专利名称：含吡咯并喹啉醌的治疗铅中毒的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及在哺乳动物特别是人和温血动物中，治疗铅中毒的药物组合物。该组合物包含吡咯并喹啉醌(或其盐)作为活性成分。
铅在人们生活环境中广泛存在，如食物、染料、空气、水和土地。铅还在工业生产中广泛应用，如电池、油漆和汽油的添加物等。造成环境中铅过量的主要因素是工业生产和交通等引起的污染。
铅中毒的早期症状是常感乏力、口腔金属味、肌肉关节酸痛等，随后为腹部隐痛、神经衰弱综合征。随病情的进展，可累及以下各个系统A)神经系统主要表现为神经衰弱综合征、外周神经炎，严重者可出现铅中毒性脑病。
B)消化系统有食欲不振、恶心、腹胀、腹隐痛、腹泻或便秘。
C)造血系统卟啉代谢障碍、点彩红细胞、网织红细胞增多等。
D)其它肾脏受到一定损害，少数患者可出现蛋白尿。孕妇铅中毒引起畸胎率上升。
人们对铅中毒已进行了长期和广泛的研究，并获得了一些研究成果。然而，铅中毒机理在某些方面尚待阐明。一种观点认为，铅在细胞内可与蛋白质的巯基结合，通过抑制磷酸化而影响能量产生以及抑制三磷酸腺苷酶而影响细胞膜的运输功能，从而抑制细胞色素的生成。另一种观点认为在铅中毒机理中卟啉代谢紊乱为重要和较早的变化之一，导致血红素合成的障碍。
铅中毒不仅是一种常见职业病，而且也累及普通百姓，特别是生活在大城市的居民。儿童因生活习惯及肠对铅的吸收能力强、滞留比例高，更易受到影响。儿童急性铅中毒(血铅大于80ug/L)会导致昏迷，甚至死亡。低剂量铅(血铅在10-25ug/L)会影响中枢神经系统、肾脏和造血系统。有资料表明，16％的美国儿童血铅水平已达神经毒性范围。发展中国家工业生产和汽车尾气造成的环境污染更为严重。我国铅中毒的检测标准为血铅大于100ug/L，上海地区儿童血铅调查结果平均值为1997年83ug/L；1998年80ug/L，其中铅中毒比例分别为37.8％和25.7％。1998年扬州儿童的铅中毒比例为56.6％。
综上所述，我国城市居民的平均血铅浓度已大大超出了国际健康标准，铅已经成为儿童身体健康和智力发育的杀手。对铅中毒的治疗和预防是一亟待解决的问题。
就目前主要的铅中毒治疗药物而言，依地酸钙(CAEDTA)、钙促排灵(CADTPA)多年来曾经作为驱铅的首选药物。但动物实验已证明，使用这类药物可引起肾小管坏死，而且在络合排铅的同时也排出与人体酶活性密切相关的锌、铜、锰、铁等，故这类药物现已少用。
二巯基丁二酸钠(NADMS)是国内首创的药物，对肾脏无毒性，在用药期间微量元素损失不多，对一般铅中毒及急性铅绞痛疗效与依地酸钙相当。轻度中毒剂量为1g/天，中度中毒剂量增加1-3倍，可用肌注或静注。主要副作用有口臭、头晕、头痛、恶心、呕吐、四肢酸痛等。
因此，本领域迫切需要开发新型安全有效的铅中毒治疗药物。
本发明的目的就是提供一种治疗铅中毒的药物组合物，它含有(1)安全有效量的吡咯并喹啉醌和/或其药学上可接受的盐作为活性成分，以及(2)药学上可接受的载体。
较佳地，所述活性成分的含量为0.01％-99％；更佳地，所述活性成分的含量为O.1％-90％。
在本发明的另一实施例中，该药物组合物还含有选自下组的物质维生素、人体必需的金属离子等。
本发明的另一目的是提供一种吡咯并喹啉醌的用途，它用于制备治疗铅中毒的药物。
图1显示了FPLC方法鉴定PQQ标准品和纯化的PQQ产品的结果。
在本发明中，使用如下定义本文中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的药物组合物。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本文中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。
本文中，术语“安全有效量”指按本发明的方式使用时足以获得需要的治疗反应而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的成分的量。显然，具体的“安全有效量”因各种因素而异，如受治疗的特殊病情、患者的身体条件、受治疗的哺乳动物的种类、疗程、同时进行的治疗的种类(如果有的话)、所应用的具体制剂和化合物或其衍生物的结构。
本文中，“活性成分”包括吡咯并喹啉醌及其药学上可接受的盐。代表性的盐包括(但并不限于)钠盐、钾盐、锌盐等。
本文中，“药物载体”是用于将吡咯并喹啉醌传送给动物或人的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体，可根据给药方式而选择的。
本文中，“铅中毒”指哺乳动物中的铅浓度高于正常的合理水平。
本发明的本发明人经过多年研究，意外地发现吡咯并喹啉醌(一种已知化合物)可以明显地减低动物体内铅浓度，在此基础上完成了本发明。
吡咯并喹啉醌的分子量为330，其结构式如下 吡咯并喹啉醌最早是从微生物中发现的，它的晶体结构和化学合成都已经解决。目前已发现，高等真核生物体内也有吡咯并喹啉醌存在。吡咯并喹啉醌是细菌中多种重要酶类的辅基，并能影响呼吸链功能与体内自由基水平。在研究中发现吡咯并喹啉醌缺乏的小鼠生长缓慢，生殖能力差，并容易产生关节炎症，因此有人认为吡咯并喹啉醌是体内必需的营养物质之一。
在本发明之前，吡咯并喹啉醌被认为具有如下4种主要生理功能(1)抗氧化；(2)对毒素引起的肝损伤起防护作用；(3)加快对乙醇的降解；(4)促神经生长作用。然而，并没有提及或暗示吡咯并喹啉醌有对铅中毒的保护作用。
研究表明，吡咯并喹呤醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)具有良好的解重金属毒性的功能。在用纯化吡咯并喹啉醌治疗铅中毒小鼠模型实验中，也观察到显著的疗效。铅中毒小鼠血铅浓度由1.13mg/L下降到0.59mg/L，且没有观察到明显的毒副作用。
用于本发明的吡咯并喹啉醌可以是天然的，非天然的。较佳地，所述的吡咯并喹啉醌是人工合成的或发酵产生的。
国际上，吡咯并喹啉醌主要以化学方法合成，一般以酪氨酸分子作为碳和氮的骨架，通过一个dopaquinone的中间体，经一系列反应得到吡咯并喹啉醌[Hendrickson and deVries，1982，J.Org.Chem.471148-1150；Gainor andWeinreb，1982，J.Org.Chem.472833-2837；Buchi et al.，1985，J.Am.Chem.Soc.1075555-5556；Gainor and Weinreb，1982，J.Org.Chem.464317-4319]。然而，这些化学合成的方法存在步骤多、成本高、反应副产物不易分离等技术问题。
另一种获得吡咯并喹啉醌的常用方法是利用嗜甲醇细菌本身能合成吡咯并喹啉醌，通过发酵和分离的方法获得吡咯并喹啉醌。
A.剂量在本发明中，对吡咯并喹啉醌的剂量没有特别限制，可用任何合适的剂量。载体的类型以及数量也可以很不相同，这取决于温血动物或人的种类、体重、和待治疗的铅中毒症状等。一般，合适的含量是吡咯并喹啉醌占药物组合物总重量的0.01％-99％，较佳地0.1-90％。在治疗铅中毒时，PQQ的有效剂量范围通常为0.01-50毫克/千克·天或更高，较佳地为0.1-5毫克/千克·天。
剂量单元包括一种PQQ化合物，或者该PQQ化合物与其他治疗铅中毒的化合物所形成的混合物。剂量单元还可含有稀释剂、填充剂、载体等。剂量单位是固体或凝胶形式，如丸剂、片剂、胶囊等，或者是液体形式，它们适合口服给药、直肠给药、局部给药或肠胃外给药、或者静脉内给药。
B.剂型本发明的经口给药的固体组合物可采用片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂等形式。这些固体组合物中混合了1种或1种以上的活性物质和至少1种惰性稀释剂，例如，乳糖、甘露糖醇、葡萄糖、羟丙基纤维素、微晶纤维素、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、果胶、硅铝酸镁、铝酸镁。还可按照常用方法使组合物中含有除了惰性稀释剂之外的添加剂，例如，硬脂酸镁等润滑剂、纤维素乙醇酸钙等崩解剂、乳糖等稳定剂、谷氨酸或天冬氨酸等助溶剂。如是片剂或丸剂，还可根据需要，在其外部包裹上蔗糖、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯等糖衣或胃溶性、肠溶性薄膜。
经口给药的液体组合物包括药剂上允许的乳浊剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂、酏剂等，通常使用的惰性稀释剂包括精制水、乙醇。该组合物中除了惰性稀释剂之外，还可包含湿润剂、悬浮剂等助剂，甜味剂、矫味剂、芳香剂和防腐剂。
非经口给药的注射剂包括无菌水性或非水性溶液剂、悬浮剂和乳注剂。水性溶液剂和悬浮剂中包含注射剂用蒸馏水及生理盐水。非水溶性溶液剂和悬浮剂中包含丙二醇，聚乙二醇，可可脂、橄榄油、蓖麻油等植物油，乙醇等醇类，阿拉伯胶、吐温80(商品名)等。这些组合物中还可包含等渗剂、防腐剂、湿润剂、乳化剂、分散剂、稳定剂(例如，乳糖)、助溶剂(例如，谷氨酸、天冬氨酸)。用滤菌膜过滤上述组合物，再配合使用灭菌剂就可达到无菌的目的。然后，利用上述组合物制得无菌的固体组合物，在使用前用水或无菌注射用溶剂溶解就可加以利用。
可用于配制本发明口服剂型的、具体的药学上可接受的载体和赋形剂例子，在美国专利No.3,903,297(1975年9月2日授予Robert)中有描述。用于制造本发明的有用剂型的技术和组合物，在下列文献中有描述7种现代制剂(7 ModernPharmaceutics).第9和10章(Banker & Rhodes编辑，1979)；Lieberman等人，药物剂型片剂(Pharmaceutical Dosage FormsTablets)(1981)；和Ansel，药物剂型导论(Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms)2版(1976)。
C.治疗方法治疗方法可以是，治疗具体的铅中毒病症的任何合适有效方法。治疗可以是口服给药、直肠给药、局部给药、肠胃外给药、静脉内给药。施用有效量药物的方法还取决于待治疗的铅中毒程度。据信，通过与合适的载体、其他治疗铅中毒的化合物或方便给药的稀释剂一起配制，并通过静脉内、皮下或肌内给药的肠胃外治疗方法，是将化合物施用于温血动物的优选方法。
本发明的吡咯并喹啉醌还可与其他治疗铅中毒的药物以及辅助治疗性物质联用，以进一步提供治疗效果。
用本发明的吡咯并喹啉醌治疗铅中毒，其主要优势在于A)吡咯并喹啉醌在生物体内存在，是天然的化合物，其毒副作用要比人工制剂小。
B)目前治疗铅中毒所使用的吡咯并喹啉醌剂量为5mg/天，而用EDTA治疗的剂量为1g/天，同样作为螯合剂发挥作用，用量低可降低副作用。
C)吡咯并喹啉醌的添加补充了体内因与铅离子结合而损失的内源性吡咯并喹啉醌，缓解了体内因吡咯并喹啉醌的缺乏所引起的症状(正常哺乳动物体内的吡咯并喹啉醌为100-400nM)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1吡咯并喹啉醌检测方法的建立在本发明中，使用NBT显色法与FPLC两种方法检测吡咯并喹啉醌含量。
NBT方法利用吡咯并喹啉醌在碱性溶液中使NBT(氯化硝基四氮唑蓝)化学显色的性质，可定量地检测混合物中吡咯并喹啉醌的含量(可检测到10ng以上的吡咯并喹啉醌)。
具体操作如下待测吡咯并喹啉醌样品或标准品加入含25ul牛血清白蛋白(40mg/ml)400ul水，每份样品加入1.6ml测活缓冲液(NBT＋1.6M甘氨酸缓冲液)，混匀。避光37摄氏度保温45分钟，测定530纳米处的光吸收值。据此做标准曲线，计算待测样品中吡咯并喹啉醌的含量。
FPLC法利用吡咯并喹啉醌在FPLC-Q柱中特异性的洗脱位置与峰面积测定吡咯并喹啉醌的存在与含量。将待测样品或标准品10-100ul上样于FPLC上RESOURE-Q的高效离子交换层析柱上，经A液洗去未结合的成分后，以20倍柱体积的量，进行由A液到B液的梯度洗脱(A液20mM Tris-HCl，pH8.0，B液含1M NaCl的A液)，吡咯并喹啉醌这种物质是在B液含量达到21-25％时被洗脱出来。根据标准和待测样品此位置吸收峰的面积，计算出待测样品中吡咯并喹啉醌的含量。
实施例2A、吡咯并喹啉醌的发酵获得吡咯并喹啉醌的常用方法是利用嗜甲醇细菌本身能合成吡咯并喹啉醌，通过发酵和分离的方法获得吡咯并喹啉醌。具体方法如下。
Methylophagathalassica(ATCC#33145)，通过改变甲醇浓度(0.1-7％)，筛选出一菌株，PQQ的表达量由0.5mg/L达到2.0mg/L，将此菌株命名为GCpqq303。
摸索了多种表达条件下，GCpqq303菌株小量表达吡咯并喹啉醌产量的变化，主要包括a)培养时间；b)培养基中铁离子含量；c)培养基中镁离子含量等对小量表达产量的影响。具体参数对PQQ产量的影响参见表1。最终确定表达条件为培养基(O.3％(NH4)2SO4，0.14％KH2PO4，0.3％Na2HPO4，0.01％MgSO4，0.05％FeCl3，0.8％甲醇)，30摄氏度培养14天。进行三次以上小量表达，获得的表达量约3～4mg/L。
表1培养条件各参数对微生物发酵PQQ产量的影响
注该实验是在基本培养基的基础上添加或减少某些成分进行的，基本培养基的组成为0.3％(NH4)2SO4，0.14％KH2PO4，0.3％Na2HPO4，0.02％MgSO4，0.03％FeCl3，0.8％甲醇。培养14天测定铁和镁离子对PQQ产量的影响。
B.吡咯并喹啉醌的纯化发酵液上清经煮沸，离心过滤后吸附于FPLC-Q柱上，并经盐梯度洗脱，收集活性峰。获得的吡咯并喹啉醌经FPLC法检测(见图1)，纯度在90％以上，得率为56％。
实施例3吡咯并喹啉醌对铅中毒小鼠的治疗效果
60只昆明小鼠(18～20g)分为5组，每组12只，雌雄各半，各组分别为①不用醋酸铅喂食的空白对照组；②醋酸铅喂食后不进行治疗的染铅对照组；③用1mg/kg·天的吡咯并喹啉醌治疗的治疗组；④用0.1mg/kg·天的吡咯并喹啉醌治疗的治疗组；⑤用50mg/kg·天的EDTA治疗的治疗组。
将1％的醋酸铅代替水喂食30天，成为铅中毒小鼠模型。各治疗组进行灌胃治疗，每天0.5ml，共30天。处死后用原子吸收光谱测定血铅、脑铅和肝铅，数据列于表2。
表2.吡咯并喹啉醌对铅中毒小鼠的治疗*
*用双样本异方差t值检验方法处理数据，p＝0.033，表明各实验组与对照组有显著差异。
结果表明，吡咯并喹啉醌对铅中毒小鼠模型有明显的治疗效果。与使用剂量为50mg/kg·天的EDTA相比，使用1mg/kg·天的PQQ便可使血铅浓度降至类似水平。使用0.1mg/kg·天的PQQ也可其治疗铅中毒的效果，尤其是使用较低剂量的PQQ时，仍能有效地降低肝脏和脑中的铅浓度。
实施例5吡咯并喹啉醌胶囊制法与剂量处方吡咯并喹啉醌1g聚乙二醇400 200g共制成1000个胶囊，每个胶囊内含主药1mg(即0.5％)。
先将吡咯并喹啉醌与1/8量的PEG400混合。用胶体磨粉碎，然后加入余量的PEG400混溶。另配明胶溶液备用。在室温相对湿度40％的条件下，胶囊是将药液与明胶在自动旋转轧囊机充分作用，然后在28摄氏度，相对湿度40％的条件下，干燥20小时后完成整个制备。类似地，可制得胶囊中吡咯并喹啉醌含量可低至0.05％或更低，也高至5％或更高。在治疗铅中毒时，PQQ的有效剂量范围通常为0.01-50毫克/千克·天，较佳地为0.1-5毫克/千克·天。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种药物组合物，其特征在于，它含有(1)安全有效量的吡咯并喹啉醌和/或其药学上可接受的盐作为活性成分，以及(2)药学上可接受的载体。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述活性成分的含量为0.01％-99％。
3.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述活性成分的含量为O.1％-90％。
4.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，它还含有选自下组的物质维生素、人体必需的金属离子。
5.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的吡咯并喹啉醌是人工合成的或发酵产生的。
6.一种吡咯并喹啉醌的用途，其特征在于，它用于制备治疗铅中毒的药物。
全文摘要
本发明涉及在哺乳动物特别是人和温血动物中,治疗铅中毒的药物组合物。它含有(1)安全有效量的吡咯并喹啉醌和/或其药学上可接受的盐作为活性成分,以及(2)药学上可接受的载体。该组合物对铅中毒有显著的治疗效果。
文档编号A61K31/4745GK1334084SQ0011947
公开日2002年2月6日 申请日期2000年7月18日 优先权日2000年7月18日
发明者顾建新, 徐沁, 陈淳, 方向东, 张颂文, 殷向雷 申请人:上海医学生命科学研究中心有限公司