一种提高纳豆水提取物对α-葡萄糖苷酶抑制率的纳豆制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高纳豆水提取物对α-葡萄糖苷酶抑制率的纳豆制备方法，包括如下步骤：在熟黄豆中加入纳豆枯草芽孢杆菌，混匀，其中，熟黄豆与纳豆枯草芽孢杆菌的质量体积比为30-60:1，g：ml；所述纳豆枯草芽孢杆菌的OD600＝0.5-1.2；发酵：发酵温度为28-32℃，发酵湿度为60-80％，发酵时间为55-72h；后熟：后熟温度为2-6℃，后熟时间为24-48h。本发明选用处于快速生长期的菌液，并改进了纳豆发酵条件，制备的纳豆对α-葡萄糖苷酶的抑制率可提高6倍以上。
【专利说明】
一种提高纳豆水提取物对α-葡萄糖苷酶抑制率的纳豆制 备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种提高纳豆水提取物对α -葡萄糖苷酶抑制率的纳豆制备方法。
【背景技术】
[0002] 纳豆是一种保健食品，是大豆经过纳豆枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto)发酵而成的发酵豆制品。纳豆起源于中国，后传入日本，并在日本盛行1000多年。 纳豆含有多种人体所需的生理活性物质，比如：纳豆激酶、溶菌酶、α -葡萄糖苷酶抑制物、 维生素 Κ、多聚氨基酸、多聚果糖，具有溶血栓、降血压、降血糖、降血脂以及预防动脉粥样硬 化等多种功能。其中，纳豆激酶有良好的溶血栓作用而受到广泛研究，纳豆对α-葡萄糖苷 酶的抑制作用则可以降血糖。但是，纳豆对α-葡萄糖苷酶的抑制作用一直少有报道，这是 因为现有生产工艺（纳豆枯草芽孢杆菌的〇D_= 1. 7,发酵温度35°C，发酵时间24h)生产 的纳豆对α -葡萄糖苷酶抑制率非常低，降血糖的效果非常有限。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种提高纳豆水提取物对α -葡萄糖苷酶抑制率的纳豆 制备方法，选用处于快速生长期的菌液，使用独特的发酵工艺，大幅度提高纳豆对α -葡萄 糖苷酶的抑制率。
[0004] 为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
[0005] -种提高纳豆水提取物对α -葡萄糖苷酶抑制率的纳豆制备方法，包括如下步 骤：
[0006] 1)在熟黄豆中加入纳豆枯草芽孢杆菌，混匀，其中，熟黄豆与纳豆枯草芽孢杆菌的 质量体积比为30-60 :1，g :ml ;所述纳豆枯草芽孢杆菌的0D6。。= 0. 5-1. 2 ;
[0007] 2)发酵
[0008] 发酵温度为28-32 °C，发酵湿度为60-80%，发酵时间为55-72h ;
[0009] 3)后熟
[0010] 后熟温度为2-6°C，后熟时间为24-48h。
[0011] 进一步，步骤1)中所述纳豆枯草芽孢杆菌的OD6。。优选为0. 5-1. 0。
[0012] 步骤2)中所述发酵时间优选为55-65h。
[0013] 又，本发明所述提高纳豆水提取物对α -葡萄糖苷酶抑制率的纳豆制备方法，包 括如下步骤：
[0014] 1)在熟黄豆中加入纳豆枯草芽孢杆菌，混匀，其中，熟黄豆与纳豆枯草芽孢杆菌的 质量体积比为50:1，g :ml ;所述纳豆枯草芽孢杆菌的0D_= 0. 7 ;
[0015] 2)发酵
[0016] 发酵温度为30°C，发酵湿度为70%，发酵时间为60h ;
[0017] 3)后熟
[0018] 后熟温度为4°C，后熟时间为24~48h。
[0019] 本发明中熟黄豆与纳豆枯草芽孢杆菌的质量体积比为30-60:1，g :ml，纳豆枯草 芽孢杆菌可以与熟黄豆充分接触，有利于纳豆枯草芽孢杆菌的快速繁殖。
[0020] 所述纳豆枯草芽孢杆菌的〇D6。。= 0. 5~1. 2 :常规工艺中使用OD 6。。> 1. 6的菌 液，此时纳豆枯草芽孢杆菌进入生长稳定期，细菌的活力降低。为了增加纳豆对α-葡萄糖 苷酶的抑制率，本发明使用〇D_= 0. 5~1. 2的纳豆枯草芽孢杆菌，此时细菌处于快速生 长期，与熟黄豆接触后可以直接以指数级扩增，无需经过一段时间再进入快速生长期，有效 增加了纳豆对α -葡萄糖苷酶的抑制率；同时，细菌的0D_= 0. 5~1. 2时，细菌内各个蛋 白质正处于高活性的状态，这些蛋白质与熟黄豆相互作用，最大效率地生产各种α-葡萄 糖苷酶抑制物，其中，优选〇D 6。。= 0. 5~1. 0。
[0021] 本发明中发酵温度为28-32°C，发酵时间为55-72h :28-32°C为芽孢杆菌属细菌的 最适生长温度，纳豆枯草芽孢杆菌在这个温度下可以最快速地繁殖，菌量越多，细菌体内与 熟黄豆相互作用生产各种α-葡萄糖苷酶抑制物的蛋白质越多，生产的各种α-葡萄糖苷 酶抑制物越多。其中，本发明中发酵时间优选55-65h。
[0022] 本发明中后熟温度为2_6°C，后熟时间为24_48h :经过后熟过程，纳豆枯草芽孢杆 菌停止生长，此时口感较佳。
[0023] 本发明通过改进纳豆制备工艺，制备得到的纳豆可高效抑制α -葡萄糖苷酶，对 α-葡萄糖苷酶的抑制可以有效地降低人和动物体内的血糖浓度，大幅提高纳豆的降血糖 保健功能。
[0024] 本发明的有益效果：
[0025] 1.本发明选用OD6。。为0. 5~1. 2的纳豆枯草芽孢杆菌，此时细菌处于快速生长 期，与熟黄豆接触后可以直接以指数级扩增，有效增加了纳豆对α -葡萄糖苷酶的抑制率。
[0026] 2.本发明研究发现=OD6。。为0. 5~1. 2的纳豆枯草芽孢杆菌在28-32Γ下最适合 生长，可快速繁殖，同时发酵时间为55_72h，在此条件下发酵可进一步提高纳豆对α -葡萄 糖苷酶的抑制率。
[0027] 3.本发明大幅提高了纳豆对α -葡萄糖苷酶的抑制作用，具体是纳豆对α -葡萄 糖苷酶的抑制率可提高6倍以上。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。
[0029] 下列实施例中如无特殊说明，均为《分子克隆实验指南（第三版）》（科学出版社， 2002年）《微生物实验》（化学工业出版社，2010年）所记载的方法。
[0030] 以下实施例中，化学试剂和实验材料从杭州南天生物科技有限公司购买。蒸大豆、 材料灭菌使用上海申安LDZX-50KBS高压灭菌锅。所有无菌操作在苏净安泰SW-CJ-2FD超 净工作台中进行。细菌培养在一恒THZ300C摇床中进行。纳豆生产所需的温度和湿度在一 恒LHS-150SC恒温恒湿培养箱中进行，湿度为70%。纳豆后熟在海尔B⑶-649WE冰箱的冷 藏室（4°C )中进行，纳豆制备完毕后在海尔B⑶-649WE冰箱的冷冻室（零下20°C )中保 存备用。纳豆枯草芽孢杆菌600纳米的吸光度（OD6J和葡萄糖检测中505纳米的吸光度 (OD5q5)使用BioTek Elx808酶标仪检测。
[0031] 实施例1.黄豆和纳豆枯草芽孢杆菌的预处理
[0032] 熟黄豆的处理方法如下：
[0033] 称取1000 g干黄豆，加入500ml清水，浸泡12小时；黄豆取出，沥水，放入高压灭菌 锅中，121°C，蒸20分钟；取出黄豆，降温至室温，称黄豆，此时熟黄豆质量为1560g。
[0034] 纳豆枯草芽孢杆菌的处理方法如下：
[0035] 1.购买北京川秀国际贸易有限公司的川秀纳豆菌，称取lg，溶于500ml-lL灭菌水 中；
[0036] 2.用灭菌牙签沾取菌液以平板划线法接种到LB平板（1%胰蛋白胨，0. 5酵母提取 物，1%氯化钠，1.5%琼脂，？!17.4，121°(：灭菌15分钟后，倒入灭菌平板中）上，30°(：培养24 小时；
[0037] 3.挑取单克隆放入100ml LB液体培养基（1%胰蛋白胨，0. 5酵母提取物，1%氯化 钠，1.5%琼脂，pH7.4，121°C灭菌15分钟）中，在摇床中以30°C，250转/分钟的条件培养 纳豆枯草芽孢杆菌；
[0038] 4.摇菌6个小时后，每个小时检测一次OD6。。值，取出OD6。。值为0. 5、0. 7、I. 0、1. 2、 1. 7的纳豆枯草芽孢杆菌IOml备用。
[0039] 实施例2.利用不同生长阶段的纳豆枯草芽孢杆菌生产纳豆
[0040] 1.取4个灭菌的塑料饭盒，分别加入实施例1中处理的熟黄豆50g。
[0041 ] 2.使用LB液体培养基将0D_值为0. 5、1. 0、1. 2的纳豆枯草芽孢杆菌菌液均稀释 到0D6。。= 0. 7,稀释后的菌液与OD _值为0. 7的菌液的细菌浓度相同。
[0042] 3.将Iml 0D_值为0· 5的稀释后的菌液、OD 6。。值为0· 7的菌液、OD 6。。值为L 0、 1. 2的稀释后的菌液分别加入上述4个装有熟黄豆的灭菌塑料饭盒中，使用灭菌筷子将塑 料饭盒中的熟黄豆和菌液拌匀。
[0043] 4.将塑料饭盒放入培养箱中，30°C，培养60小时，每隔8个小时使用灭菌筷子将黄 豆搅拌一次。
[0044] 5.将培养好的纳豆放入4°C冰箱，后熟24小时后，放入零下20°C冰箱备用，依次标 记为ODl纳豆、0D2纳豆、0D3纳豆、纳豆0D4。
[0045] 实施例3.不同发酵温度下生产纳豆
[0046] 1.取3个灭菌的塑料饭盒，分别加入实施例1中处理的熟黄豆30g。
[0047] 2.将Iml 0D_值为0. 7的菌液分别加入至上述3个装有熟黄豆的灭菌塑料饭盒 中，并分别标记为1-3号。使用灭菌筷子将塑料饭盒中的熟黄豆和菌液拌匀。
[0048] 3.将1号塑料饭盒放入一个培养箱中，28°C，培养60小时，每隔8个小时使用灭菌 筷子将黄豆搅拌一次；
[0049] 将2号塑料饭盒放入一个培养箱中，30°C，培养60小时，每隔8个小时使用灭菌筷 子将黄豆搅拌一次；
[0050] 将3号塑料饭盒放入一个培养箱中，32°C，培养60小时，每隔8个小时使用灭菌筷 子将黄豆搅拌一次。
[0051] 4.在第60小时，取出1-3号塑料饭盒，将培养好的纳豆放入4°C冰箱，后熟24小 时后，放入零下20°C冰箱备用，分别标记为1号纳豆、2号纳豆、3号纳豆。
[0052] 实施例4.不同发酵时间下生产纳豆
[0053] 1.取4个灭菌的塑料饭盒，分别加入实施例1中处理的熟黄豆60g。
[0054] 2.将Iml 0D_值为0. 7的菌液分别加入至上述4个装有熟黄豆的灭菌塑料饭盒 中，并分别标记为4-7号。使用灭菌筷子将塑料饭盒中的熟黄豆和菌液拌匀。
[0055] 3.将4-7号塑料饭盒放入一个培养箱中，30°C，培养72小时，每隔8个小时使用灭 菌筷子将黄豆搅拌一次。
[0056] 4.在第55小时，取出4号塑料饭盒，将培养好的纳豆放入4°C冰箱，后熟24小时 后，放入零下20°C冰箱备用，标记为4号纳豆；
[0057] 在第60小时，取出5号塑料饭盒，将培养好的纳豆放入4°C冰箱，后熟24小时后， 放入零下20°C冰箱备用，标记为5号纳豆；
[0058] 在第65小时，取出6号塑料饭盒，将培养好的纳放入4°C冰箱，后熟24小时后， 放入零下20°C冰箱备用，标记为6号纳豆；
[0059] 在第72小时，取出7号塑料饭盒，将培养好的纳豆放入4°C冰箱，后熟24小时后， 放入零下20°C冰箱备用，标记为7号纳豆。
[0060] 对比例1现有工艺生产纳豆
[0061] 1.取1个灭菌的塑料饭盒，加入实施例1中处理的熟黄豆50g。
[0062] 2.使用LB液体培养基将OD6。。值为1. 7的纳豆枯草芽孢杆菌菌液均稀释到OD 6。。 =0. 7,稀释后的菌液与0D_值为0. 7的菌液的细菌浓度相同。
[0063] 3.将Iml稀释后的菌液加入至上述装有熟黄豆的灭菌塑料饭盒中，使用灭菌筷子 将塑料饭盒中的熟黄豆和菌液拌匀。
[0064] 4.将塑料饭盒放入一个培养箱中，35°C，培养24小时，每隔8个小时使用灭菌筷子 将黄豆搅拌一次。
[0065] 5.在第24小时，取出塑料饭盒，将培养好的纳豆放入4°C冰箱，后熟24小时后，放 入零下20°C冰箱备用，标记为对比例1纳豆。
[0066] 实施例5.检测纳豆对α -葡萄糖苷酶抑制率
[0067] 本实施例使用未发酵的熟黄豆作为阴性对照，标记为0号，具体检测步骤如下：
[0068] 1.分别将实施例2、3、4、对比例1装有纳豆的塑料饭盒从零下20°C冰箱取出，放 入灭菌锅中121°C灭菌20分钟，这样可以将纳豆中具有类似α -葡萄糖苷酶活性的酶类灭 活。
[0069] 2.在50ml离心管中加入Ig灭菌后的纳豆或者未发酵的熟黄豆（阴性对照）、3ml 灭菌水和2个直径6mm的灭菌钢珠。
[0070] 3.将步骤2中的50ml离心管放入净信JXFSTPRP-24全自动组织研磨机中，研磨频 率为50Hz/秒，运行1分钟，纳豆被完全磨碎；从50ml离心管中取出lml，转移至I. 5ml离 心管中，在Eppendorff台式离心中以12000转/分钟的速度离心5分钟，除去不溶于水的 沉淀物。
[0071] 4.从离心后的1.5ml离心管中取出上清10 μ 1，加入0.2ml塑料管中，然后加 入10μ1 lU/μΙ的α-葡萄糖苷酶溶液，放入培养箱中，37°C，反应10分钟；在反应后的 0. 2ml塑料管中继续加入80 μ 1 0. 1 %的麦芽糖溶液，放入培养箱中，37 °C，反应30分钟。
[0072] 5.在酶标板中加入20 μ 1步骤6反应后的溶液和80 μ 1反应液（南京建成生物技 术有限公司的葡萄糖检测试剂盒），将酶标板放入培养箱中，37°C，反应5分钟。
[0073] 6.将酶标板放入酶标仪中，检测各个样品在505纳米的吸光度（ODm5数值）。使 用公式计算纳豆对α -葡萄糖苷酶抑制率，抑制率（％)= 100X (A-B)/A，A表示未发酵的 熟黄豆（阴性对照）的OD505数值，B表示纳豆的OD 5。5数值。
[0074] 实施例2制备的纳豆对α -葡萄糖苷酶抑制率的检测结果如表1所示，实施例3 制备的纳豆对α -葡萄糖苷酶抑制率的检测结果如表2所示，实施例4、对比例1制备的纳 豆对α -葡萄糖苷酶抑制率的检测结果如表3所示。由表1-3可知，与现有生产工艺相比， 本发明生产的纳豆对α-葡萄糖苷酶的抑制率可提高6倍以上。
[0075] 表 1
【主权项】
1. 一种提高纳豆水提取物对α -葡萄糖苷酶抑制率的纳豆制备方法，其包括如下步 骤： 1) 在熟黄豆中加入纳豆枯草芽孢杆菌，混匀，其中，熟黄豆与纳豆枯草芽孢杆菌的质量 体积比为30-60 :1，g :ml ;所述纳豆枯草芽孢杆菌的0D6QQ= 0. 5-1. 2 ; 2) 发酵 发酵温度为28-32 °C，发酵湿度为60-80%，发酵时间为55-72h ; 3) 后熟 后熟温度为2-6°C，后熟时间为24-48h。2. 根据权利要求1所述的纳豆制备方法，其特征在于，步骤1)中所述纳豆枯草芽孢杆 菌的 〇D6(W= 0· 5-1. 0。3. 根据权利要求1所述的纳豆制备方法，其特征在于，步骤2)中所述发酵时间为 55-65h。
【文档编号】A23L1/20GK105982035SQ201510073997
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月12日
【发明人】方军, 张小峰, 杨瑞芳, 白建江, 朴钟泽
【申请人】上海市农业科学院, 上海创博食品技术发展有限公司