专利名称：治疗血液病的生物制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制剂，特别是一种治疗血液病的生物制剂。
现有治疗血液病如再生障碍性贫血、白血病时，一般采用化疗、放疗，使患者疗后产生白细胞减少，抵抗病毒能力下降、脱发等副作用，对人体健康有害。在药物治疗上一般采用雄性激素、左旋咪唑、氨太素、康力龙、生血片等，其治愈率较低、副作用较大，且药价昂贵。
本发明目的是提供一种治疗血液病的生物制剂，能明显改善骨髓造血功能，促进血液中红、白细胞同时增长，血小板数及吞噬细胞的活性明显增长，以增加人体抵抗力。该制剂对各种原因引起的白细胞减少症、再生障碍性贫血、白血病及因放疗、化疗导致的红、白血球减少症有显著疗效，且该制剂制做简单，价格低廉。
本发明目的是按如下技术方案实现的。该治疗血液病的生物制剂是在发酵液中加入菌种，经发酵工艺制成的，包括以下程序A、制作发酵液。该发酵液组成为在1000毫升蒸馏水中加入蛋白胨5-10克，酵母膏0.8-1.3克，蔗糖6-8克，氯化钠8-12克，甘露醇6-10克，将上述组分混合、加热、搅拌，使其溶解并过滤，调节PH值在7.2-7.8，再过滤、灭菌，在无菌条件下，在35-39℃下经24-48小时，制成发酵液。
B、收集菌种。将自然环境中存在的沙雷氏菌收集并分离出来，并在培养基中培养，得到菌种，它具有以下特点(与沙雷氏菌生物A型比较)为红色小菌落，用革兰氏染色法检验显革兰氏阴性小杆菌，在L-阿拉伯胶糖中不发酵。
1、生物特性(1)镜检形态G-短小杆菌，长0.5-1.0μm，宽0.5μm，有周身鞭毛，有微荚膜，无穿胞。
(2)菌落形态园形、湿润、光滑，边缘整齐，不透明，呈浅红、红或深红色。
(3)生物型属沙雷氏菌生物A型，在L-阿拉伯胶糖中不发酵。
(4)生化反应对甲基红呈阴性，对枸橼酸盐、VP、赖氨酸、乌氨酸、明胶、蔗糖、甘露醇、水杨苷、蕈糖、麦芽糖、果糖、七叶苷、触酶均呈阳性反应，有活力。用革兰氏法检验为呈革兰氏阴性小杆菌。
(5)对于抗生素的敏感性高敏反应的有庆大霉素、罗美沙星、阿罗西林、氟呱酸、氯霉素、壮观霉素、吡哌酸、链霉素、丁氨卡那霉素、羧基青霉素、头孢哌酮。低敏反应的有头孢唑啉、氨基青霉素、青霉素、头孢噻吩卡那霉素、利痛平、新霉素、
唑青霉素、麦迪霉素、杆菌肽。
(6)溶解性100-120℃时易容于水，在苦味酸盐中的溶点为173-176℃。
(7)PH值为6-7，在酸性环境中易变红。
(8)CO2培养25-37℃生长良好，厌氧环境下生长不良。相对密度为1.014。
(9)DNAG+C克分子量％为52-60。
2、理化指标(1)干燥固型物p(B)/(g.L-1);79.1，(2)砷p(AS)/(mg.L-1):(0.2，(3)汞ω(Hg)/(mg.Kg-1):(0.012，(4)铅p(Pb)/(mg.L-1):(0.1，(5)紫外可见扫描最大吸收波长λmax=257.5nm线性关系ψ(B)/(以原液计％)0.1～5.0浓度范围内γ=0.99989a=0.0247b=0.507上述菌种已于97年7月28日交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.0314，分类命名为粘质沙雷氏菌生物A型，拉丁文为Serratiamarcescens tgpe A。
c、制做药剂。将上述程序A制做的发酵液中接入由程序B制做的菌种，一并放入培养箱中在35-39℃经24-48小时发酵成为红色菌液。将该菌液浓缩过滤，分装瓶内，经高压灭菌即成药剂。
下面以本发明产品红色灵菌素做为实施例做具体介绍。
实施例1红色灵菌素制剂的制备。
A、制做发酵液。在1000毫升蒸馏水中另入水解蛋白胨8克，酵母膏1克，蔗糖7克，氯化钠10克，甘露醇10克，将上述组分混合热搅拌，使其溶于水中，过滤去渣；调节PH值为7.5；再过滤灭菌，在37℃下，经24小时，制成发酵液。
B、准备菌种。将收集分离出的沙雷氏菌在无菌条件下放在MH琼脂平板上，在37℃下保持24小时，生出粘质红色小菌落，用革兰氏染色法检验呈革兰氏阴性小杆菌，将该菌放入无菌的培养基中保存。该培养基可由下列组分配制牛肉膏3克蛋白胨10克氯化钠5克琼脂5克蒸馏水1000毫升将上述组分溶解、调PH值为7.4-7.6，过滤灭菌即成。
C、制做药剂。将用程序A制成的发酵液中接入用程序B制做的菌种，接种量为每毫升10亿的菌种液1-10毫升加入到1000毫升发酵液中。将二者一并放入培养箱中进行培养，在37℃下，经24小时，发酵成为红色的菌液，将其浓缩到原体积的20％，并经离心抽滤，分装在100毫升的瓶内。经高压蒸汽灭菌30分钟，或经煮沸灭菌30分钟，制成红色灵菌素。
实施例2红色灵菌素急性毒性实验药物红色灵菌素，高压消毒(红色灵菌素1)，煮沸消毒(红色灵菌素2)，共二批。为保证二批药物样品浓度一致，药物用紫外分光光度计比色后，按1∶1将两批药物混合，经比色使之与第一批药物浓度一致。然后将药物蒸发浓缩。
动物昆明小鼠，体重20±2克。
方法采用腹腔给药，每一剂量组10只动物，共设4-6组，组间剂量比分别为0.64-0.8，观察24～48小时死亡情况。按寇式法计算LD50及95％可信限。
结果实验结果见下表1表1．红色灵菌素LD50
小结实验结果表明，高压消毒的样品毒性明显小于煮沸消毒的样品，两样品LD50相差1倍以上，按《药理实验方法学》规定的标准，LD50大于1.0g/kg或1.0ml/kg，均属于低毒药物因此，高压消毒和煮沸消毒的样品均为低毒品。
实施例3红色灵菌素对小鼠血像的影响药物剂量红色灵菌素1和2，经5000rpm离心5分钟，取上清液经0.22um的滤膜过滤除菌备用。红色灵菌素1(高压消毒)采用13.6ml/kg和20ml/kg两个剂量(分别为LD50的1/5和1/3)；红色灵菌素2(煮沸消毒)采用5ml/kg和7ml/kg两个剂量(分别为LD50的1/7和1/5)。动物用BALB/c小鼠，体重20±2克，按上述剂量分组，每组6只动物，腹腔给药后分别于第1、3、5、7和9计数白细胞、网织红细胞和白细胞分类。结果见表2。
表2红色灵菌素对小鼠血像的影响给药后 红色灵菌素1 红色灵菌素2时间剂量 WBC Rt 剂量 WBC Rt0天13.613.8±2.17 -5.014.3±3.10 1.9±0.5020.010.7±2.95 2.1±0.37 7.016.3±2.16 2.3±0.271天13.621.4±4.17 -5.014.7±1.33 2.5±1.1520.080.2±11.56 0.7±0.89 7.024.7±2.51 5.2±0.833天13.623.0±4.78 -5.027.1±9.82 3.7±1.4520.033.8±13.37 2.8 ±0.80 7.032.8±8.87 3.4±0.805天13.6 - -5.051.0±26.54 5.2±1.7820.017.1±29.6 3.6±0.66 7.033.6±11.46 6.6±3.307天13.616.2±3.21 -5.016.8±5.23 6.7±3.0420.017.9±2.96 6.6±0.99 7.018.2±3.51 7.0±2.029天13.614.7±2.45 -5.016.5±2.80 7.5±3.5320.012.2±2.22 8.8±1.00 7.017.3±3.24 9.2±2.73小结和讨论结果表明，红色灵菌素1和2对小鼠血象有明显影响，给药后第一天，白细胞即明显增加，可达给药前的2倍以上，直到第5天仍明显升高，最高可达给药前的5-6倍，第7天后逐渐下降，至第9天基本恢复正常。网织红细胞的升高晚于白细胞，但是持续时间较长，至第9天基本仍高于正常，可达正常值的3-4倍。白细胞分类中以中性分叶核粒细胞为主，可达60％以上(是正常比例的1.5倍)早期伴有一过性单核细胞比例增加。对血象的作用，红色灵菌素1强于红色灵菌素2。在预试中，红色灵菌素1和2对白细胞都有刺激作用；为了排除死菌的影响，本实验采用离心、过滤除菌的方法进行实验，也获得同样结果，表明作用是一种可溶性物质。
实施例4红色灵菌素对小鼠巨噬细胞吞噬作用的影响药物剂量红色灵菌素1(高压消毒)制备如上述；按20ml/kg腹腔给药红色灵菌素2(煮沸消毒)；制备如上述；按7ml/kg腹腔给药对照生理盐水适量。动物昆明小鼠，体重22±2g方法1.墨汁的制备用5.0ml生理盐水置于干净平皿里，用优质墨研磨3分钟过滤备用。
2.分别给实验组和对照组动物腹腔注射红色灵菌素1、2和生理盐水，次日腹腔注入0.2ml墨汁，2小时后再注入1ml生理盐水，1分钟后抽腹水，涂片。结果如表3所示表3红色灵菌素对小鼠巨噬细胞吞噬作用的影响
小结红色灵菌素1和2均有明显促进小鼠腹腔吞噬细胞的吞噬作用尤以红色灵菌素2更为显著。经Ridit检验，P＜0.01。此外，还发现红色灵菌素1和2注射后，腹水中含大量的分叶核粒细胞。
总结1．红色灵菌素1和2两样品的LD50均大于1.0ml/kg，均属于低毒药物2．红色灵菌素有明显刺激白细胞增加的作用，分类计数以中性分叶核粒细胞为主；同时还发现网织红细胞也有明显增加，表明红色灵菌素对粒系和红色造血均有明显的刺激作用，其作用机理有待进一步研究。
3．红色灵菌素1和2均有明显促进小鼠腹腔吞噬细胞的吞噬活性。
以上的实施例2、3、4源自协和医科大学血液研究所的实验报告。
临床效果自96年以来临床应用口服本发明制剂红色灵菌素，治疗各种血液疾病20例，取得明显效果。用药方法为口服本发明制剂30毫升/次，早晚各一次，空腹服药。疗效判断分为痊愈、显效、进步、无效四种。结果为(1)再生障碍性贫血7例，均有半年以上的长期口服西药史，包括雄性激素、左旋咪唑、氨肽素、再障生血片等；其中3例曾肌肉注射呀秋碱达3个月，病情无好转；采用本制剂红色灵菌素治疗，其中1例仅3个月即痊愈；1例并用中草药益气生血药亦痊愈；4例显效，1例进步
(2)3例单纯白细胞减低、白塞氏病、过敏性紫癜，单服本制剂1-3个月均获痊愈。
(3)白血病4例。其中2例显效，另2例无效。
(4)放射疗、化疗后白细胞减少病6例，其中5例显效，1例进步。此外，本制剂对其它病症的效果有待临床报告。
权利要求
1．一种治疗血液病的生物制剂，其特征是它由以下程序制成A、制作发酵液。该发酵液由以下组分按重量比例组成蛋白胨5-10酵母膏0.8-1.3蔗糖6-8 氯化钠8-12甘露醇6-10蒸馏水1000将上述组分混合、加热、搅拌，使其溶解并过滤，调节PH值为7.2-7.8，再过滤灭菌，在无菌条件下，在35-39℃经24-48小时，制成该发酵液；B、准备菌种。将自然环境中存在的沙雷氏菌收集分离，在无菌条件下放在MH琼脂平板上，在35-39℃下保持24-48小时，发出粘质红色小菌落，即为菌种，放入无菌的培养基中保存；C、制做药剂。在A程序制成的发酵液中接入B程序的菌种，放入培养箱，在35-39℃下，经24-48小时，发酵成红色菌液，将该菌液浓缩、过滤、分装、灭菌制成该制剂。
2．根据权利要求1所述的治疗血液病的生物制剂，其特征是在程序1A中所述的蛋白胨为水解蛋白胨。
3．根据权利要求1所述的治疗血液病的生物制剂，其特征是在程序1C中所述的灭菌为高压蒸汽灭菌30分钟。
4．根据权利要求1所述的治疗血液病的生物制剂，其特征是在程序1C中所述的灭菌为沸水中煮灭菌30分钟。
5．根据权利要求1所述的治疗血液病的生物制剂，其特征是在程序1B中所述的粘质红色小菌落为粘质沙雷氏菌生物A型(Serratia Marcescens TgpeA)，保藏号CGMCC0314。
6．根据权利要求1所述的治疗血液病的生物制剂，其特征是在程序1B中所述的培养基按下列组分配制牛肉膏3克蛋白胨10克 氯化钠5克琼脂5克 蒸馏水1000毫升将上述组分溶解、调PH值为7.4-7.6，过滤灭菌。
7．根据权利要求1所述的治疗血液病的生物制剂，其特征是在程序1C中所述的接种量为将10亿/ml菌种液1-10ml加入1A制成的发酵液1000ml中。
全文摘要
本发明是一种治疗血液病的生物制剂,它能使血液中红细胞增长,它由发酵液与菌种发酵制成,发酵液由蛋白胨、酵母膏、蔗糖、氯化钠、甘露醇、蒸馏水混合加热制成;菌种为沙雷氏菌生物A型,为粘质红色小菌落,将菌种加入到发酵液中,一起放入培养箱内,发酵成红色的菌液,将该菌液浓缩、过滤、分装、灭菌即成制剂红色灵菌素,本制剂治疗再生障碍性贫血、白血病有显著疗效,且制作简单,成本低廉。
文档编号C12N1/20GK1223864SQ98103328
公开日1999年7月28日 申请日期1998年7月28日 优先权日1998年7月28日
发明者马家兰, 魏美华 申请人:马家兰