专利名称：重组人淋巴毒素α衍生物a的构建与纯化工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组人淋巴毒素α衍生物a构建及其生物工程制备方法。
淋巴毒素α(简称LTα)是淋巴细胞激活后产生的一种淋巴因子。它和肿瘤坏死因子α(简称TNFα)是哺乳动物体内迄今发现的细胞因子中对病毒感染细胞和肿瘤细胞有直接杀伤作用的仅有的两个。它们在基因结构、生物学功能上有许多相似之处，所以有人又称LTα为TNFβ。近几年的研究发现两者之间也有许多不同之处，例如TNFαLTα体内主要来源巨噬细胞 淋巴细胞体内半衰期 20分钟 几天膜结合方式 信号肽 LTβ受体 TNF RI、II TNF RI、II和LTβR活性形式 同源三聚体 同源三聚体、LTα1LTβ2、LTα2LTβ1基因剔除小鼠表现 对细菌感染敏感外周淋巴组织不发育自1984年人LTαcDNA被克隆、细菌表达以来，由于重组产物不溶给分离纯化带来极大困难，影响了它的应用开发。试剂级重组LTα也是近几年才上市的，价格比FNFα贵。近两年动物试验结果表明TNFα和LTα在同样剂量下对某些肿瘤生长抑制的效果几乎相仿，但毒性作用LTα比TNFα低，两者抑瘤谱也不完全一致(LTβ受体)，LTα的体内半衰期比TNFα长许多，因此有希望成为肿瘤治疗的药物。
本发明的目的在于提供一种重组人淋巴毒素α衍生物及其纯化工艺，以便进一步开发成毒副作用低、治疗效果好的抗肿瘤药物。
人淋巴毒素α(hLTα)活性形式是三聚体，单体由171个氨基酸组成，分子量为18.8kDa左右。hLTα的N端对其活性不重要，而且编码hLTαN端氨基酸的核苷酸序列大大影向hLTαcDNA在细菌里的表达效率。国外根据大肠杆菌偏爱密码子全合成hLTαcDNA或合成N端十几个氨基酸的核苷酸序列再与hLTαcDNA剩余部分拼接来实现rhLTα的细菌表达。
本发明根据hLTα融合蛋白能在细菌里高表达和N端氨基酸对hLTα生物学活性不重要的结论，构建了一种重组人淋巴毒素α衍生物a(生物学符号为rhLTαDa)，它是由改变人淋巴毒素α(hLTα)一级结构而得到的一种淋巴因子，该淋巴因子N端缺失27个氨基酸，包括附加上的第一个甲硫氨酸共145个氨基酸，分子量为15kD左右。
构建本发明的rhLTαDa，包括从人基因文库中克隆人淋巴毒素α(hLTα)基因，从人T细胞cDNA文库PCR(聚合酶链式反应)扩增得到编码人淋巴毒素α成熟蛋白的cDNA和引物设计、克隆、表达重组人淋巴毒素α衍生物a，其中，1)编码人淋巴毒素α(hLTα)成熟蛋白的cDNA核苷酸序列中第26位氨基酸是Thr(ACC)，不同于其它文献报道中的Asn(AAC)；2)PCR扩增重组人淋巴毒素α衍生物a(rhLTαDa)cDNA的引物设计如下aa29aa33aa34N端引物5’ACA CAT ATG AAA CCG GCT GCT CAC CTG ATC GGA(33mer) Ndcl(T) (C) (T)C端引物5’CCG AAT TCT ACA GAG CGA AGG CTC CAA AG(29mer) EcoRIrhLTαDacDNA与hLTα原型比较，其特点是N端缺失27个氨基酸，加上一个甲硫氨酸密码子，第29位、33位和34位氨基酸的密码子改为大肠杆菌偏爱的密码子。N端引物下方括号内的碱基为原密码子。
PCR扩增的模板来自我们从人T细胞cDNA文库克隆得到编码hLTα成熟蛋白的cDNA。几个PCR产物克隆的核苷酸序列分析都表明第26位的氨基酸是Thr密码子为ACC，和文献报道的Asn(AAC)比较有一个核苷酸的差别。
hLTαDacDNA经限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC118N转化DH5α受体菌，抽提重组质粒作核苷酸序列分析，结果与设计要求符合。
hLTαDacDNA插入表达载体pRSETC的NdeI/EcoRI位点，转化BL-21受体菌。单菌落过夜培养物1∶100接种LB培养液，37℃振荡培养至Klette读数为90时加表达诱导试剂IPTG至终浓度0.4mM，37℃继续培养四小时，离心收集菌体，SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)表明rhLTαDa表达量占菌体总蛋白的60-80％。rhLTαDa在大肠杆菌中以包涵体形式存在。
本发明对rhLTαDa的分离纯化建立了一套简单有效的工艺路线，包括rhLTαDa包涵体溶解、复性和柱洗脱等步骤，其特征是离心收集菌体，将其悬浮于8-15倍体积的Tris缓冲盐溶液TBS(TBS的配方为0.2mol/L NaCl，0.1mol/L Tris、50mmol/L EDTA，pH7.5)，经超声破碎后，离心收集包涵体，重新悬浮在无菌水中，滴入0.1mol/L NaOH至悬液澄清后，再加40-60mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH9.0)至溶液的pH值为9.0-9.5。复性后的样品过经40-60mmol/L Tris-HCl(pH9.0)预平衡的DE52柱，40-60mmol/L Tirs-HCl，pH9.0-7.0梯度洗脱，收集pH近7.0时的洗脱峰。
洗脱得到的样品作15％SDS-PAGE，呈现一条带，分子量约15KD。
HPLCC4柱分析呈现单一的峰，纯度在95％以上。等电点在pH6.5左右。
用小鼠L929细胞株细胞检测rhLTαDa的细胞毒活性，以杀死50％细胞时所用的rhLTαDa的量定为一个活性单位。几批纯化样品的比活性均高于2×108国际单位/毫克蛋白质。
抗hTNFα的抗体不能中和样品的细胞毒活性。用鼠抗人LTα抗体的Western印迹显示一条带。能被抗hLT的单抗中和表明样品是rhLTα。重组蛋白N端15个氨基酸的序列测定结果与设计相符为(Met)Lys Pro Ala Ala His Leu Ile Gly Asp Pro Ser Lys Gln Asn Ser离体试验表明rhLTαDa对人胃癌细胞株MKN-28和MKN-45生长有抑制作用。
活体试验对接种于雄性昆明种小鼠的小鼠s180和EC肿瘤细胞的生长抑制率为35％。
实施例根据本发明构建获得rhLTαDa，并对其分离纯化，离心收集菌体，将其悬浮于10倍体积的TBS(0.2mol/L NaCl，0.1mol/L Tris，50mmol/L EDTA，pH7.5)，经超声破碎后，离心收集包涵体，重新悬浮在无菌水中，滴入0.1mol/L NaOH至悬液澄清后，再加50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH9.0)至溶液的pH值为9.5。复性后的样品过经50mmol/LTris-HCl(pH9.0)预平衡的DE52柱，50mmol/L Tirs-HCl，pH9.0-7.0梯度洗脱，收集pH为7.0时的洗脱峰。洗脱得到的样品作15％SDS-PAGE，呈现一条带，分子量约15KD。HPLCC4柱分析呈现单一的峰，纯度为97％。用小鼠L929细胞株细胞检测rhLTαDa的细胞毒活性，纯化样品的比活性为2.8×108国际单位/毫克蛋白质。
权利要求
1.一种由改变人淋巴毒素α一级结构得到的淋巴因子重组人淋巴毒素α衍生物a，其特征为N端缺失27个氨基酸，包括附加上的第一个甲硫氨酸共145个氨基酸，分子量为15kD左右。
2.一种重组人淋巴毒素α衍生物a的构建，包括从人基因文库中克隆人淋巴毒素α基因，从人T细胞cDNA文库PCR扩增得到编码人淋巴毒素α成熟蛋白的cDNA和引物设计、克隆、表达重组人淋巴毒素α衍生物a，其特征在于1)编码人淋巴毒素α成熟蛋白的cDNA核苷酸序列中第26位氨基酸是Thr(ACC)；2)PCR扩增重组人淋巴毒素α衍生物acDNA的引物设计如下N端引物5’ACA CAT ATG AAA CCG GCT GCT CAC CTG ATC GGA(33mer)C端引物5’CCG AAT TCT ACA GAG CGA AGG CTC CAA AG(29mer)rhLTαDacDNA与hLTα原型比较，N端缺失27个氨基酸，加上一个甲硫氨酸密码子，第29位、33位和34位氨基酸的密码子改为大肠杆菌偏爱的密码子。
3.一种重组人淋巴毒素α衍生物a的纯化工艺，包括rhLTαDa包涵体溶解、复性和柱洗脱等步骤，其特征在于离心收集菌体，并将其悬浮于8-15倍体积的Tris缓冲盐溶液TBS，TBS的配方为0.2mol/LNaCl，0.1mol/L Tris，50mmol/L EDTA，pH7.5，再经超声破碎，离心收集包涵体，重新悬浮于无菌水中，滴入0.1mol/L NaOH至悬液澄清后，再加40-60mmol/L Tris-HCl(pH9.0)缓冲液至溶液的pH值为9.0-9.5，复性后的样品过经40-60mmol/L Tris-HCl(pH9.0)预平衡的DE52柱，40-60mmol/L Tris-HCl pH9.0-7.0梯度洗脱，收集pH近7.0时的洗脱峰。
全文摘要
本发明的rhLT α Da是以hLT α为原型进行结构改造而获得的基因工程产物。其核苷酸序列编码第26位氨基酸的密码子是ACC(Thr)。以原型hLT α cDNA为模板,经PCR扩增获得rhLT α Da cDNA。引物设计的特征是N端缺失27个氨基酸,将第29、33和34位氨基酸的密码子改为大肠杆菌偏爱密码子。rhLT α Da在大肠杆菌中以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的60—80%。建立了简便、有效的rhLT α Da纯化工艺,得到的rhLT α Da纯度在95%以上,比活高于2×10
文档编号C12N15/19GK1175638SQ9710660
公开日1998年3月11日 申请日期1997年9月10日 优先权日1997年9月10日
发明者李昌本, 赵寿元, 李平 申请人:复旦大学