使用扩增后培养步骤扩增和检测靶核酸的制作方法

专利名称：使用扩增后培养步骤扩增和检测靶核酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及扩增和检测靶核酸的方法。尤其涉及检测扩增的核酸产品的方法。本发明能用在各种医学和调查研究，法庭调查，和诊断方法中，如用于遗传疾病或传染性疾病的检测。
检测微量核酸的技术在过去的二十年中很快地发展着，其包括在扩增技术中如聚合酶链反应(PCR)中使用探针的高精尖杂化测定的发展。研究人员已经认识到这些技术对人类和动物试验样品测定疾病和遗传性特征的价值。在核酸的扩增和测定中使用引物和探针基于互补的概念，即，互补的核苷酸(已知为核苷酸对)之间通过氢键结合两股核酸链。
为发现扩增和测定小量DNA的方法已开展了许多研究。许多方法是已知的，并已用来扩增或大量地增殖样品中的核酸数量以备测定。这些扩增技术包括PCR，连接酶链反应(LCR)，和分支的DNA。
PCR是这些扩增方法中最为人所知的。PCR的详细说明在现有技术中很好地被描述，包括，如，U.S.专利4638195(Mullis等)，4683202(Mullis等)，和4965188(Mullis等)。不需要了解深入的细节，PCR涉及在合适条件下聚合剂(如DNA聚合酶)和脱氧核苷三磷酸盐的存在下杂化对靶核酸链的引物。结果是沿着模板的引物延伸产物的产生，产物要加入到对模板互补的核苷酸中。
一旦引物延伸产物变性并已制得模板的复制件，就可以将引发，伸展和变性循环进行所期望的次数，以提供与靶核酸有相同序列的核酸量指数增加。实际上，将靶核酸复制(或“扩增”)多次，使其更容易被检测。一旦靶核酸被充分放大，则可以使用多种检测方法定性和/或定量检测靶物的存在。
一旦靶核酸有效地被扩增，能使用各种测定方法测定它的存在。用来测定PCR产品的标准测定方法是溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶着色的琼脂糖凝胶。可是，使用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶着色的凝胶有几个缺点，包括，例如，相对小的敏感性和特异性。
免去放射性同位素标记和电泳的使用的测定PCR产品的改良的方法已经开发了。这些非同位素的寡核苷酸捕捉测定方法依靠对探针的特异杂化和酶促信号的产生。这些非同位素的寡核苷酸捕捉测定方法，已知也为反向斑点印迹检测(reverse dot blot detection)，在美国专利5229297(Schnepilsky等)，5328825(Warren等)，和5422271(Chen等)中描述。该方法也在Findlay等的《临床化学》(Clinical Chemistry)391927-1933(1933)中被描述。
这些非同位素测定方法比溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶着色测定有较高的敏感性和特异性，并能避免使用放射性。通过用生物素酰化引物或用生物素酰化探针测定扩增的核酸操作这些方法。生物素酰化产物或探针接着与抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素缀合酶反应，所述的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素缀合酶如辣根过氧化物酶(HRP)。然后染料前体(或光产生信号剂)能与酶接触并因而转化为产生可测信号的染料(发光)。
非同位素的寡核苷酸捕捉测定方法不是没有它们本身的缺点。如果通过使用标准PCR去活条件(95℃)以去活浓缩或极微稀释的扩增的核酸产物来操作非同位素的寡核苷酸捕捉测定，为进行扩增反应而使用的酶，如耐热性的聚合酶或DNA连接酶将仍存在并是有活性的。这些活性酶在测定期间的存在导致在酶和探针之间对扩增产物的连接竞争。此竞争能减少连接到探针的扩增的核酸产物的量，并因此减弱测定信号。
这个问题的一个解决方法是在进行扩增之后但在测定之前将高含量的二乙胺四乙酸(EDTA)，Mg++的轭合剂，加入到PCR扩增混合物中。EDTA能抑制许多需要Mg++激活的酶包括DNA聚合酶和DNA连接酶。但使用EDTA对PCR扩增和测定方法加入了一个额外的步骤。另外，使用EDTA需要打开反应容器加入EDTA。如本领域熟练技术人员所知的，因为担心污染，所以一定要避免打开反应容器。
因此，在测定中因为EDTA或别的这样的酶抑制剂的加入而中断扩增过程是不令人期望的。而且，希望找到不增加感染的危险而在测定之前使扩增酶失活的方法。
本发明的目的是通过在测定之前使用扩增后培养步骤使扩增酶失活来克服上述的问题。
在一个实施方案中，本发明涉及扩增并测定靶核酸的方法，包括(i)将怀疑含靶核酸的样本与至少二个寡核苷酸和一个耐热性的扩增酶接触，其中寡核苷酸在靶核酸扩增的条件下大体上是与靶核酸的一部分互补；(ii)使扩增的靶核酸失活以形成单链核酸；(iii)在1秒和30分钟之间和95℃和120℃之间培养样本，作为扩增后培养步骤使耐热性的扩增酶失活；和(iv)测定是否存在扩增的靶核酸。
在另一个实施方案中，本发明涉及扩增并测定靶核酸的方法，包括(i)在靶核酸扩增条件下，将怀疑含靶核酸的样本与四种不同的核苷三磷酸，一种耐热性的DNA聚合酶，和至少两个引物接触，其中探针大体上与靶核酸互补；(ii)使扩增的靶核酸变性以形成单链核酸；(iii)在1秒和30分钟之间和95℃和120℃之间培养样本，做为扩增后培养步骤使聚合剂失活；和(iv)测定是否存在扩增的靶核酸。
在另一个实施方案中，本发明涉及扩增并测定核酸的方法，包括(i)将怀疑含靶核酸的样本与四种不同的核苷三磷酸，一种耐热性的DNA聚合酶，和至少两个引物接触，其中至少一个引物用生物素标记，所有的引物大体上与靶核酸互补，在此条件下使靶核酸扩增；(ii)在0.5分钟和5分钟之间和约105℃培养样本，做为扩增后培养步骤使聚合酶失活；和(iv)通过将生物素酰化的扩增的靶核酸与抗生蛋白链菌素-酶缀合物反应，接着将酶与底物试剂反应得到可测定的比色的或化学发光的信号来测定是否存在生物素酰化的扩增的靶核酸。
从本发明的下面的描述，本发明的各种别的目的和优点将是明显的。
使用聚合酶链反应进行核酸的扩增和测定的通常的原理和条件是公知的，其详细说明提供在大量的参考中，包括美国专利4683195(Mullis et al.)，4683202(Mullis)，和4965188(Mullis et al.)，所有这些在这里引入并作为参考。因此，由于现有技术的教导和本文提供的具体的教导，本领域普通技术人员通过加入扩增后培养步骤使扩增酶在如前所述的产品测定之前失活以增加测定敏感性来实施本发明应该没有困难。
应用耐热性酶的其它扩增和测定方法也可在本发明的实施中应用。本发明提供扩增后测定前培养步骤，其使在扩增过程中使耐热性酶失活。因此，本发明适合使用于任何应用耐热性酶的扩增方法。别的耐热性扩增方法包括如所述的连接酶链反应(LCR)，例如，EP-A-0320308(1987，十二月公开)和EP-A-0439182(1990，一月公开)，其使用耐热性DNA连接酶连接邻接的探针由此产生互补的核酸序列。在LCR中靶核酸用4个寡核苷酸探针和一种耐热性DNA连接酶被放大。二个寡核苷酸探针与将被扩增DNA模板上的一个链上的邻接位点互补。这些探针与DNA链杂化以使在两个探针之间形成切口。然后用耐热性DNA连接酶密封切口，由此产生与靶标互补的新的DNA链。第三和第四个探针与第二个DNA模板链互补并如第一对探针起作用以产生互补DNA。能用标准测定方法测定LCR扩增的产物。本发明扩增后测定前培养步骤与LCR一起使用使DNA连接酶在测定之前失活。因此，本文提供的技术能够使本领域技术人员采用PCR所示的扩增后酶失活步骤进行其它已知的扩增和测定方法。本发明其余部分为详细说明而涉及使用PCR实施本发明。
为了改良测定敏感性，本发明提供有关PCR已知方法的修改。根据本发明令人惊讶地发现能使用扩增后测定前培养步骤使聚合剂失活并降低在探针和试剂之间对被扩增的靶核酸的结合竞争性。此降低的竞争增加了测定敏感性。
本发明涉及在试验样品中存在的一个或多个靶核酸的扩增和测定。试验样品可包括细胞的或病毒的材料，血液或别的含能测定的遗传性的DNA或RNA细胞材料。
将要扩增和测定的核酸能从各种来源得到，其包括质粒和任何来源(如细菌、酵母、病毒、植物、较高级动物、或人类)的天然存在的DNA或RNA。它可用已知方法从各种组织中提取，包括但不限于血液、外围血液单核细胞(PBMC)、组织材料或别的本领域已知的来源。本发明尤其对一个或多个核酸序列的扩增和测定是用的，所述的一个或多个核酸序列发现于基因组DNA、细菌DNA、真菌DNA、病毒DNA、或在细菌或病毒感染的细胞中发现的DNA或RNA。
本文所述的方法能用来扩增或测定与传染性疾病、遗传性疾病、和细胞疾病如癌症有关的靶核酸。它也可用在法庭调查和DNA分型。通过测定与之有关的核酸，它尤其可用于传染性试剂的测定，如细菌和病毒。当需要高敏感性和/或定量测定时，其特别有用。
能用本发明测定的细菌包括，但并非仅限于此，在人类血液中发现的细菌，如沙门氏菌种，链球菌种，衣原体种，淋球菌种，分枝杆菌种，(如结核分支杆菌和贪婪分枝杆菌(Mycobacterium avium)复合物)，类菌质体种，(如Mycoplasma Hemophilus influenzae和肺炎枝原体)，Legionella Pneumophiila，Borrella burgdorferei，卡氏肺囊虫，难辨梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)，弯曲杆菌属的种，耶尔森氏菌种，志贺氏菌种和李氏杆菌种。可测定的病毒包括，但并非仅限于此，细胞巨化病毒，单纯性疱疹病毒，EB病毒，人类乳状瘤病毒，流感病毒，肝炎病毒，和retroviruses(如，HTLV-I，HTLV-II，HIV-I和HIV-II)。原生动物的寄生虫，酵母和霉菌也可通过本发明测定。别的可测定的样品对本领域技术人员将是明显的。
“PCR试剂”指认为是PCR要素的任何试剂，即一套针对每个靶核酸的引物，DNA聚合酶，DNA聚合酶辅助因子，和一个或多个脱氧核苷-5’-三磷酸盐(dNTP’s)的试剂。在PCR中使用的别的任选的试剂和材料如下所描述。
术语“引物”指寡核苷酸，其是天然存在或合成的，能做为当放置在一定条件下时合成的起始点，在该条件下，与核酸链(即模板)互补的引物延伸产物的合成被诱导，这样的条件包括存在别的PCR试剂，和合适的温度和pH。
本发明所选的引物与将被引发和扩增的具体的核酸序列“大体上互补”。这意味着它们必须足够地互补来杂化各个核酸序列以形成所需的杂化产物并且然后用DNA聚合酶延伸。典型地，“大体上互补”的引物将含至少70％或更多的与靶序列互补的碱基。更优选80％的碱基是互补的，再优选90％的碱基是互补的。在最优选的条件下，引物对靶核酸序列具有90％至100％精确的互补性。
引物优选单链以达到最大扩增效率，但如需要能含双链区域。它必须足够长以起动在DNA聚合酶存在下延伸产物的合成。每个引物的确切大小将取决于希望的效用，引物的浓度和序列，靶序列的复杂性，反应温度，和引物的来源。通常，本发明所用的引物将有12至60个核苷酸，优选，16至40个核苷酸。更优选，每个引物有18至35个核苷酸。
本文所用的引物能用已知的技术和仪器制备，包括例如ABI DNA合成仪(来自Applied Biosystems)或Biosearch8600 Series或8800 Series合成仪(来自Milligen-Biosearch公司)。使用此仪器的方法已知并例如在美国专利4965188(Gelfand et al.)中描述，引入作为参考。从生物来源分离的天然存在的引物也是可用的(如限制性内切酶消化)。通常一套至少两个引物用于每个靶核酸。因此，多数引物能同时使用来扩增多数靶核酸。
如本文使用的，“探针”是大体上与靶核酸的核酸序列互补并用于扩增的靶核酸的测定或捕捉的寡核苷酸。
用在本发明中的引物和/或探针能可选地被标记。用本领域已知方法，引物和/或探针能用特异性结合配位体(如生物素)、酶(如葡萄糖氧化酶、过氧化酶、尿酸酶、和碱性磷酸酶)、放射性同位素、电子密度高的试剂、发色团、荧光团、燐光部分或铁蛋白标记。标记物优选特异性结合配位体。更优选生物素或它的衍生物，抗生蛋白链菌素或它的衍生物或半抗原。
对PCR必须的另外的PCR试剂包括DNA聚合酶(优选耐热性DNA聚合酶)，DNA聚合酶辅助因子和合适的dNTP′s。这些试剂能作为试验盒的一部分，或以试验装置的试剂室分别提供。
DNA聚合酶是将脱氧核苷酸单磷酸分子加入到引物和模板的复合物中引物的3’-羟基末端的酶，但这种加入是以模板依赖方式进行的。通常，延伸产物的合成以新合成链的5’到3’的方向进行，直至合成结束。
有用的DNA聚合酶包括，例如，大肠杆菌DNA聚合酶I，T4DNA聚合酶，Klenow聚合酶，逆转录酶和别的在现有技术中已知的。DNA聚合酶优选耐热性的，即指对热是稳定的，并优选在较高温度下具有活性的，尤其指用于起动反应和DNA链的延伸时所用的高温。更特别的是，耐热性DNA聚合酶用在如上所描述的聚合酶链反应中的高温下基本上不是无活性的。这样的温度将取决于一系列反应条件而变化，包括pH，核苷酸组成，引物长度，盐浓度和本领域已知的别的条件。
很多耐热性DNA聚合酶已在现有技术中报导过，包括详细论述它们的美国专利4965188(Gelfand et al.)和4889818(Gelfand et al.)，两者均收作参考。尤其有用的聚合酶是从各种栖热菌种，如水生栖热菌(Thermus aquaticus)，Thermus ther mophilus，Thermus filiformis，和Thermus flavus中获得的那些。别的有用的耐热性聚合酶是从各种微生物来源包括Thermocollus literalis，Pyrococcus furiosus，Thermotoga种中得到的那些以及在WO-A-89/06691(1989年，7月，27日公开)中描述的那些。一些有用的耐热性聚合酶是商业上可得到的，如来自Perkin Elmer的AppliTaqr，Tth，UITmaTM，和来自Stratagene的Pfu，和来自New England Biolabs的Vent和DeepVent。从有机体中分离天然存在的聚合酶，以及使用重组技术产生遗传上可操作的酶，所述的这些技术也是已知的。
DNA聚合酶辅助因子指非蛋白质化合物，酶可依靠其激活。因此，没有辅助因子的出现，酶是催化非活性的。一些材料已知是辅助因子，包括，但并非仅限于此，锰和镁盐，如氯化物、硫酸盐、乙酸盐和脂肪酸盐优选氯化镁和硫酸镁。
对于PCR，二个或更多的脱氧核苷-5’-三磷酸，如二个或更多的dATP，dCTP，dGTP，dTTP和dUTP是必须的。类似物如dITP和7-去氮杂-dGTP也是有用的。优选四个常用的三磷酸盐(dATP，dCTP，dGTP和dTTP)在一起使用。
这里所述的PCR试剂以合适的浓度提供并使用在PCR中提供靶核酸的扩增。扩增所必须的引物，DNA聚合酶，辅助因子和脱氧核苷酸-5’-三磷酸的最小量和合适的范围从已知技术中很容易得知。DNA聚合酶是最小量通常是至少约0.5单位/100μl溶液，优选约2至约25单位/100μl溶液，更优选约7至20单位/100μl溶液。对于所给的扩增系统，别的量也可以是有用的。一单位这里定义为于74℃下将10nmol核苷酸(dNTP’s)总量加入到延伸的核酸链30分钟所需要的酶活性量。引物最小量至少约0.075μmol，优选约0.1至2μmol，其它量是本领域公知的。辅助因子通常以约2至约15mmol存在。每个dNTP量通常是约0.25至约3.5mmol。
PCR试剂可分别提供，或以各种合并形式提供，或以有pH范围约7至约9的缓冲溶液形式一起予以提供，其可用任何合适的缓冲剂，许多是现有技术中已知的。
能用在PCR中别的试剂包括例如对耐热性DNA聚合酶特异的抗体，核酸外切酶和/或糖基化酶。抗体能用来在扩增前抑制聚合酶。在本发明中有用的抗体对耐热性DNA聚合酶是特异的，在低于约50℃温度抑制DNA聚合酶的酶活性，并在较高温度下使之失活。有用的抗体包括，单克隆抗体，多克隆抗体，抗体片段。抗体优选单克隆的。在本发明中使用的抗体能用已知的方法制备如在Harlow等的《抗体实验室操作》(AntibodiesA Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor，NY(1988)说明的。
代表性的单克隆抗体在U.S.5338671(Scalce等)中描述，其内容收作参考。两种这样的单克隆抗体很容易地使用常规方法由技术人员而获得，起始材料包括杂交瘤细胞系HB11126或11127，保藏于美国典型培养物保藏中心(ATTC)(Rockville，MD)。单克隆抗体以对DNA聚合酶摩尔比约5∶1至约500∶1的量存在。
对耐热性DNA聚合酶特异的抗体在本发明中能单独或与核酸外切酶和/或糖基化酶一起使用，如U.S.申请登记号08/385019中所描述的，其于1995，2，7日申请，发明人Sutherland等，题目“在聚合酶链反应中为增加特异性使用核酸外切酶和/或糖基化酶作为抗聚合酶抗体的补充”。抗体，核酸外切酶和糖基化酶的结合使用减低了零循环假象的形成。在PCR中使用的合适的核酸外切酶包括，但非仅限于此，核酸外切酶III，核酸外切酶I，核酸外切酶，T7核酸外切酶，核糖核酸酶II，多核苷酸磷酸化酶和BAL31核酸酶。这此核酸外切酶商业上是可以得到的或能用本领域已知方法获得。本发明所用的糖基化酶是特异地酶解非普通碱基的那些酶，即，在DNA中除A，G，C，T外的碱基和在RNA中除A，G，C，U外的碱基。优选时糖基化酶包括尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)，次黄嘌呤-DNA-糖基化酶，和3-甲-6-氨嘌呤-DNA-糖基化酶I和II。在优选的实施方案中，使用Taq聚合酶，抗Taq聚合酶的单克隆抗体，核酸外切酶III和尿嘧啶-N-糖基化酶。
靶核酸(DNA或RNA)能从上述的任何各种来源得到。通常，样品用某种方法处理使DNA可以和引物和别的PCR试剂接触。这指使用一种已知方法从样品中排除不需要的蛋白质和细胞物质。
因为要被扩增和测定的核酸常常是双链形式，所以在引发和扩增产生之前两链必须分开(即，失活)。只用热处理或其与如上所描述的分开核酸链的任何别的合适的物理的，化学的或酶解的方式结合能完成失活。开始的失活通常通过加热怀疑含靶核酸的样品进行，开始温度约85℃至约100℃进行合适的时间，例如，约1秒至3分钟。
然后失活的核酸链冷却至使核酸链引发的通常约55℃至约70℃范围的温度。开始的失活之后冷却核酸链需要的时间将根据PCR方法所用的仪器类型而变化。
当失活的核酸链对第二个温度时，失活核酸链与含PCR试剂的反应混合物在合适的温度一起培养，产生引物对核酸链的退火作用(杂化)和引物的延伸，形成引物延伸产物。通常，此温度至少约50℃，优选的范围约62℃至约75℃。培养的时间根据培养温度和所需的延伸产物长度而有很大变化，但在优选的实施方案中，时间是约1至约120秒。用二个或三个不同的温度进行每个PCR循环，其一温度用于变性，第二或第三个温度用于引发和/或引物延伸产物生成。
至少一个引物延伸产物产生之后的任何时间，能停止扩增并测定靶引物延伸产物(“扩增”的靶标)。可是，如果杂交的引物延伸产物继续变性，PCR能以所需的引发，延伸，和变性这样的许多循环进一步进行。进行的PCR循环的数量将部分地取决于所需要扩增的靶标量，并能容易地由本领域熟练技术人员测定。通常，至少进行20个循环，优选20至50个循环。
当扩增的成倍的靶核酸，尤其当靶标之一是低复制量靶标并且另一是高复制量靶标的情况，能在开始的PCR循环进行之后应用第二个复性步骤，如在美国专利申请登记号08/264102中所描述的，申请日1994年6月6日，申请人是Backus等，题目是“用中间的复性步骤扩增的方法”。至少15次基本扩增循环之后(基本扩增循环包括变性，引发和延伸)，以相同步骤进行第二个扩增循环，除了在每个变性步骤之后和引物退火之前包括复性步骤。复性通过冷却反应混合物至第四个温度完成，如美国专利申请08/264102所描述。
本发明中，用所需的PCR循环数扩增靶核酸之后，进行扩增后测定前培养步骤使DNA聚合酶失活，因此，增加测定敏感性。扩增后培养步骤进行的条件将取决于所用的耐热性酶但结合的温度和培养周期将是使酶失活的温度和周期。优选通过约95℃至约120℃在约1秒至30分钟培养含扩增靶物的PCR扩增混合物进行此扩增后培养步骤。扩增后培养步骤优选包括在100℃至110℃之间的温度加热15秒到10分钟，更优选约105℃5分钟以上。
当扩增后培养步骤进行后，能测定扩增的核酸靶物。能以多种已知的方式进行测定，如在美国专利4965188(Gelfand等)所描述的。例如，扩增的核酸能用Southern印迹，斑点印迹，或用标记的探针的非同位素寡核苷酸捕捉测定法检测扩增的核酸。或者，用适当标记的引物进行扩增，并且扩增的引物延伸产物能用标记物测定的方法和设备测定。
在优选的实施方案中，扩增的靶核酸用为测定而标记并能直接或间接地与扩增的靶物杂交的寡核苷酸探针测定。探针可以是可溶解的或附着在固体载体上。在另一个优选的实施方案中，用于扩增靶核酸的一个或多个引物被标记，例如，用特异的结合部分标记。被标记的引物被合并至得到的引物延伸产物，其能用探针捕捉。与探针杂交的扩增的靶物的测定能通过使用本领域已知的合适的测定仪器和方法测定标记的探针或标记的扩增的靶物的存在而完成。某种标记物是可以不用测定仪器而肉眼可见的。
在更优选的实施方案中，用来扩增靶核酸的一个或多个引物用生物素标记并且生物素酰化的扩增的靶核酸与附着于固体载体的探针杂交。然后被结合的靶物通过在氧化剂如过氧化氢，和合适的染料形成组合物存在的条件下将它们与抗生蛋白链菌素-过氧化酶轭合物接触而测定。例如，有用的染料提供试剂包括四甲基联苯胺和其衍生物，和无色染料，如三芳基咪唑无色染料，如在美国专利4089747(Bruschi)所述的。
如这里所用的，当指时间时，“约”指±10％的时间界限。当用来指温度时，“约”指±5℃。
下面的实施例包括具体描述本发明的实施，并非意味着以任何方式的限制。除非特别指明，所有百分数是重量比。实施例材料用已知方法如在EP-A-0482714所述的方法制备来自Thermus aquaticus的重组DNA聚合酶，其活性约250000单位/mg蛋白质。
下面实施例中所用的引物有下列顺序5′-CACCACGCAGCGGCCCTTGATGTTT-3′(SEQ.ID NO.1)5′-TGCACTGCCAGGTGCTTCGGCTCAT-3′(SEQ ID NO.1)捕捉探针有下列顺序5′-GAACCGAGGGCCGGCTCACCTCTATGTTGG-3′(SEQ.ID NO.3)用已知起始材料和方法制备用在下面实施例的引物和探针，其方法使用APPlide Bilsystems Model 380B，和用标准亚氨基磷酸酯(phosphoramidite)化学和ABI 1μ摩尔尺度快周期操作的三柱DNA合成仪。从Applied Biosystems得到核苷酸-3’-亚氨磷酸酯和核苷酸衍生物对照的大孔玻璃载体。引物有上面确认的顺序。根据美国专利4962029，它们在5’末端用二个氨基四甘醇间隔团接着用单个商业可得的Dupont生物素亚氨磷酸酯被作用。根据美国专利4914210，探针在3’末端用二个四甘醇间隔团，接着用单个氨二醇连结基团被作用。用核酸提纯柱，接着进行反相HPLC技术进行所有的提纯。脱氧核苷(dNTP’s)从Sigma化学公司得到。
使用抗生蛋白链菌素-过氧化酶轭合物溶液，其含在磷酸缓冲盐水溶液(24mmol磷酸钠和75mmol氯化钠)中的有商业上可得到的(Sigma化学公司)抗生蛋白链菌素和辣根过氧化酶轭合物，酪蛋白(0.5％)，和雷硫汞(0.5％)的轭合物，做为轭合剂稳定剂加入4’-羟基乙酰苯胺。实施例1和2中最终的轭合物浓度是1.1nM。实施例3中最终的轭合物浓度是0.28nM。
从Applied Biotechnology公司得到细胞巨化病毒，AD169DNA菌株。简单地说，用常规方法从人类包皮成纤维细胞系提取DNA。病毒种类表病毒 细胞巨化病毒，AD169菌株用于繁殖的细胞系人类包皮成纤维细胞病毒制备庶糖密度梯度提纯，1000×浓度病毒粒数1.65×1010vp/ml，1000×活性病毒的TCID50滴定率 10TCID50单位/ml，1000×DNA提取物具体情况容积0.1ml悬浮缓冲剂 10mM Tris/1mM EDTA，pH8.0提取物的制备SDS，蛋白酶K消化，接着苯酚/氯仿提取并且乙醇沉淀。从1ml纯病毒制备1ml提取液。运输和贮藏 于-70℃6×0.1ml冷冻(frozen)运输。于-20℃或更冷贮藏。
无色染料悬浮液含琼脂糖凝胶(0.5％)，4，5-双(4-二甲氨基苯基)-2-(4-羟基-3-甲氧基苯基)咪唑无色染料(250μmol)，二乙基三胺基五乙酸(100μmol)，3’-氯-4’-羟基乙酰苯胺(5mmol)，聚乙烯吡咯烷酮(112mmol)，和磷酸钠，单碱基，1-水合物(10mmol)和过氧化氢(H2O2)(8.82mmol)。
洗涤溶液(pH7.4)含氯化钠(373mmol)，乙二胺四乙酸二钠(2.5mmol)，十二烷基硫酸钠(38mmol)和ethylcerithio水扬酸，在磷酸钠，单碱基1-水合物缓冲剂(25mmol)中的钠盐(25μmol)。
单克隆抗体用在反应混合物中。这些抗体“TP1-12.2”和“TP4-9.2”对来自水生栖热菌的DNA聚合酶是特异的，更详细的描述在美国申请登记号08/385019，1995年2月7日申请，发明人Sutherland等，题目“使用核酸外切酶和/或糖化酶做为抗聚合酶抗体的补充以增加聚合酶链反应中的特异性”。
聚合酶链反应混合物(75ml)含三(羟甲基)氨甲烷缓冲液(10mmol，pH8)，氯化钾(50mmol)，氯化镁(4mmol)，dATP，dCTP，dGTP，和dTTP(各为0.3mM)，引物SEQID NO1和SEQ ID NO2(各为0.4μmol)，IV类型凝胶(100mg/mL)，Taq聚合酶(16单位/100μl)，和丙三醇(9.5％)。使用50倍摩尔过量(超过聚合酶)TP1-12.2和5×过量的TP4-9.2。
使用在美国专利5089233所述的自动PCR处理仪进行PCR扩增。
为了形成捕捉试剂，探针共价地与多聚的颗粒(1μm平均直径)结合，多聚的颗粒用常规的乳液聚合技术自聚[苯乙烯-共-3(对-乙烯基-苄硫基)丙酸](95∶5重量比，1μm平均直径)制备。水中的颗粒悬浮液用2-(N-吗啉代)乙烷磺酸缓冲液(0.1mol，pH6)洗涤，悬浮至约10％固体。洗过的颗粒样品(3.3ml)稀释到在缓冲液(0.1mol，与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(2.1ml，84mg/ml水)和探针983μl，44.44OD/ml纳纯水混合)中含固体3.33％。得到的悬浮液于50℃水浴加热大约二小时，伴随间断的搅拌，接着离心。然后颗粒用含乙二胺四乙酸二钠盐(0.001mol)的三(羟甲基)氨甲烷缓冲液(0.01mol，Ph8)洗涤三次，并在其中重新悬浮至含4％固体。接着颗粒以2％固体正性胶固定于临床诊断PCR囊中的不连续的点。使用临床诊断囊检测系统测定PCR产物。
别的试剂和材料从商业来源得到或用容易得到的起始材料和常规方法制备。为增加测定敏感性在产品测定之前进行扩增后培养步骤实施例1此实施例证明本发明将测定核酸产物，此核酸产物用PCR的方法通过应用扩增后培养步骤使聚合酶变性而生产。
正性库通过扩增CMV靶物使用下面的PCR规程40-45个循环产生1、于95℃加热15秒变性，并且2、于70℃引发和延伸30秒进行循环。产品浓度用凝胶电泳以已知浓度的DNA做为标准物质进行定量。然后得到扩增后PCR反应混合物如下所述使用。
除了产生PCR后反应混合物外，CMV负性产品库通过使用上述PCR方案，不加入CMV DNA靶物在PCR反应混合物上进行PCR扩增而制备。
扩增后PCR反应混合物(10-7至10-8M)用CMV负性产品库稀释至1∶100至1∶5000，得到最终CMV DNA浓度1×10-10M，2.5×10-11M，或5×10-11M。稀释的扩增后PCR反应混合物进行扩增后培养以使聚合酶失活。扩增后培养步骤于97℃或100℃进行2分钟，或于100℃进行5分钟。
扩增后培养之后，扩增的产物在临床诊断PCR囊中用捕捉试剂通过于58℃捕捉靶核酸5分钟而测定。然后捕捉的产物于55℃与抗生蛋白链菌素-过氧化物酶轭合物溶液接触并培养1分钟。用洗液于55℃下进行1分钟洗涤，其后，加入含染料组合物并于40℃培养4分钟。得到的信号用线性阵列扫描仪读取。扫描仪测定反射密度(ΔDr)的变化。在染料显色开始之前的起始读数和染料显色4分钟之后得到的最终读数之间的反射密度中的ΔDr是不同的。在可见的负性捕捉珠上扫描仪背景范围是0.05至0.1Dr单位。
下面的结果表明扩增后培养步骤增加检测敏感性扩增后产物 CMV_Dr培养条件 浓度 (扫描仪)97℃2分钟 1×10-10M 0.17597℃2分钟 5×10-10M 0.1497℃2分钟 2.5×10-11M 0.11100℃2分钟1×10-10M 0.265100℃2分钟5×10-11M 0.19100℃2分钟2.5×10-11M 0.13100℃5分钟1×10-10M 0.435100℃5分钟5×10-11M 0.31100℃5分钟2.5×10-11M 0.21这些结果表明于100℃的5分钟扩增后培养步骤增加了背景之上的有效测定界限至少四倍，并且可能至少五倍。基于这些结果，尤其通过将100℃培养期从2分钟增加到5分钟的改进，进行了第二个实验，其于100℃进行15分钟扩增后培养。实施例2在此第二个实验中，如实施例1所述进行CMV DNA的扩增。得到的扩增后PCR反应混合物用CMV负性产品库稀释，并进行扩增后培养使聚合酶失活，如实施例1所述。扩增后培养步骤于100℃进行15分钟。扩增后培养之后，扩增的产物如实施例1所述测定。
下面的结果表明扩增后培养步骤增加测定敏感性扩增后 产物CMV_Dr培养条件浓度 (扫描仪)97℃2分钟1×10-10M 0.14097℃2分钟1×10-10M 0.122100℃5分钟 1×10-10M 0.336100℃5分钟 1×10-10M 0.346100℃15分钟1×10-10M 0.503100℃15分钟1×10-10M 0.480这些结果表明于100℃增加扩增后培养步骤时间能得到额外的益处。实施例3为测定是否通过增加培养温度能实现额外的测定敏感的收益，如实施例1所述进行CMV DNA扩增，并于100℃或103℃进行扩增后培养。调查于103℃的不同培养时间。另外，用最终轭合物浓度0.28nM的较少敏感测定化学进行此试验扩增后 产物 CMV_Dr培养条件 浓度 (扫描仪)100℃5分钟1×10-10M 0.152100℃15分钟 1×10-10M 0.270103℃2分钟1×10-10M 0.264103℃5分钟1×10-10M 0.318这些结果证明至少额外的二倍的增加和可能的三倍的增加能通过将扩增后培养步骤温度由100℃升至103℃并维持五分钟的培养周期得到。
上述的所有公开出版物均收编为参考。
当前面所述的发明为清楚和便于理解的目的进行了详细说明时，应该了解本领域普通技术人员从本公开物的理解能进行形式和细节的各种改变但并不超出本发明的真实保护范围。
序列表(1)普通信息(i)申请人Backus，John W.
Kramer，Marcia L.
Falvo，Joseph(ii)发明题目使用扩增后培养步骤扩增并测定靶核酸(iii)序列数3(iv)通信地址(A)地址Stasia L.Ogden(B)街道￡°One J&J Plaza(C)城市New Brunswick(D)州New Jersey(E)国家USA(F)邮政编码08933(v)计算机可读形式(A)媒介类型柔性塑料磁盘(B)计算机IBMPC兼容的(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件专利信息卡#1.0，版本#1.25(vi)当前的申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类(viii)律师/代理人信息(A)姓名Ogden，Stasia L.
(B)登记号36228(C)参考/标签号CDS-92(ix)电讯信息(A)电话908-524-2819(B)传真908-524-2808(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征；(A)长度25个碱基对(B)类型核酸
(C)链单链(D)拓扑学线型(ii)分子类型DNA(基因组的)(iii)序列描述SEQ ID NO1CACCACGCAGCGGCCCTTGATGTTT(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度25个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑学线型(ii)分子类型DNA(基因组的)(iii)序列描述SEQ ID NO2TGCACTGCCAGGTGCTTCGGCTCAT(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑学线型(ii)分子类型DNA(基因组的)(iii)序列描述SEQ ID NO3GAACCGAGGGCCGGCTCACCTCTATGTTGG
权利要求
1.扩增并测定靶核酸的方法，包括(i)将怀疑含所述的靶核酸的样本与至少二个寡核苷酸和一种耐热性的扩增酶接触，其中所述的至少两个寡核苷酸大体上是与所述的靶核酸的一部分互补，在此条件下扩增所述的靶核酸；(ii)使扩增的靶核酸变性以形成单链核酸；(iii)在1秒和30分钟之间和95℃和120℃之间培养所述的样本，作为扩增后培养步骤使所述的耐热性的扩增酶失活；和(iv)测定是否存在所述的扩增的靶核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中使用四个寡核苷酸和一种耐热DNA连接酶。
3.扩增并测定靶核酸的方法，包括(i)将怀疑含所述的靶核酸的样本与四个不同的核苷酸三磷酸，一种耐热性的DNA聚合酶，和二个引物接触，其中所述的引物大体上是与所述的靶核酸互补，在此条件下扩增所述的靶核酸；(ii)使扩增的靶核酸变性以形成单链核酸；(iii)在1秒和30分钟之间和95℃和120℃之间培养所述的样本，作为扩增后培养步骤使所述的聚合剂失活；和(iv)测定是否存在所述的扩增的靶核酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述的扩增后培养步骤在100℃至约110℃进行15秒至10分钟。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述的扩增后培养步骤在约105℃进行0.5秒至5分钟。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述的靶核酸是DNA或RNA。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述的靶核酸是DNA。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述的靶核酸是RNA。
9.根据权利要求3所述的方法，其中所述的核苷酸三磷酸是脱氧核苷三磷酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述的脱氧核苷三磷酸是dATP，dCTP，dGTP，和dTTP。
11.根据权利要求3所述的方法，其中所述的耐热性DNA聚合酶选自thermus aquaticus聚合酶，thermus thermophilus聚合酶，和Thermococcus litoralis聚合酶。
12.根据权利要求3所述的方法，其中至少一种所述的引物是标记的。
13.根据权利要求3所述的方法，其中所述的引物是标记的。
14.根据权利要求12所述的方法，其中至少一种所述的引物是用特异结合配位基标记的。
15.根据权利要求14所述的方法，其中特异结合配位基是生物素。
16.根据权利要求3所述的方法，其中所述的扩增的靶核酸用标记过的探针测定，所述的标记过的探针能与一个或更多的靶核酸杂交。
17.根据权利要求16所述的方法，其中标记过的探针与固体载体附着。
18.根据权利要求3所述的方法，其中至少一种所述的引物用特异结合配位基标记，所述的扩增的靶核酸用能与一个或更多的靶核酸杂交的探针测定。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述探针与固体载体附着。
20.扩增并测定靶核酸的方法，包括(i)将怀疑含靶核酸的样本与四种不同的核苷酸三磷酸，一种耐热性的DNA聚合酶，和两个引物接触，其中所述的至少一个引物用生物素标记，所述的引物大体上是与所述的靶核酸互补，在此条件下使靶核酸扩增；(ii)在0.5分钟和5分钟之间和约105℃培养所述的样本，做为扩增后培养步骤使聚合酶失活；和(iv)通过将所述的生物素酰化的扩增的靶核酸与抗生物素蛋白-酶共轭物反应，接着将所述的酶与底物试剂反应得到可测定的比色的或化学发光的信号来测定是否存在所述的生物素酰化的扩增的靶核酸。
21.根据权利要求20所述的方法，其中通过将所述的生物素酰化的扩增的靶核酸与抗生物素蛋白-过氧化物酶轭合物接触，接着在氧化酶的存在下进行过氧化酶反应来测定所述的生物素酰化的扩增的靶核酸，所述的氧化剂是能产生可测定的化学光学信号的或能产生可测定的比色的信号的鲁米诺。
全文摘要
本发明涉及扩增和测定靶核酸的方法。其包括将怀疑含靶核酸的样本与一种耐热性的DNA聚合酶和两个引物接触，其中所述的引物大体上是与所述的靶核酸互补，在此条件下使靶核酸扩增。然后扩增的靶核酸变性形成单链核酸。扩增之后，样品进行测定前培养步骤。样品在1秒和30分钟之间和95℃至120℃培养使所述的聚合剂失活。最后，测定是否存在扩增的靶核酸。
文档编号C12N15/09GK1165862SQ97109620
公开日1997年11月26日 申请日期1997年3月11日 优先权日1996年3月11日
发明者J·W·贝克斯, M·L·克拉马, J·法尔沃 申请人:庄臣临床诊断有限公司