落最初呈半球形拱起，其前期蜂窝状，后期孔窝张裂，形成绢条状的孢梗束丛，束端平切，多层次展开，宛如洁白的菊花，直径可达25～30毫米。背面色素为黄褐色-绛红色。此时可见典型的产孢结构为瓶梗基部(约占全长2/3)膨大为柱状或球形，上部(约占全长1/3)突然收缩成窄细的小梗。瓶梗从菌丝上直接生出，或生于短杆上，单生、叉状双生，或聚生成轮枝。分生孢子短杆状，两端钝圆，透明，5～7.5×1.5～2.2微米，直或中央稍弯；其幼时为圆形胶状体所包嵌，成熟后胶状体自动消解。根据其产孢结构及分生孢子大小等特征，鉴定为羽束梗孢真菌。同时，从前述菌落成半球形拱起的菌株中，进一步选出其性状稳定，生长势强的菌株，代号新槌12，作为进行工业化发酵生产的代表菌种。
将新槌12菌株采用人工回接直接证明的作法，接种于室内繁殖的健康的蝠蛾幼虫，结果形成了与天然虫草相同、外生孢梗束的僵虫体，同时采用同样试验排除了其他偶然分离到的杂菌，从而确定该羽束梗孢是新疆产黑槌虫草真菌唯一的无性型。
产于新疆阿勒泰的黑槌虫草，其在自然界与冬虫夏草的发生形态截然不同。该虫草子座罕见，其无性阶段羽束梗孢在产地土中一年四季都有，形成以分生孢子独立传代的遗传特性。该羽束梗孢生长缓慢，生于僵虫体外的菌丝扭结成绳束，内部形成的菌丝块即菌核坚实，绝少中空，生于地下3～5年不腐烂。而冬虫夏草多带子座，以子囊孢子传代为特征。其在僵虫表面是形成膜状的菌丝组织，并与泥土粘结成一混合层。此时若不及时采收，当年六月份即渐渐变软变空，以至腐烂解体。因此，两者进行发酵生产的方法，产品用途和功效，都有很大不同。
经多年试验，筛选出适合于羽束梗孢新槌12生长的液体培养基，用于摇瓶和发酵罐的生产培养。该培养基的配方是葡萄糖1～3％，黄豆饼粉2～3％，玉米粉1～2％，蛋白胨或蚕蛹粉0.1～0.3％，磷酸二氢钾0.1～0.3％，硫酸镁0.03～0.1％，食用油(用于消泡)适量，其余为水。
本发明上述培养基中的蛋白胨或蚕蛹粉，比现有的冬虫夏草发酵的用量要低。据试验，蛋白胨或蚕蛹粉的浓度较高会对羽束梗孢的菌丝生长有抑制作用。因为蛋白胨和蚕蛹粉都是较大的肽，羽束梗孢对它们的利用受到膜运输的限制，不能完整的进入细胞；滞留在菌体表面，影响通透性，而且会给发酵液带来异味。为满足氮素营养的需要，培养基中提高了黄豆饼粉的用量，混合一定比例的玉米粉，不仅提高了生理效应，适于羽束梗孢的生长，而且它们含有丰富的维生素E、不饱和脂肪酸和胡萝卜素，以及矿物元素硒、铁、钙、镁等，有利于发酵醪液营养成份的转化，并增添了产品的风味，气微香，菌丝体为黄白色至棕黄色，而现有冬虫夏草菌丝体一般为棕褐色。
新槌12菌株用于发酵培养7～10天即形成菌球(干重得率达2.5～3.8％)，此后若继续培养一个月或更长时间，菌球也不会发生自溶现象，发酵液保持澄清，这与该虫草菌核在自然界3～5年不致腐烂和解体的特性一致。加之分生孢子成熟极晚(初期为胶状体包嵌)，发酵当中也不产生有害代谢产物。因此，生产的虫草菌醪液百分之百地可以利用。其滤清液味苦而纯正(与天然虫草浸出液一致)，气微香，可不经提取和单另加工，适合人们直接口服。经数百人次试服，反映其功效相当或高于天然虫草，而作用比菌丝体要快。也可用于配制其他保健饮品。因此，广泛应用于食品、饮料、美容和制药行业。
现有冬虫夏草菌丝体产品对慢性支气管炎有作用，但对多种病因可引起的哮喘未反映有特殊的疗效。本发明虫草菌醪液经药理研究，能明显增强机体免疫功能，并能增强肾上腺皮质功能。尤其在试用中，滤清液的平喘、止咳和祛痰作用都比菌丝体快，而且治感冒。因此，对哮喘病人，短期内常能控制症状；菌丝体作用较慢，却可起巩固疗效的作用。长期服用滤清液和菌丝体中的一种，都能改善患者体质，促成质变，收到治疗效果。而两者合用，更解决了哮喘防治中最关键的问题。许多患者治愈，多年来未见复发。
按常规技术进行工业发酵生产的工艺流程可概括为斜面菌种→一级摇瓶种子→二级摇瓶种子→一级种子罐→二级种子罐→发酵罐
下面是黑槌虫草新槌12真菌工业发酵生产过程的实施例一.首先对菌种进行扩大培养1.制作PDA斜面培养基取马铃薯200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾3克，硫酸镁1克，维生素B110克，琼脂18～20克，蝙蝠蛾幼虫浸出液适量。将马铃薯切片煮沸30分钟去渣，与其他成分混合，加水到1000毫升，调节PH值至5～6，在压力1公斤/平方厘米下灭菌30分钟，取出后摆成斜面。
2.斜面培养方法挑取一小块新槌12母种菌丝体，转接在空白斜面上，于10～20℃下培养(如选取12℃、20℃进行培养)1～2个月，即可作为种子在4℃下冷藏备用。
二.摇瓶种子的培养1.制作摇瓶液体培养基培养基按表1所列的三个实施例的配方进行配制。按每批分别制作5瓶计算、称样。将各成分混合后，加水到规定体积，PH值自然。然后分装到容积为1000毫升的三角瓶中，每瓶装量不超过500毫升。在压力1.1公斤/平方厘米下，灭菌30分钟。此为一级摇瓶种子培养液。二级种子的培养液不改变各实施例的配方，按需配制量称取各成分，制作方法同上。
2.摇瓶培养条件将原种菌丝体少量分别接入各实施例的一级摇瓶中，在室温下静止培养3～7天，再置于往复式摇床上，在23～27℃下振荡培养，频率80～100次/分，振幅5厘米，培养7～10天。然后按10～14％的接种量倒入二级摇瓶中，培养6～9天即可。
三.种子罐配料及工艺1.种子罐培养液的制作按前述摇瓶培养液的配方实施例，除用等量的蚕蛹粉代替蛋白胨，另添加适量食用油消泡之外，其他成份和配方不变。装液量为罐体总容量的75％，压力1公斤/平方厘米，灭菌30分钟。
2.种子罐培养条件当罐内温度降到30℃以下时，将摇瓶种子液按10％接种量接人一级种子罐中，在23～28℃下培养，气体环流搅拌，风量1∶1(V/V/Min)，罐压0.5～0.7公斤/平方厘米，培养时间6～8天然后按10％接种量，通过压差打入二级种子罐中，照同样方法继续培养6～8天。
四.发酵罐配料及工艺1.发酵罐培养液的制作发酵罐培养液各实施例的配方及制作同种子罐。罐体装液量为总容积的75％，压力为1公斤/平方厘米，灭菌30分钟。
2.发酵罐培养条件将种子罐培养的种子液，按10％接种量，通过无菌管道转入发酵罐中。培养温度23～28℃，气体环流搅拌，风量1∶0.5～1(V/V/Min)，罐压0.5～0.7公斤/平方厘米，培养时间7～10天。
3.放罐标准待发酵液变成澄清透明的淡棕黄色，菌球颗粒直径2～3毫米，大小均匀，无杂菌，味苦而无其他异味，残糖不超过0.5％，即可终止发酵。
经检测，按表1培养液配方的三个实施例(每瓶从摇瓶至发酵罐不少于三批)，所得发酵醪液质量均符合规定，即滤清液味苦而纯正(与天然虫草浸出液一致)，菌丝体得率达2.5％，胞内虫草多糖含量在5％以上，紫外分析在256nm处最大吸收峰。因而说明本发明的培养基和发酵工艺适合于黑槌虫草真菌的生长。
五.后处理工艺1.收集滤清液将发酵好的醪液压入储罐中，保压储存不超过24小时，通过离心机或板框压滤机收集滤清液，再经精滤澄清，然后灭菌分装或经浓缩、冷存备用。
2.收集菌丝体将经过离心和过滤收集的湿菌丝体放入烘房气流干燥，烘干温度70～80℃，烘至含水量5％左右，粉碎包装备用。
如果发酵罐容积达到20,000立升的规模，接种量10％抵消发酵过程中的消耗，最后装量仍按75％计，可产醪液15,000立升。其中滤清液得率按90％计，为13,500立升；菌丝体得率按2.5％计，为375公斤。
新疆黑槌虫草菌的发酵醪液，经自治区防疫站根据″食品卫生法″及″食品安全性毒理学评价程序″的规定，对其进行安全性试验，结果是雕雄大小鼠LD50均大于31.6g/kg·BW，属无毒级，无蓄积毒性；三项致突变试验精子畸形，微核和Amess试验均为阴性，未显示有致突变作用。因此作为保健食品是安全的。
新疆药物研究所对本发明虫草菌丝体(干粉)进行了毒理研究。其急毒性试验，因所用菌粉配成最大浓度(33.33％)，给小鼠灌胃，常规不超过0.25ml/10g，故无法测出口服的半数致死量，而作最大耐受量试验。结果日服量16.5g/kg，连续七日，总给药量115.5g/kg，仍未见毒性反应。其长期毒性试验大鼠日服剂量4g/kg，连续90天后与对照组比较，结果对大鼠生长、造血系统、肝、肾功能都无明显影响，各重要脏器及胸腺、胰腺均未见药物引起的组织学改变。
本发明虫草菌醪液经新疆药物研究所进行药理作用的研究，结果是能明显延长小鼠耐缺氧时间，并能提高负重小鼠的运动耐力。能减少小鼠自发活动，说明对中枢神经有镇静作用。可使小鼠胸腺减轻，大小鼠脾脏增重，提高小鼠吞噬指数，对用氧化可的松处理小鼠，能提高其溶血素水平，说明对机体非特异性免疫功能和体液免疫功能有增强作用。能提高血红蛋白含量，说明有补血作用；并能明显降低大鼠血清胆固醇的含量。能使大小鼠睾丸明显增重，并能使肾上腺和子宫增重，说明其有壮阳作用。能使呼吸道酚红分泌量增加，说明有祛痰作用。
本发明虫草菌粉和天然黑槌虫草经气相色谱分析比较，两者所含化学成分相同。经测定，虫草菌丝体中17种氨基酸的含量为17.9％，腺苷含量为0.059％，D-甘露醇含量为10.11％，虫草胞内多糖含量为5.3～5.7％。此外，含有维生素B1、B2、C、E和锌、硒、铁、钙、磷等十多种无机元素。其中，维生素E(33.08mg/100g)、锌(60PPM)、硒(3PPM)和D-甘露醇等的含量，经比较高于冬虫夏草菌丝体，其他成分也都相当或略高于后者。此外，这两种虫草对茚三酮试验的反应不一致，前者为紫色，后者为蓝紫色，说明二者所含蛋白质的性质并不完全相同。有资料表明虫草多糖能提高机体免疫功能，调节细胞生长，增强人体对肝炎、流感等病毒的抵抗力。腺苷能有力的清除致人衰老的羟自由基。甘露醇类物质有扩张心、脑血管的作用。人体代谢中有80多种酶的活性与锌有关，缺锌可使抵抗力下降。硒能抑制或抵消诱癌因素，缺硒与肿瘤发生有关。维生素E为抗不育因子，对改善微循环，防止动脉硬化和减缓衰老等都有作用。重要的是，上述成分在本发明的发酵滤清液中都或多或少地存在，很多是作为可溶性物质或特殊游离态分散于其中。如胞外虫草多糖含量为0.8～1.0mg/ml，17种氨基酸含量为1.64mg/ml，维生素E含量0.26mg/100ml，B1含量3.06mg/100ml。
本发明虫草菌丝体干粉(装入胶囊)和滤清液(经浓缩制成口服液)，经新疆药品检验所按照卫生部″药品卫生检验方法″等进行全检，结果各项指标均符合规定。
本发明产品虫草菌粉(装入胶囊)和滤清液(直接口服)，通过民间小范围(数百人份)的服用，反馈的情况表明两者单用对神疲乏力、头晕目眩、耳鸣失眠、畏寒盗汗、心悸气短、久咳略血、慢性支气管炎、哮喘、肺气肿、频发性感冒、顽固性高血压、高血脂、冠心病、脑血栓、心律失常、阳萎早泄、腰膝酸软、两腿浮肿、便秘、老人斑、夜尿频多、慢性肾炎、更年期综合症等，都收到过很好的治疗效果。克拉玛依市总医院选择乙肝病人作临床验证，结果表明对乙肝有明显疗效。对于其中许多病例(如哮喘、感冒、高血压、阳萎早泄等)，滤清液表现的作用比菌丝体要快。两者合用，效果尤佳。比之同类冬虫夏草菌丝体产品，本发明产品对哮喘病的防治尤其有特殊作用。
下面所录三个典型病例，都是患哮喘十余年，或从小就患哮喘，多方求医，效果不佳，反复发作。例一李某，女，70岁，在过去五六年里，因哮喘不能出门。仅服用滤清液两周，即感觉胸部轻松，咳喘明显减轻，能外出。继续服用两个月，至今近一年未发作。例二蔡吉连，男，五十岁，林场工人，对花粉、棉布等十二种物质过敏，咳嗽，气短，夜间不能平卧，每当秋季需住院急救，完全丧失劳动能力。自服用虫草菌粉20多天后，哮喘减轻，腿部消肿，可参加劳动。继续服用菌粉四个月后，症状完全消失，现已康复。例三万长林，男，64岁，运输公司退休职工。哮喘病越来越重，96年因胸部淤痰，咳嗽，送到医院急救时，两个管子都输不进氧。偶知本发明产品，其子来要，用滤清液和虫草菌粉(胶囊)合用，竟有意想不到的效果，十天便出院。医生和病人十分惊诧。继服两个月未再发病，连手上的老年斑也消失了。从上述实例说明，本发明的确对哮喘病的防治有特殊效果。表1摇瓶液体培养基的实施例配方(按重量百分比计)
权利要求
1.一种用常规技术从天然黑槌虫草中分离和培养出羽束梗孢属(Paraisaria)真菌的方法，其特征在于以不长子座的虫草菌核组织为接种材料，在培养基上培养获得。
2.一种根据权利要求1所述方法培养的羽束梗孢真菌，其特征在于用于工业化生产的优良菌株为CGMCC新槌12。
3.如权利要求2所述的羽束梗孢属真菌，其特征在于新槌12菌株的菌落呈半球形拱起，前期蜂窝状，后期孔窝张裂，形成绢条状的孢梗束丛，束端平切，多层次展开，直径达25～30毫米。
4.一种用权利要求2或3所述的羽束梗孢属真菌按常规技术进行工业发酵生产的方法，其特征在于液体培养基的配方是葡萄糖1～3％，黄豆饼粉2～3％，玉米粉1～2％，蛋白胨或蚕蛹粉0.1～0.3％，磷酸二氢钾0.1～0.3％，硫酸镁0.03～0.1％，消泡油适量，其余为水。
5.一种用权利要求4所述的工业发酵方法生产的黑槌虫草菌醪液，其特征在于该醪液100％可利用，其滤清液与天然虫草的浸出液一样，味苦、气微香，可直接口服，用于治疗、滋补和保健。
6.一种如权利要求5所述的黑槌虫草菌醪液，其特征在于该醪液的滤清液制成品和菌丝体制成品可用于防治哮喘病。
全文摘要
本发明公开了从黑槌虫草菌核组织中分离和培养羽束梗孢(Paraisaria)新槌12菌株的方法,及进行工业发酵生产的方法和用途。筛选出适合于该黑槌虫草真菌生长的培养基,所得发酵醪液百分之百可利用,其滤清液味苦而纯正,适合人们直接口服。本发明产品的化学成分和药理作用等,与天然虫草基本相同。滤清液单服或与菌丝体合用,可防治多种疾病,尤其对哮喘病的防治有显著效果。
文档编号C12N1/14GK1201828SQ9710446
公开日1998年12月16日 申请日期1997年6月9日 优先权日1997年6月9日
发明者赵恒 , 艾秀莲, 屈新兰, 常炜 申请人:新疆农业科学院微生物应用研究所