与免疫应答有关的新颖多肽的制作方法

专利名称：与免疫应答有关的新颖多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及与T淋巴细胞活化有关的多肽。具体地说，本发明涉及T淋巴细胞共同刺激多肽，编码这些多肽的核酸，用于制备这些多肽的表达载体和宿主细胞，以及用于治疗与免疫抑制和免疫活化有关的疾病的组合物和方法。
背景技术：
要产生适当的T淋巴细胞(T细胞)免疫应答，必须通过抗原呈递细胞(APC)提供给T细胞两个信号。第一，如果要决定特异性，抗原必须经由主要组织相容性复合体(MHC)呈递给T细胞受体(TCR)。第二，不须依赖抗原的共同刺激信号必须通过APC上的B7族成员与T细胞上的CD28蛋白的衔接来递送。生产性免疫应答导致增殖、分化、克隆扩充、和效应或功能。在没有第二个共同刺激信号的情况下，T细胞经历持久的抗原特异性无效应性状态，称之为无反应性。
T细胞引发免疫应答，介导抗原特异性效应子功能，并通过分泌细胞因子调节其他白细胞的活性。T细胞受体(TCR)将T细胞与其他淋巴细胞区别开来，并且当其在MHC的范围内通过APC呈递时可以仅结合抗原。特定T细胞的功能活性可以与膜抗原诸如CD4和CD8的表达联系起来。例如，CD4+T细胞通常起T辅助细胞(TH)的作用，并且是MHC类别II限制性的；而CD8+细胞通常起细胞毒性T细胞(Tc)的作用，并且是MHC类别I限制性的。
先前已确定的有效的T细胞共同刺激多肽包括名为B7.1的多肽(Freeman等，J.Immunology(免疫学杂志)143，2714-2722(1989)，Freeman等，Jour.Expt.Med.(实验医学杂志)174，625-31(1991))和名为B7.2的多肽(Freeman等，Science(科学)262，909-911(1993)，和Freeman等，Jour.Expt.Med.(实验医学杂志)178，2185-2192(1993))，(或者分别是CD80和CD86)。这些多肽或者是诱导的，或者组成性表达于各种APC上，并且分别是T细胞上CD28和CTLA-4的膜结合配体。CD28(Aruffo和Seed，Proc.Natl.Acad.Sci.(国家科学院院报)84，8573-8577(1987)和Gross等，J.Immun.(免疫学杂志)144，3201-3210(1990))在静息T细胞上表达，并介导正的共同刺激信号。CTLA-4(Brunet等，Nature(自然)328，267-270(1987)和Dariavach等，Eur.Jour.Immun.(欧洲免疫学杂志)18，1901-1905(1988))表达是随着T细胞的活化诱导的，并负向调节CD28信号，因为其对B7.1和B7.2有更高的结合亲和力。没有CTLA-4基因的小鼠显示出非常高的T细胞浓度，因为在缺乏CTLA-4的情况下有关增殖信号的切断机理削弱了。这种表现型清楚地证明了CTLA-4共同刺激蛋白具有对T细胞增殖的主要抑制作用。缺乏CD28或B7.1或B7.2的小鼠具有较轻程度的表现型，表明可能存在用于T细胞共同刺激的另外的路径。
对于用CD28/CTLA-4路径作为调节T细胞活化和增殖的手段这一点人们一直相当感兴趣。含有与人Fc融合的CTLA-4的细胞外部分的嵌合蛋白具有强免疫抑制作用，并且已在各种各样的临床环境中进行了研究。对B7.1和B7.2蛋白的抗体也已就免疫抑制范围内的类似表现进行了评估。抗CTLA-4抗体已显示了促进T细胞活化的效用。此外，B7.1和B7.2基因治疗在癌症的免疫治疗方面显示出极大的前途。
迄今为止，CD28、CTLA-4、B7.1和B7.2都与单T细胞共同刺激路径有关。被赋予通过调节T细胞共同刺激来调制免疫应答的能力后，它将有希望鉴别相同的其他成员或可在调节宿主T细胞功能和免疫应答中具有有益性能的分离的T细胞共同刺激路径。
因此，本发明的一个目的是提供用于刺激T细胞活性和/或增殖的新颖多肽。本发明的另一个目的是使用这些新颖多肽来预防和治疗T细胞介导的免疫疾病。
发明概述出乎意料地，现已确定了T细胞共同刺激路径的两种新颖多肽。这些多肽代表看来似乎与由先前所述的蛋白CD28、CTLA-4、B7.1和B7.2组成的路径不同的独特的共同刺激路径中的配体-受体对。这些多肽被称之为CD28相关蛋白-1或CRP1，和B7相关蛋白-1或B7RP1。
本发明提供了编码CRP1和B7RP1多肽以及相关多肽的核酸分子。本发明的分离核酸分子包含选自下列成员的核苷酸序列a)、

图1A中显示的核苷酸序列(SEQ ID NO1)；b)、编码图1A中显示的残基1-200或21-200的多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO1)；
c)、编码与图1A中显示的多肽至少约70％相同的多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO1)；d)、(a)、(b)或(c)任一个的天然产等位变体或可变剪接变体；e)、与(a)、(b)或(c)任一个互补的核苷酸序列；f)、编码至少约25、50、75、100或大于100个氨基酸残基的多肽片段的(b)、(c)或(d)的核苷酸序列；g)、包含至少约10、15、20、25、50、75、100或大于100个核苷酸的片段的(a)、(b)或(c)的核苷酸序列；和h)、在严格条件下与(a)-(g)任何之一杂交的核苷酸序列。
本发明还提供了包含选自下列成员的核苷酸序列的分离核酸分子a)、图2A(SEQ ID NO6)或图3A(SEQ ID NO11)或图12A(SEQ IDNO16)中显示的核苷酸序列；b)、编码图2A(SEQ ID NO6)中显示的残基1-322或残基47-322的多肽或者图3A(SEQ ID NO11)中显示的残基1-288或残基19-288、20-288、21-288、22-288、24-288或28-288的多肽的核苷酸序列；或者编码图12A中显示的残基1-302或残基19-302、20-302、21-302、22-302、24-302或28-302的多肽的核苷酸序列；c)、编码与图2A(SEQ ID NO6)或图3A(SEQ ID NO11)或图12A(SEQ ID NO16)中显示的多肽至少约70％相同的多肽的核苷酸序列；d)、(a)、(b)或(c)任一个的天然产等位变体或可变剪接变体；e)、与(a)、(b)或(c)任一个互补的核苷酸序列；f)、编码至少约25、50、75、100或大于100个氨基酸残基的多肽片段的(b)、(c)或(d)的核苷酸序列；g)、包含至少约10、15、20、25、50、75、100或大于100个核苷酸的片段的(a)、(b)或(c)的核苷酸序列；和h)、在严格条件下与(a)-(g)任何之一杂交的核苷酸序列。
本发明的主题还涉及CRP1和B7RP1多肽以及相关多肽。本发明提供了包含选自下列成员的氨基酸序列的分离多肽a)、图1A中显示的氨基酸序列(SEQ ID NO2)；b)、图1A(SEQ ID NO2)中显示的包含位于残基21上的成熟氨基端的成熟氨基酸序列；
c)、图1A(SEQ ID NO2)中显示的包含至少约25、50、75、100或大于100个氨基酸残基的氨基酸序列的片段；d)、(a)、(b)或(c)的直向同源物(ortholog)；和e)、(a)、(b)或(d)的等位变体或可变剪接变体。
本发明还涉及包含选自下列成员的氨基酸序列的分离多肽a)、图2A(SEQ ID NO7)或图3A(SEQ ID NO12)或图12A(SEQ IDNO17)中显示的氨基酸序列；b)、图2A(SEQ ID NO7)中显示的包含位于残基47上的成熟氨基端的成熟氨基酸序列，或图3A(SEQ ID NO12)中显示的包含位于残基19、20、21、22、24或28任何之一上的成熟氨基端的成熟氨基酸序列，或图12A(SEQ ID NO17)中显示的包含位于残基19、20、21、22、24或28任何之一上的成熟氨基端的成熟氨基酸序列；c)、图2A(SEQ ID NO7)或图3A(SEQ ID NO12)或图12A(SEQ IDNO17)中显示的包含至少约25、50、75、100或大于100个氨基酸残基的氨基酸序列的片段；d)、(a)、(b)或(c)的直向同源物；和e)、(a)、(b)、(c)或(d)的等位变体或可变剪接变体。
本发明还包括用于生产多肽的表达载体和宿主细胞，与CRP1和B7RP1多肽结合以及与相关多肽结合的抗体，和用于检测B7RP1和B7RP1相关多肽与CRP1和CRP1相关多肽的结合的测定法。本发明还涉及包含CRP1或CRP1相关多肽和B7RP1或B7RP1相关多肽的药物组合物。本发明还提供了用于鉴别与CRP1或B7RP1相互作用的化合物的方法，以及用于确定这些化合物是否是CRP1或B7RP1活性的激动剂或拮抗剂的测定法。
CRP1和B7RP1多肽与T细胞共同刺激和增殖有关。CRP1和B7RP1多肽、其选择性结合剂、以及其激动剂和拮抗剂，可以用于诊断、预防和治疗与T细胞反应的控制有关的疾病。
CRP1和B7RP1多肽、其选择性结合剂、以及其激动剂和拮抗剂，可以用于诊断、预防和治疗免疫疾病，或者用于刺激不足的免疫应答，或者减少或抑制过度或不适当的免疫应答。免疫疾病可以由T细胞直接或间接介导。
本发明提供了治疗、预防或改善T细胞介导疾病的方法，包括对动物给药CRP1或B7RP1多肽。本发明还提供了诊断动物的T细胞介导疾病或对T细胞介导疾病的敏感性的方法，包括测定CRP1或B7RP1多肽表达的存在或量；和基于多肽表达的存在和量诊断T细胞介导疾病或对T细胞介导疾病的敏感性的方法。一般说来，T细胞介导疾病是可以由T细胞直接或间接介导的免疫疾病。动物优选是哺乳动物，更优选为人。本发明还提供了鉴别与CRP1或B7RP1多肽结合的检验分子的方法，包括使多肽与检验化合物接触并测定多肽与检验化合物的结合伸展。该方法可以用于鉴别CRP1和/或B7RP1多肽的激动剂和拮抗剂。
CRP1和/或B7RP1多肽的拮抗剂可以用作许多适应症用的免疫抑制剂，包括自身免疫疾病(诸如类风湿性关节炎、牛皮癣、多发性硬化、糖尿病和系统性红斑狼疮)，中毒性休克综合征，骨髓和器官移植，炎性肠疾病，因输血导致的同种致敏，和移植物抗宿主疾病的治疗。此外，拮抗剂可以用作T细胞依赖性B细胞介导的适应症包括哮喘和变态反应、以及抗体介导的自身免疫用的抑制剂。CRP1和/或B7RP1多肽的激动剂可以用于但不限于肿瘤监测和切除中的T细胞活化。
本发明的拮抗剂包括抗体或其片段，它们能与B7RP1反应或者与B7RP1或B7RP1的胞外域结合，其中抗体减少或消除B7RP1与CRP1的结合。在一个实施方案中，抗体选择性地与人B7RP1或其胞外域结合。属于拮抗剂的抗体或其片段部分或完全抑制B7RP1的免疫共同刺激活性。在优选的实施方案中，抗体是单克隆抗体并且可以是鼠的、人的、嵌合的或人源化的。
本发明进一步提供了调节B7RP1与CRP1的相互作用的方法，包括对动物给药CRP1的选择性结合剂或B7RP1的选择性结合剂或二者。在一个实施方案中，选择性结合剂是与B7RP1结合的抗体并且减少或消除B7RP1与CRP1的结合。本发明还提供了调节由B7RP1介导的免疫共同刺激的方法，包括对动物给药B7RP1的选择性结合剂。该选择性结合剂优选与B7RP1结合的抗体并部分或完全抑制由B7RP1介导的免疫共同抑制。
本发明还提供了调节动物体内的T细胞活化或增殖的方法，包括对动物给药编码CRP1或B7RP1多肽的核酸分子。例如，编码B7RP1多肽的核酸分子可以在基因治疗中用于增强响应各种肿瘤的T细胞活化。
本发明还包括转基因的非人哺乳动物，其包含编码CRP1或B7RP1多肽的核酸分子。CRP1或B7RP1核酸以允许CRP1或B7RP1多肽的表达和循环浓度增加的方式引入到哺乳动物体内。该转基因非人哺乳动物优选啮齿动物，更优选小鼠或大鼠。
附图的描述图1、A).鼠CRP1的DNA和氨基酸序列(mCRP1)。预测的CRP1的信号序列在氨基端加了下划线，实验确定的前肽切割位点由星号指示。预测的跨膜序列向羧基端加了下划线。B).鼠CRP1蛋白序列(mCRP1)与鼠CD28(mCD28)的氨基酸序列对比。
图2、A).鼠B7RP1的DNA和氨基酸序列(mB7RP1)。预测的B7RP1的信号序列在氨基端加了下划线，实验确定的前肽切割位点由星号指示。预测的跨膜序列向羧基端加了下划线。B).B7RP1蛋白序列(mB7RP1)与鼠CD80(mCD80)的氨基酸序列对比。
图3、A).推定人B7RP1(hB7RP1)的蛋白质编码区的结构和序列。hB7RP1的预测信号序列在氨基端加了下划线。预测的信号肽切割位点用星号标记。预测的跨膜序列向羧基端加了下划线。B).推定的成熟hB7RP1蛋白质与成熟的鼠B7RP1(mB7RP1)蛋白质的氨基酸序列对比。
图4、A).来自用pcDNA3/CRP1-Fc转染的293T细胞的可溶性CRP1-Fc融合蛋白的表达。如图中所示在10％PAGE凝胶上加载并分离归一化体积的细胞裂解物或条件培养基。用于细胞伴随的(细胞裂解物)和分泌的(培养液)Fc融合蛋白的表达的细胞裂解物和细胞培养上清液的蛋白质印迹分析。初级抗体是山羊抗人Fc抗体(Pierce化学公司，Rockford，IL.)。B).来自用pcDNA3/B7RP1-Fc转染的293T细胞的可溶性B7RP1-Fc融合蛋白的表达。在10％PAGE凝胶上加载并分离20μl的归一化细胞裂解物或培养上清液。如(A)中所述进行蛋白质印迹分析。
图5、CRP1-Fc和B7RP1-Fc融合蛋白与COS-7细胞中表达的膜结合蛋白的相互作用。COS-7细胞用pcDNA3/CRP1、pcDNA3/B7RP1、或单独的pcDNA载体瞬时转染。CH0 D细胞用psDRα/hCD28转染并稳定地表达人CD28(hCD28)。表达膜结合CRP1、B7RP1或hCD28的细胞如图所示一排排地表示在面板的左侧。Fc融合蛋白用如图所示一列列地表示在面板上部的平板结合细胞温育。温育后，将细胞洗涤，使用抗人Fc抗体和ACAS(粘着细胞分析和分选；ACAS Ultima，Meridian Instruments，Inc.，Okemos，MI)分析检测结合Fc融合蛋白。
图6、B7RP1的受体(推定的，CRP1)在活化CD4+和CD8+T细胞上的表达的FACS(荧光活化细胞分检器)分析。小鼠脾细胞用PMA和离子霉素活化12小时。B7RP1-Fc融合蛋白、对照Fc蛋白(Mock-Fc)或PBS(未染色)用细胞温育，洗涤，随后用显示在每个面板底部的山羊抗人Fc-FITC缀合抗体(GaHuFc-FITC)温育。加入显示在每个面板左侧的细胞标志抗体(T细胞标志CD4和CD8的)PE缀合的、或同种型对照抗体(大鼠同种型)PE缀合的、或PBS(未染色)。
图7、B7RP1在B细胞上的表达的FACS(荧光活化细胞分检器)分析。CRP1的配体(推测的，B7RP1)在小鼠脾细胞上的表达的荧光细胞计量分析。CRP1-Fc融合蛋白、对照Fc蛋白(Mock-Fc)或PBS(未染色)用细胞温育，洗涤，随后用显示在每个面板底部的山羊抗人Fc-FITC缀合抗体(GaHuFc-FITC)温育。加入显示在每个面板左侧的CD45R的PE缀合细胞标志抗体(CD45R是B细胞标志)或同种型对照抗体(大鼠同种型)或PBS(未染色)。
图8、mCRP1配体在腹膜巨噬细胞上的表达的FACS分析。腹膜细胞首先根据它们的光散射性能分成亚群(面板A)。巨噬细胞由于它们强大的向前(FSC)和向侧面(SSC)散射光的能力以及由于它们对巨噬细胞的标记-F4/80抗原的阳性染色而在5区(R5)中鉴别出来(面板B)。6区(R6)中的巨噬细胞在它们对F4/80抗原染色强度小并且发现能被CRP1-Fc融合蛋白染色(推测是由于它们对B7RP1的表达)的基础上挑选出来。
图9、使用B7RP1-Fc融合蛋白对T细胞增殖的抑制。来自小鼠脾细胞的T细胞用图底部所示的递增浓度的伴刀豆凝集素A(Con A)活化。将mCRP1-Fc、mB7RP1和mB7.2-Fc融合蛋白在不存在(没有加入)或存在Con A的条件下加入到来自脾细胞的富集T细胞中。200,000个细胞用于在96孔平板中进行的T细胞增殖测定。细胞用图例中所示的培养基(没有加入)或Fc融合蛋白温育。42小时后，细胞用H-胸苷脉冲处理6小时，然后采收并掺入确定的放射性。表示出来自一式三份样本的平均CPM和标准偏差。
图10、A).来自对照小鼠#10的正常肠系膜淋巴结，显示了该淋巴结的皮质、副皮质和髓质。苏木精-曙红(H&E)染剂，40x放大率。B).来自有显著的滤泡增生(FH)、副皮质扩张和髓索增生(MH)的WXll小鼠#40的显著增大的肠系膜淋巴结。H&E，40x。C).来自对照小鼠#10的肠系膜淋巴结的髓索(MC)和髓窦(MS)的闭合。注意主要由与带有肉样巨噬细胞的髓窦相邻的小淋巴细胞组成的小髓索。H&E，400x。D).来自WXll小鼠#40的肠系膜淋巴结的髓索(MC)和髓窦(MS)的闭合。注意由大量带有偶然拉塞尔小体细胞(箭头)的血浆细胞组成的显著变厚的髓索。H&E，400x。E).来自对照小鼠#10的正常的脾，显示了带有小动脉周淋巴鞘(PALS)的红髓和白髓区域，100x。插图带有小淋巴细胞、巨噬细胞和偶然血浆细胞的围绕白髓的边缘区的闭合，400x。F).来自WXll小鼠#6的脾，带有增大的白髓区域，包括PALS和滤泡(箭头)，100x。插图带有大量血浆细胞和偶然拉塞尔小体的边缘区的闭合，400x。G).来自对照小鼠#25的带有派伊尔结的回肠，有由两个次级滤泡侧面相接形成的滤泡间区(箭头)，40x。H).来自WXll小鼠#32的带有派伊尔结的回肠，有具有明显生发中心和滤泡间组织(箭头)的显著增大的滤泡，40x。
图11、A).来自对照小鼠#5的正常肠系膜淋巴结，显示了该淋巴结的皮质、副皮质和髓质。苏木精-曙红(H&E)染剂，40x放大率。B).来自有显著的滤泡增生(顶部外皮质中的次级滤泡行)、副皮质扩张(中间)和髓索增生(底部)的WXll小鼠#33的显著增大的肠系膜淋巴结。H&E，40x。C).来自带有抗B220抗体(B细胞标志)的对照小鼠#10的肠系膜淋巴结的免疫组织化学染色。注意强烈(褐色)染色的皮质区和细小的髓索。免疫染色使用抗生物素蛋白-生物素复合物(ABC)免疫过氧化物酶法进行(DAB色原，苏木精复染剂)，40x。D).来自带有抗B220抗体的WXll小鼠#33的肠系膜淋巴结的免疫组织化学染色。注意强烈染色的皮质滤泡和髓索(尽管髓索中的成熟血浆细胞对B220是阴性的)，40x。E).来自带有抗CD3抗体(T细胞标志)的对照小鼠#10的淋巴结的免疫组织化学染色。注意该淋巴结的副皮质区的免疫染色，40x。F).来自带有抗CD3抗体的WXll小鼠#33的淋巴结的免疫组织化学染色。注意该淋巴结的增大的、强烈染色的副皮质区，40x。
图12、A).编码人B7RP1(hB7RP1)区的蛋白质的结构和序列。hB7RP1的预测信号序列在氨基端加了下划线。预测的信号肽切割位点用星号标记。预测的跨膜序列向羧基端加了下划线。B).推定的成熟hB7RP1蛋白质与成熟的鼠B7RP1(mB7RP1)蛋白质的氨基酸序列对比。
图13、A).编码人CRP1(hCRP1)区的蛋白质的结构和序列。hCRP1的预测信号序列在氨基端加了下划线。预测信号肽切割位点用星号标记。预测的跨膜序列向羧基端加了下划线。B).hCRP1蛋白质与鼠CRP1(mCRP1)蛋白质的氨基酸序列对比。
图14、CRP-1在静息记忆细胞上。来自6-7月龄小鼠的静息脾细胞使用由FITC缀合抗人Fc抗体和CD44(图14A)、CD45RB(图14B)或CD69(图14C)的PE缀合抗体标记的B7RP-1-Fc进行二重染色。
图15、经由B7RP-1-Fc融合蛋白的T细胞共同刺激。A).由不同数量的B7RP-1-Fc(密实正方形)、B7.2-Fc(密实圆圈)或OPG-Fc融合蛋白对照(空心正方形)与抗CD3抗体联合诱导的T细胞增殖。融合蛋白以不同浓度用于涂敷预先用抗人Fc FAb2(12.5μg/ml)和抗CD3抗体(0.9μg/ml)涂敷的96孔平板。B7RP-1-Fc和B7.2-Fc以剂量依赖方式共同刺激T细胞不超过0.3μg/ml，此时达到最大效应。B).由B7RP-1-Fc(密实正方形)、B7.2-Fc(密实圆圈)、非融合Fc(空心正方形)或无Fc(空心圆圈)与抗CD3抗体(0.85μg/ml)联合并在不同浓度的兔抗B7RP-1-Fc多克隆抗体的存在下诱导的T细胞增殖。Fc融合蛋白以0.3μg/ml的浓度使用并如上所述结合到平板上。通过皮下注射在佐剂中乳化的抗原提出针对纯化B7RP-1-Fc的抗B7RP-1-Fc抗体，然后进行亲和纯化。抗体加入细胞之前用Fc融合蛋白温育30分钟。抗B7RP-1-Fc抗体以剂量依赖方式特异性抑制由B7RP-1-Fc诱导的T细胞增殖。
图16、CRP-1-Fc和B7RP-1-Fc蛋白质对小鼠的胶原诱导关节炎的发生率(A)和严重程度(B)的影响。易受胶原诱导关节炎影响的B10.RIII小鼠在尾巴的根部用存在于CFA中的10μg猪II型胶原免疫接种。小鼠接受100μg融合蛋白，每周两次。Fc融合蛋白和对照PBS治疗显示在图例中。
图17、B7RP-1-Fc转基因小鼠的近侧结肠。(A).来自对照小鼠#53F(雌性)的正常近侧结肠，显示了带有粘膜、粘膜下层、肌层和浆膜的肠壁。苏木精-曙红(H&E)染剂，40x放大率。(B).来自有显著的腺肥大、裂隙溃疡和透壁炎症的B7RP-1-Fc转基因小鼠#111F的弥漫增厚的近侧结肠。H&E，40x。(C).来自有多灶性裂隙溃疡和透壁炎症的B7RP-1-Fc转基因小鼠#111F的近侧结肠的下部动力图(如面板B中所示)。H&E，20x。(D).来自B7RP-1-Fc转基因小鼠#111F的裂隙溃疡和肥大性结肠腺的闭合(显示在上面的面板B和C中)。注意有粘液脓性渗出物的腔。H&E，100x。(E).具有被巨噬细胞、淋巴细胞和少数嗜中性白细胞围绕的多核巨细胞的B7RP-1-Fc转基因小鼠#112F的粘膜下层中的肉芽肿性炎症的闭合。H&E，400x。(F).具有位于粘膜腺下方的与淋巴细胞、血浆细胞和少数嗜中性白细胞混合的上皮样巨噬细胞的B7RP-1-Fc转基因小鼠#112F的粘膜中的肉芽肿性炎症的闭合。H&E，400x。
图18、B7RP-1-Fc转基因小鼠的远侧结肠。(A).来自对照小鼠#53F(雌性)的正常远侧结肠，显示了带有粘膜、粘膜下层、肌层和浆膜的肠壁各层。苏木精-曙红(H&E)染剂，40x放大率。(B).来自有显著的腺肥大和增生和散在滤泡脓肿的B7RP-1-Fc转基因小鼠#111F(雌性)的弥漫增厚的远侧结肠。H&E，40x。(C).来自有显著的腺肥大和增生的B7RP-1-Fc转基因小鼠#55M(雄性)的弥漫增厚的远侧结肠。H&E，40x。(D).来自有肥大性结肠腺、局灶性淋巴样聚集物和许多滤泡脓肿的B7RP-1-Fc转基因小鼠#112F(雌性)的弥漫增厚的远侧结肠。H&E，40x。(E).来自带有抗CD3抗体(T细胞标志)的B7RP-1-Fc转基因小鼠#112F的远侧结肠的免疫组织化学染色。注意浅表粘膜和结肠淋巴组织斑的免疫染色。H&E，40x。(F).具有滤泡脓肿(箭头)和由B220+B细胞组成的淋巴样聚集物(插图)的B7RP-1-Fc转基因小鼠#112F的结肠粘膜的闭合。H&E，100x。
图19、B7RP-1-Fc转基因小鼠的小肠。(A).来自对照小鼠#53F(雌性)的正常十二指肠，显示了腔、绒毛和粘膜的滤泡以及下面的粘膜下层、肌层和浆膜。苏木精-曙红(H&E)染剂，40x放大率。(B).来自有显著的滤泡肥大和增生和固有层中轻度淋巴浆细胞浸润的B7RP-1-Fc转基因小鼠#51F(雌性)的弥漫增厚的十二指肠。H&E，40x。(C).来自对照小鼠#53F(雌性)的正常空肠，显示了空肠粘膜中正常长度的绒毛和滤泡。H&E，40x放大率。(D).来自有局部广延的滤泡肥大和增生的B7RP-1-Fc转基因小鼠#51F(雌性)的显著增厚的空肠粘膜。H&E，40x。(E).来自对照小鼠#53F(雌性)的正常回肠，显示了回肠粘膜中正常长度的绒毛和滤泡。H&E，40x放大率。(F).来自绒毛局灶性损失和钝化的B7RP-1-Fc转基因小鼠#231M(雄性)的回肠粘膜的轻度萎缩。H&E，40x。
图20、B7RP-1-Fc融合蛋白抑制了小鼠体内的肿瘤生长。将Meth A肉瘤细胞真皮内植入到Balb/C小鼠的腹部。在植入后的第7、10、14和17天时，小鼠用载体(深色菱形)或鼠B7RP-1-Fc(灰色三角形，实施例7)治疗。如实施例20中所述，在指示的植入的那些天中测量肿瘤的体积。监测肿瘤的生长直到第28天。每组有8只小鼠。
图21、经由人B7RP-1-Fc的T细胞共同刺激。用抗CD3和人B7RP-1Fc涂敷96孔平板，并如实施例21中所述培养和收获1×105T细胞/孔(＞98％CD3+)。A).在不同浓度的抗CD3初始刺激下由单独的抗CD3(密实圆圈)、0.5μg/ml B7RP-1Fc(密实三角形)、0.5μg/ml OPG-Fc(空心圆圈)和5μg/ml抗CD28(空心三角形)诱导的共同刺激。数据显示，B7RP-1-Fc将抗CD3致敏T细胞共同刺激到了与使用抗CD28抗体共同刺激所达到的类似水平。所显示的数据是来自用从三个正常供体分离的T细胞产生的若干实验中的一个典型实验的一式三份孔中的掺入[3H]TdR均值+/-SD。B).经由CRP-1-Fc对B7RP-1-Fc共同刺激的剂量依赖性抑制。T细胞在用0.3μg/ml的抗CD3和0.5μg/ml的B7RP-1-Fc涂敷的孔中培养。连续稀释浓度的CRP-1-Fc(密实圆圈)或OPG-Fc(空心圆圈)在加入T细胞之前用B7RP-1-Fc预温育30分钟。数据显示，CRP-1-Fc以剂量依赖性方式抑制了B7RP-1诱导的共同刺激。以抑制百分数对CRP-1-Fc或OPG-Fc蛋白质浓度作图。所显示的数据是在一式三份孔中完成的三个实验的掺入[3H]TdR均值+/-SD，并且是用两个正常供体产生的实验的典型。C).经由CHO人B7RP-1细胞的共同刺激。T细胞从外周血液中纯化，并在单独的抗CD3(密实圆圈)、1×104CHO载体对照细胞(空心圆圈)或1×104CHO B7RP-1细胞(密实三角形)的存在下用不同浓度的抗CD3培养，如实施例22中所述。数据显示，膜结合B7RP-1共同刺激T细胞的生长到了与使用B7RP-1-Fc融合蛋白观察到的类似水平。所显示的数据是一式三份培养物的均值+/-SD，并且是用两个正常供体产生的结果的典型代表。D).细胞因子产生。如(图21A)中所述培养T细胞，在48小时(黑条)和72小时(灰条)时收集上清液。数据表明，由B7RP-1-Fc共同刺激细胞产生的IL-2的量(上图)与由用抗CD3和对照Fc刺激的细胞产生的量类似，但显著低于由抗CD28共同刺激细胞产生的量。数据还表明，B7RP-1-Fc共同刺激增强了IL-10(中图)和IFN-γ(下图)的产生。
发明的详细描述本发明提供了在本文中称之为CRP1和B7RP1的新颖多肽，它们包含与T细胞活化有关的受体-配体对。从用小鼠肠上皮内细胞制备的文库鉴别出编码这些多肽的cDNA并在与CD28和CTLA-4多肽(关于CRP1)或B7.1和B7.2多肽(关于B7RP1)的同源性的基础上进行筛选。
CD28相关蛋白质-1或CRP1，据预测是带有位于氨基端的信号序列和胞外域、跨膜结构域和羧基端胞内域的I型跨膜蛋白(图1)。全长CRP1蛋白质的成熟形式为180个氨基酸。预测前导序列大约跨越氨基酸残基1-20(相对于起始甲硫氨酸)，该成熟蛋白质的胞外域大约包括残基21-145(实施例1)。预测的跨膜结构域大约跨越残基146-163，胞内域包括大约残基164-200。氨基端胞外域与具有保守推定分子内和分子间键合半胱氨酸的Ig环类似。另外，先前已知对于B7.1和B7.2与CD28和CTLA-4的结合非常重要的“MYPPPY”基元也是部分保守的。
CD28和CTLA-4是弱同源性的，例如鼠CD28和CTLA-4之间有26％氨基酸相同。CRP1与鼠CD28有19％氨基酸相同，CRP1与鼠CTLA-4有14％相同。但是，鼠CD28、CTLA-4和CRP1之间的决定性半胱氨酸残基保存在残基42、63、83、109和137处(相对于CRP1蛋白质中的起始甲硫氨酸，参见图1A)。在CRP1、CD28和CTLA-4中，近似成熟蛋白质长度和相对于羧基端的跨膜区的位置也类似。
人CRP1是具有图13A中所示核苷酸和氨基酸序列的跨膜蛋白质。预测的前导序列大约跨越残基1-19或约残基1-20。预测的成熟氨基端在残基20或21处。优选地，成熟氨基端在21位。胞外域从任何一个预测成熟氨基端跨越到约氨基酸残基140，跨膜结构域跨越约残基141-161，而胞内域跨越约残基162-199。人CRP1蛋白质与鼠蛋白质有69％相同，相应的核苷酸序列为77％相同。人CRP1的序列报道于Hutloff等，Nature(自然)397，263-266(1999)。
B7相关蛋白质-1或B7RP1，据预测是带有位于氨基端的信号序列和胞外域、跨膜结构域和羧基端胞内域的I型跨膜蛋白质(图2A)。全长B7RP1蛋白质的成熟形式为276个氨基酸。预测前导序列大约跨越氨基酸残基1-46(相对于起始甲硫氨酸)，成熟蛋白质的胞外域大约包括残基47-279(实施例3)。预测的跨膜结构域大约跨越残基280-298，胞内域包括残基299-322。与B7.1和B7.2类似，B7RP1的胞外域包含两个Ig环。
B7.1和B7.2是弱同源性的，例如鼠B7.1和B7.2之间有24％氨基酸相同。B7RP1与鼠B7.1有20％氨基酸相同，B7RP1与鼠B7.2有19％相同。但是，鼠B7.1、B7.2和B7RP1之间的决定性半胱氨酸残基保存在残基62、138、185和242处(相对于B7RP1蛋白质中的起始甲硫氨酸，参见图2A)。在mB7RP1、B7.1和B7.2中，近似成熟蛋白质长度和相对于羧基端的跨膜区的位置也类似。
人B7RP1也是具有Ig环结构所必需的在胞外域中的保守半胱氨酸残基的跨膜蛋白质。预测前导序列包括如图3A中显示的约残基1-18、1-19、1-20、1-21、1-23或1-27。预测的成熟氨基端可以在残基19、20、21、22、24或28任何一处。优选氨基端在19位。胞外域从任何一个成熟氨基端跨越到约氨基酸残基259。预测跨膜结构域跨越约残基259-274。胞内域包括残基275-302。全长人B7RP1核苷酸和氨基酸序列显示在图12A中。人B7RP1与鼠蛋白质约43％相同。
CRP1和B7RP1彼此结合，但CRP1不可检测地与B7RP1相关蛋白B7.2结合；B7RP1没有显示可检测地与CRP1相关CD28或CTLA-4结合(实施例8)。B7RP1显示调节了T细胞增殖，推测是通过B7RP1与CRP1受体的相互作用(实施例11)。因此，CRP1和B7RP1代表了调节T细胞增殖和活化的新颖路径。
B7RP1与CRP1的相互作用可以用免疫共同刺激和T细胞增殖和活化能增加或减少这样的方式来调节。作为实例，针对鼠B7RP1培养的抗B7RP1单克隆和多克隆抗体阻断了B7RP1/CRP1相互作用，也阻断了由B7RP1-Fc融合蛋白诱导的T细胞增殖(参见实施例17)。人CRP-1-Fc融合蛋白阻断了由人B7RP-1-Fc诱导的人T细胞增殖(实施例21)。此外，加入CRP1-Fc融合蛋白延迟了类风湿性关节炎小鼠模型的关节炎症状的发作(参见实施例18)。B7RP-1/CRP-1共同刺激也可通过加入B7RP-1-Fc融合蛋白或此路径的其他激活剂来增加(实施例20)。
核酸分子术语“分离核酸分子”是指没有至少一个天然相联的污染核酸分子的核酸分子，优选实质没有任何其他污染哺乳动物核酸分子。
术语“等位变体”是指占据生物体染色体上所给出部位的基因的若干可能的天然产备择形式之一。
术语“剪接变体”是指由RNA转录物中内含子序列的可变加工产生的核酸分子，通常是RNA。
术语“高严格条件”指的条件是(1)采用低离子强度和高温洗涤，例如，O.1 X SSC(0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠)0.1％NaDodSO4(SDS)，50℃下，或者(2)在杂交过程中采用变性剂诸如甲酰胺，例如，50％(体积/体积)甲酰胺加上0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM pH6.5的磷酸钠缓冲剂加上5XSSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸钠)，在42℃下。高严格条件的另一个例子是50％甲酰胺，5 x SSC，50mM磷酸钠(pH6.8)，0.1％焦磷酸钠，5xDenhardt溶液，超声处理过的鲑精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，和10％葡聚糖硫酸脂，在42℃下，并在42℃下用0.2 x SSC和0.1％SDS洗涤。
术语“中等严格条件”所指的条件包括使用比上述条件严格性低的洗涤溶液和杂交条件(例如温度和离子强度)。中等严格条件的例子是诸如下述条件在包含20％甲酰胺、5 x SSC、50mM磷酸钠(pH7.6)、5 xDenhardt溶液、10％葡聚糖硫酸酯和20μl/ml变性剪切的鲑精DNA的溶液中在37℃下温育过夜，接着在约37-50℃下用1 x SSC洗涤滤器。熟练技术人员将根据需要确定怎样调节温度、离子强度和其他参数以适应诸如探针长度等因素。
重组DNA技术方法列于Sambrook等(分子克隆实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY(1989))和/或Ausubel等编写的(分子生物学中的流行方案，Green Publishers Inc.和Wiley&Sons，NY(1994))，它们都整个结合在此作为参考。
本发明提供了编码CRP1和B7RP1多肽的分离核酸分子。还提供了是片段、等位变体、剪接变体或者序列与编码CRP1和B7RP1多肽的分子互补的核酸分子。还包括与编码CRP1或B7RP1的分子至少约70％相同或者在中等或高严格条件下与编码CRP1或B7RP1的分子杂交的核酸分子。这些核酸分子可以是cDNA、基因组DNA、RNA或部分或完全合成的核酸分子。在优选的实施方案中，本发明的核酸分子与编码CRP1或B7RP1的核酸分子至少约75％、80％、85％、90％或95％相同。
编码CRP1或B7RP1多肽的基因或cDNA或其片段可以得到，例如通过基因组或cDNA文库的杂交筛分或PCR扩增。用于筛分该文库的探针或引物可以在来自相同或相关基因族的其他已知基因或基因片段的序列信息的基础上产生，例如在CRP1或B7RP1相关多肽中发现的保守基元诸如半胱氨酸残基的保守阵列。另外，已从一种物质中鉴别出编码CRP1或B7RP1多肽的基因时，该基因的全部或部分可以用作探针来从其他种物质鉴别同源基因。探针或引物可以用于从据信表达CRP1或B7RP1基因的不同组织来源筛分cDNA文库。
当寡核苷酸探针用于筛分cDNA或基因组文库时，可以使用下列两种高严格溶液之一。第一种是6 X SSC加上0.05％焦磷酸钠，在35℃-62℃下，温度取决于寡核苷酸探针的长度。例如，14个碱基对的探针在35-40℃下洗涤，17个碱基对的探针在45-50℃下洗涤，20个碱基对的探针在52-57℃下洗涤，而23个碱基对的探针在57-63℃下洗涤。当背景非特异性结合显得高时，可以将温度升高2-3℃。第二种高严格溶液利用氯化四甲铵(TMAC)来洗涤寡核苷酸探针。一种严格洗涤溶液是3MTMAC、50mM Tris-HCl，pH8.0和0.2％SDS。使用该溶液时的洗涤温度是探针长度的函数。例如，17个碱基对的探针在约45-50℃下洗涤。
另一种制备编码CRP1或B7RP1多肽的基因或其片段的方式是使用熟练技术人员熟知的方法进行化学合成，诸如Engels等(Agnew.Chem.Intl.Ed.，28716-734(1989))描述的方法。这些方法包括，尤其是用于核酸合成的磷酸三酯法、亚磷酰胺法和H-膦酸酯法。用于这种化学合成的优选方法是使用标准亚磷酰胺化学的聚合物支持合成。一般说来，编码CRP1或B7RP1多肽的DNA将有数百个核苷酸长。长于约100个核苷酸的核酸可以使用这些方法合成为若干个片段。这些片段然后可连接在一起形成全长CRP1或B7RP1多肽。通常，编码多肽氨基端的DNA片段将具有编码甲硫氨酸残基的ATG。该甲硫氨酸可以或不可以呈递在CRP1或B7RP1多肽的成熟形式上，这取决于宿主细胞中产生的多肽是否是计划从该细胞中分泌的。
编码生物活性多肽的CRP1或B7RP1核酸分子、片段和/或不是它们自己的衍生物仍然可以在诊断性测定中用作杂交探针来定性或定量检验哺乳动物组织或体液样品中CRP1或B7RP1 DNA或相应RNA的存在。
在一些情况下，可能希望制备天然产CRP1或B7RP1多肽的核酸和/或氨基酸变体。当引物具有所需点突变时，核酸变体可以使用定点诱变、PCR扩增或其他合适的方法生产(参见Sambrook等，同上，和Ausubel等，同上，有关诱变技术的描述)。使用Engels等(同上)描述的方法的化学合成也可以用于制备这类变体。也可以使用熟练技术人员已知的其他方法。
优选的核酸变体包括含有已为所给宿主细胞中CRP1和B7RP1多肽的最佳表达改变的密码子的那些。特定密码子变化将取决于蛋白质和宿主细胞的选择。在一种情况下，这种“密码子优化”可以通过选择在所给宿主细胞中优选用于高度表达基因的密码子来进行。可以使用有关高度表达的细菌基因的优选密码子的加入密码子频率表诸如“Ecohigh.Cod”的计算机算法，其由威斯康星大学Package 9.0版，Genetics Computer Group，Madison，WI提供。其他有用的密码子频率表包括“Celegans_high.cod”、“Celegans_low.cod”、“Drosophila_high.cod”、“Human_high.cod”、“Maize_high.cod”和“Yeast_high.cod”。其他优选的变体是编码如下所述(例如，其中天然产氨基酸侧链的电荷或极性通过用不同氨基酸置换没有实质改变)与野生型相比保守氨基酸变化的那些，和/或计划产生新的糖基化和/或磷酸化位点的那些，或计划删除现有糖基化和/或磷酸化位点的那些。
编码CRP1或B7RP1多肽的基因、cDNA或其片段可以使用标准连接技术插入合适的表达或扩增载体中。一般选择在所用的特定宿主细胞中是功能性的载体(即，该载体与宿主细胞机构是相容的，以便可以发生基因的扩增和/或基因的表达)。编码CRP1或B7RP1多肽的基因、cDNA或其片段可以在原核细胞、酵母、昆虫(杆状病毒系统)和/或真核宿主细胞中扩增/表达。宿主细胞的选择将部分取决于CRP1或B7RP1多肽或其片段是否将被糖基化和/或磷酸化。如果是，则优选酵母、昆虫或哺乳动物宿主细胞。
一般，在任何一个宿主细胞中所用的表达载体将含有用于质粒保持和克隆和插入核苷酸序列的表达的序列。这类序列统称为“侧翼序列”，将包括启动子和其他调节元件诸如增强子、复制元件起点、转录终止元件、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、信号肽序列、核糖体结合位点元件、聚腺苷酸化序列、用于插入编码要表达的多肽的核酸的多接头区和选择性标记元件。这些元件中的每一个将在下面进行讨论。可选地，该载体可以含有“尾端”序列，即，位于CRP1或B7RP1多肽编码序列的5′或3′端的寡核苷酸分子；该寡核苷酸分子编码聚组氨酸(诸如六组氨酸)或其他“尾端”诸如FLAG、HA(血凝素流感病毒)或myc，有可从商业上获得的它们的抗体。这种尾端一般随着多肽的表达而融合到多肽上，并且可以充当从宿主细胞亲和纯化CRP1或B7RP1多肽的方式。例如，亲和纯化可以通过柱色谱法使用针对尾端亲和基质的抗体完成。可选地，该尾端随后可以通过各种方式诸如使用某些肽酶从纯CRP1或B7RP1多肽上除去。
人免疫球蛋白铰链和Fc区可以由本领域中的技术人员融合到CRP1或B7RP1多肽的N端或C端。随后该Fc融合蛋白可以通过使用A蛋白亲和柱纯化。已知免疫珠蛋白Fc区显示出长的体内药动学半衰期，且融合到Fc区的蛋白质已发现显示出比未融合的相应物实质更长的体内半衰期。而且，融合到Fc区允许分子二聚和/或多聚合，这对于某些分子的生物活性是有用的。
侧翼序列可以是同源的(即，来自与宿主细胞相同的物种和/或菌株)，异源的(即，来自宿主细胞物种或菌株以外的物种)，杂交体(即，来自一个以上来源的侧翼序列的组合物)，合成的，或者它可以是天然CRP1或B7RP1核酸侧翼序列。如此，侧翼序列的来源可以是任何单细胞的原核或真核生物、任何有脊椎或无脊椎生物、或者任何植物，条件是该侧翼序列在宿主细胞机构中是功能性的，并且可以被其激活。
用于本发明载体中的侧翼序列可以通过本领域中公知的若干方法中的任何一种得到。一般，在此处有用的、除了CRP1或B7RP1核酸侧翼序列以外的侧翼序列将通过作图和/或通过限制内切酶消化事先鉴别出来，并且因此可从适当的组织来源使用合适的限制内切酶分离出来。在有些情况下，侧翼序列的全核苷酸序列可以是已知的。此时，该侧翼序列可以使用上面所描述的核酸合成或克隆方法进行合成。
若侧翼序列的所有或只有一部分是已知的，它可以使用PCR和/或通过筛选带有来自相同或其他物种的合适的寡核苷酸和/或侧翼序列片段的基因组文库而得到。
若侧翼序列是未知的，含有侧翼序列的DNA片段可以从可能含有例如编码序列或者甚至是另一种或另一些基因的大量DNA中分离。分离可以通过限制内切酶消化使用一种或多种仔细选择的酶来分离适当的DNA片段而完成。消化后，所需片段可以通过琼脂糖凝胶纯化、Qiagen柱或熟练技术人员已知的其他方法进行分离。用于实现此目的的合适的酶的选择对于本领域普通技术人员将是显而易见的。
复制元件起点一般是商业上购得的原核表达载体的一部分，并且有助于宿主细胞中载体的扩增。在有些情况下，载体扩增到一定的拷贝数对于CRP1或B7RP1多肽的最佳表达是重要的。如果选定的载体不含复制起点，可以在已知序列的基础上化学合成一个，并将其连接到载体中。
转录终止元件一般位于CRP1或B7RP1多肽编码序列的3′端，并起终止CRP1或B7RP1多肽转录的作用。通常，原核细胞中的转录终止元件是接着多T序列的富含G-C的片段。虽然该元件容易从文库中克隆或者甚至作为部分载体从商业上购得，但它也可使用核酸合成方法诸如上面描述的那些容易地合成。
选择性标记基因元件编码在选择培养基中生长的宿主细胞的存活和生长所必需的蛋白质。一般选择标记基因编码这样的蛋白质(a)为原核宿主细胞提供对抗生素或其他毒素例如氨苄青霉素、四环素或卡那霉素等的抗性的，(b)补充细胞的营养缺陷的；或者(c)提供不能从复合培养基中获得的必要营养素的。优选的选择性标记是卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。
核糖体结合元件，常叫做SD序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)，通常是mRNA的翻译起始所必需的。该元件一般位于启动子的3′和要合成的CRP1或B7RP1多肽的编码序列的5′端。SD序列是不同的，但一般是多嘌呤(即，具有高A-G含量)。已经鉴别出许多SD序列，每个都可使用上面列出的和在原核载体中使用的方法容易地合成。
在希望从宿主细胞分泌CRP1或B7RP1多肽的情况下，可以用信号序列指导多肽从宿主细胞的输出。CRP1或B7RP1跨膜结构域也通过突变或缺失而灭活，以防止对宿主膜的附着。一般说来，信号序列位于CRP1或B7RP1基因或cDNA的编码区，或正好位于CRP1或B7RP1基因编码区的5′端。已鉴别出许多信号序列，它们中在选定的宿主细胞中具功能性的任何一个可以用于结合CRP1或B7RP1基因或cDNA。因此，信号序列可以是与CRP1或B7RP1基因或cDNA同源或异源的，并且可以是与CRP1或B7RP1多肽基因或cDNA同源或异源的。此外，信号序列可以使用上面描述的方法化学合成。
在大多数情况下，多肽经由信号肽的存在从宿主细胞分泌将导致氨基端甲硫氨酸从该多肽去除。
在许多情况下，CRP1或B7RP1基因或cDNA的转录通过载体中一个或多个内含子的存在而增加；当CRP1或B7RP1多肽在真核宿主细胞、特别是哺乳动物宿主细胞中产生时尤其是这样。所用的内含子可以是天然产生于CRP1或B7RP1基因中的，尤其当所用的基因是全长基因组序列或其片段时。若内含子不是天然产生于基因中的(就大多数cDNA来说)，则内含子可以从另外的来源得到。内含子关于5′侧翼序列和CRP1或B7RP1基因的位置通常是重要的，因此内含子必须被有效地转录。如此，当插入表达载体中的CRP1或B7RP1基因是cDNA分子时，内含子的优选位置是转录起始部位的3′端和聚腺苷酸转录终止序列的5′端。最好内含子将位于cDNA的一侧或另一侧(即，5′或3′)，以便它不会中断此编码序列。来自任何来源包括任何病毒、原核生物和真核生物(植物或动物)的任何内含子都可用于实施本发明，只要其与要插入的宿主细胞相容。此处还包括合成内含子。可选地，载体中可以使用一个以上内含子。
当要使用的载体中不存在上面列出的一个或多个元件时，可以单独得到它们并连接到载体中。用于得到每个元件的方法是熟练技术人员熟知的。
优选的用于实施本发明的载体是与细菌、昆虫和哺乳动物宿主细胞相容的那些。这类载体包括，特别是pCRII、pCR3和pcDNA3.1(InvitrogenCompany，San Diego，CA)，pBSII(Stratagene Company，La Jolla，CA)，pET15b(Novagen，Madison，WI)，pGEX(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，pEGFP-N2(Clontech，Palo Alto，CA)，pETL(BlueBacII；Invitrogen)，和pFastBacDual(Gibco/BRL，Grand Island，NY)。
当载体已构建成且编码全长或截短的CRP1或B7RP1多肽的核酸分子已插入到该载体的适当部位后，完成的载体可以插入到合适的宿主细胞中用于扩增和/或多肽表达。
宿主细胞可以是原核宿主细胞(诸如大肠杆菌)或者是真核宿主细胞(诸如酵母细胞、昆虫细胞或脊椎动物细胞)。宿主细胞当在合适的条件下培养时可以合成CRP1或B7RP1多肽，它们随后可从培养基中收集(如果宿主细胞将它们分泌到培养基中)，或者直接从生成它们的宿主细胞收集(如果它们未被分泌)。收集后，CRP1或B7RP1多肽可以使用诸如分子筛色谱法、亲和色谱法等方法纯化。
用于CRP1或B7RP1多肽生产的合适的宿主细胞的选择将取决于多种因素，诸如所需的表达水平，活性所需的多肽修饰诸如糖基化或磷酸化，或容易折叠到生物活性分子中。
合适的细胞或细胞系可以是哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人胚胎肾(HEK)293或293T细胞、或3T3细胞。合适的哺乳动物宿主细胞和转化、培养、扩增、筛选以及产物生成和纯化的方法的选择是本领域中已知的。其他合适的哺乳动物细胞系是猴COS-1和COS-7细胞系，以及CV-1细胞系。其他例举性的哺乳动物宿主细胞包括灵长目动物细胞系和啮齿动物细胞系，包括转化细胞系。正常的二倍体细胞、从原始组织的体外培养得到的细胞株、以及初级外植体也是合适的。候选细胞可以是选择基因基因型缺损的，或者可以含有显性开放选择基因。其他合适的哺乳动物细胞系包括但不限于小鼠成神经细胞瘤N2A细胞，HeLa，小鼠L-929细胞，来自瑞士Balb-c或NIH小鼠的3T3细胞系，BHK或HaK仓鼠细胞系。
类似地用作宿主细胞的是细菌细胞。例如，大肠杆菌的不同菌株(例如HB101，DH5a，DH10和MC1061)在生物技术领域中是众所周知的宿主细胞。枯草芽胞杆菌、假单胞杆菌、其他芽胞杆菌、链霉菌等的不同菌株也可以用于此方法。
本领域技术人员已知的许多酵母细胞株也可以作为宿主细胞用于本发明多肽的表达。
另外，需要时，在本发明方法中可以利用昆虫细胞系统。这类系统记载于例如Kitts等(Biotechniques(生物技术)14810-817(1993))，Lucklow(Curr.Opin.Biotechnol.，4564-572(1993))和Lucklow等(J.Virol.(病毒学杂志)674566-4579(1993))。优选的昆虫细胞是Sf-9和Hi5(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
表达载体“转化”或“转染”到选定的宿主细胞中可以使用象氯化钙、电穿孔、微注射、脂质转染或DEAE-葡聚糖法等这样的方法完成。所选的方法将部分是要使用的宿主细胞类型的函数。这些方法以及其他合适的方法是熟练技术人员熟知的，并且记载于例如Sambrook等(同上)中。
用表达载体转化或转染的宿主细胞可以使用熟练技术人员熟知的标准培养基培养。培养基通常将含有细胞生长和存活所必需的所有营养素。合适的用于培养大肠杆菌细胞的培养基是例如Luria肉汤(LB)和/或Terrific肉汤(TB)。合适的用于培养真核细胞的培养基是RPMI 1640，MEM，DMEM，它们所有都可以根据所培养的特定细胞系的需要添加血清和/或生长因子。合适的用于昆虫培养的培养基是根据需要添加了yeastolate、水解乳白蛋白和/或胎牛血清的Grace培养基。
通常，只用于转化细胞的选择性生长的抗生素或其他化合物作为补充物加入培养基中。要使用的化合物将取决于转化宿主细胞的质粒上存在的选择性标记元件。例如，若选择性标记元件是卡那霉素抗性的，则加入到培养基中的化合物将是卡那霉素。
宿主细胞中产生的CRP1或B7RP1多肽的量可以使用本领域中已知的标准方法来评估。这类方法包括但不限于蛋白质印迹分析，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，非变性凝胶电泳，HPLC分离，免疫沉淀，和/或活性分析诸如DNA结合凝胶移动试验。
如果CRP1或B7RP1多肽已计划从宿主细胞分泌，则大多数多肽可以在细胞培养基中找到。以这种方式制备的多肽一般将不具有氨基端甲硫氨酸，因为它在从细胞分泌的过程中被除去了。不过，如果CRP1或B7RP1多肽没有从宿主细胞分泌，它将存在于细胞质和/或核中(对于真核宿主细胞)或存在于胞质溶胶中(对于革兰氏阴性菌宿主细胞)，并且可以有氨基端甲硫氨酸。
CRP1或B7RP1多肽从溶液的纯化可以使用各种技术完成。如果多肽已被合成使得它含有位于其羧基端或氨基端的尾端诸如六组氨酸(CRP1或B7RP1/hexaHis)或其他小肽诸如FLAG(Eastman Kodak Co.，New Haven，CT)或myc(Invitrogen，Carlsbad，CA)，则它基本上可以通过使加尾的多肽通过亲和柱而以一步操作纯化，其中柱基质对尾端或直接对该多肽具有高亲和力(即，特异性识别CRP1或B7RP1多肽的单克隆抗体)。例如，聚组氨酸结合对镍的主要亲和力和特异性，因此镍的亲和柱(诸如Qiagen镍柱)可以用于CRP1或B7RP1/polyHis的纯化(参见例如，Ausubel等编写的《分子生物学中的流行方案》第10.11.8节，John Wiley&Sons，New York(1993))。
当制备的CRP1或B7RP1多肽没有尾端附着时，且没有可利用的抗体时，可以使用其他众所周知的纯化方法。这类方法包括但不限于离子交换色谱法，分子筛色谱法，HPLC，非变性凝胶电泳结合凝胶洗脱，和制备等电聚焦(“Isoprime”机器/技术，Hoefer Scientific)。在有些情况下，可以结合使用这些技术中的两种或多种来提高纯度。
如果预期CRP1或B7RP1多肽将主要在细胞内发现，则胞内物质(包括革兰氏阴性菌的包涵体)可以使用熟练技术人员已知的任何标准技术从宿主细胞中提取出来。例如，宿主细胞可以通过弗氏压碎器、匀化和/或超声处理后离心而裂解，以释放出周质/细胞质的内含物。
如果CRP1或B7RP1多肽已在胞质溶胶中形成包涵体，则该包涵体经常可结合到内和/或外细胞膜上并由此在离心后将主要在颗粒物质中发现。该颗粒物质然后可在pH极值下处理或在还原剂诸如二硫苏糖醇的存在下在碱性pH下或在三羧乙基膦的存在下在酸性pH下用离液剂诸如去污剂、胍、胍衍生物、脲或脲衍生物处理，以释放、破碎和溶解包涵体。现在为可溶形式的多肽然后可使用凝胶电泳、免疫沉淀等进行分析。如果希望分离CRP1或B7RP1多肽，分离可以使用标准方法完成，诸如下面列出的那些和记载于Marston等(Meth.Enz.(酶学方法学)182264-275(1990))中的。在有些情况下，CRP1或B7RP1多肽分离后可能不是生物活性的。用于将多肽“重折叠”或转变为其三级结构并生成二硫键的各种方法可以用于还原生物活性。这类方法包括使溶解多肽在特定浓度的适宜离液剂的存在下与pH通常在7以上的溶液接触。在大多数情况下，重折叠/氧化溶液还将含有还原剂或特定比例的还原剂和相应的氧化形式，以产生特定的氧化还原电位，使得在蛋白质的半胱氨酸桥的形成中发生二硫化物穿梭。一些常用的氧化还原对包括半胱氨酸/胱胺，谷胱甘肽(GSH)/二硫基双GSH，氯化铜，二硫苏糖醇(DTT)/二噻烷DTT，2-巯基乙醇(bME)/二硫-b(ME)。在许多情况下，需要共溶剂来增加重折叠的效率，用于此目的的更多普通试剂包括甘油、不同分子量的聚乙二醇、和精氨酸。
CRP1或B7RP1多肽、其片段和/或衍生物也可以通过化学合成法(诸如固相肽合成)制备，可使用本领域中已知的技术诸如下列文献中记载的那些Merrifield等(J.Am.Chem.Soc.(美国化学会会志)852149(1963))，Houghten等，(Proc Natl Acad.Sci.USA(美国国家科学院院报)825132(1985))和Stewart & Young(Solid Phase PeptideSynthesis(固相肽合成)，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL(1984))。合成的这些多肽的氨基端上可以有或没有甲硫氨酸。化学合成的CRP1或B7RP1多肽或片段可以使用这些参考文献中记载的方法进行氧化，以形成二硫键。CRP1或B7RP1多肽或片段预期具有可比得上重组产生的或从天然来源纯化的CRP1或B7RP1多肽的生物活性，并因此可以与重组或天然CRP1或B7RP1多肽互换使用。
多肽术语“CRP1或B7RP1多肽”指的是具有图1A(SEQ ID NO2)、图2A(SEQ ID NO7)或图3A(SEQ ID NO12)所示的氨基酸序列的多肽以及本文中描述的所有相关多肽。相关多肽包括等位变体、剪接变体、片段、衍生物、置换、缺失和插入变体、融合多肽、和直向同源物。这些相关多肽可以是成熟多肽，即，缺乏信号肽的多肽。CRP1或B7RP1多肽可以有或没有氨基端甲硫氨酸，这取决于它们的制备方式。
术语“CRP1或B7RP1多肽片段”指的是小于图1A(SEQ ID NO2)、图2A(SEQ ID NO7)或图3A(SEQ ID NO12)中列出的CRP1或B7RP1多肽的全长氨基酸序列的肽或多肽。这样的片段可以来自于在氨基端的截短、在羧基端的截短和/或多肽序列内部的缺失。制备的这种CRP1或B7RP1多肽片段可以有或没有氨基端甲硫氨酸。此外，CRP1或B7RP1多肽片段可以是天然产剪接变体、其他剪接变体和由天然产体内蛋白酶活性产生的片段。优选的CRP1或B7RP1多肽片段包括可溶形式的CRP1或B7RP1，其缺乏功能性跨膜结构域并包含CRP1或B7RP1的部分或全部胞外域。
术语“CRP1或B7RP1多肽变体”指的是其氨基酸序列与图1A(SEQID NO2)、图2A(SEQ ID NO7)或图3A(SEQ ID NO12)中列出的CRP1或B7RP1多肽氨基酸序列相比含有一个或多个氨基酸序列置换、缺失和/或增加的CRP1或B7RP1多肽。这些CRP1或B7RP1多肽变体可以从相应的CRP1和B7RP1多肽核酸分子变体制备，它们具有因此与CRP1或B7RP1多肽的DNA序列不同的DNA序列。
本文中所用的术语“CRP1或B7RP1多肽衍生物”指的是已通过例如加入一个或多个水溶性聚合物、N-联或O-联糖类、糖、磷酸酯和/或其他这类分子进行了化学修饰的CRP1或B7RP1多肽、其变体或片段，其中这些分子不是天然附着到野生型CRP1或B7RP1多肽的。衍生物还包括天然附着到CRP1或B7RP1多肽的一个或多个化学基团的缺失。
本文中所用的术语“生物活性CRP1或B7RP1多肽”、“生物活性CRP1或B7RP1多肽片段”、“生物活性CRP1或B7RP1多肽变体”和“生物活性CRP1或B7RP1多肽衍生物”指的是具有至少一个CRP1或B7RP1的活性特征的CRP1或B7RP1多肽。一个活性是B7RP1对CRP1的结合。另一个活性是CRP1或B7RP1刺激T细胞增殖和/或活化的能力。
术语“直向同源物”指的是与从某物种鉴别的多肽相对应的多肽。例如，小鼠和人B7RP1多肽被认为是直向同源物。
术语“成熟氨基酸序列”指的是缺乏前导序列的多肽。
术语“分离多肽”是指在其天然环境中没有发现至少一个污染多肽的多肽，且最好基本上没有任何其他污染哺乳动物多肽。
如本领域中公知的，术语“相同”是两个或多个核酸分子或两个或多个多肽的序列之间的关系，是通过对比序列确定的。在本领域中，“相同”也意味着多肽或核酸分子序列之间的序列相关性程度，根据具体情况，通过核苷酸或氨基酸序列串之间的比较确定。“相同”测量的是两个或多个序列之间同一匹配的百分数，通过特定计算机程序(即“算法”)进行间隙序列对比。
术语“相似性”是指相关概念，但与“相同”形成对照，相似性的量度包括相同匹配和保守置换匹配。由于保守置换应用于多肽而不用于核酸分子，因此相似性只涉及多肽序列对比。如果两个多肽序列有例如10/20相同的氨基酸，且剩余部分全是非保守置换，则相同百分数和相似性百分数都将是50％。如果在相同的例子中，有5个以上的位置有保守置换，则相同百分数仍然是50％，但相似性百分数将是75％(15/20)。因此，在有保守置换的情况下，两个多肽序列之间的相似性程度将高于这两个序列之间的相同百分数。“保守”氨基酸代替物在下文中参照表I进行描述。在表I的基础上，保守氨基酸代替物是从相同组中选择的替换氨基酸，例如，碱性、酸性、无荷极性和非极性组。例如，精氨酸的保守氨基酸代替物将是赖氨酸和组氨酸。
相同和相似性可以利用已知方法容易地计算出，包括但不限于下列文献中描述的那些Computational Molecular Biology(计算分子生物学)，Lesk，A.M.编辑，Oxford University Press，New York，1988；BiocomputingInformatics and Genome Projects(生物计算信息学和基因组测序计划)，Smith，D.W.编辑，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data(序列数据的计算机分析)，第1部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology(分子生物学中的序列分析)，vonHeinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer(序列分析引物)，Gribskov，M.和Devereux，J.编辑，M.Stockton Press，New York，1991；以及Carillo，H.和Lipman，D.，SIAMJ.Applied Math.(SIAM应用数学杂志)481073(1988)。
优选的测定相同和/或相似性的方法是计划给出所检验序列之间的最大匹配。将测定相同和相似性的方法编纂成公众可获得的计算机程序。优选的用于测定两个序列之间的相同和相似性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包，包括GAP(Devereux，J.等，Nucleic AcidsResearch(核酸研究)12(1)387(1984)；Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)，BLASTP，BLASTN和FASTA(Atschul，S.F.等，J.Molec.Biol(分子生物学杂志)215403-410(1990).BLAST X程序是公众可从国家生物技术信息中心(NCBI)和其他来源获得的(BLAST手册，Altschul，S.等，NCB NLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.等，J.Mol.Biol(分子生物学杂志)215403-410(1990)。众所周知的Smith Waterman算法也可以用于测定相同性。
作为实例，使用计算机算法GAP(Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)，将要测定序列相同百分数的两个多肽进行排列，使它们各自的氨基酸最佳匹配(“配对广度”，利用算法测定)。将裂隙缺口损失(计算为3X平均对角线；“平均对角线”是所使用的对比矩阵的对角线的平均数；“对角线”是通过特定对比矩阵赋予每个完美氨基酸配对的得分或数值)和裂隙伸展损失(通常是裂隙缺口损失的1/10倍)，以及对比矩阵诸如PAM 250或BLOSUM 62与算法联合使用。标准对比矩阵(关于PAM250对比矩阵，参见Dayhoff等，载于蛋白质序列和结构图谱，第5卷，附录3(1978)；关于BLOSUM 62对比矩阵，参见Henikoff等，Proc.Natl.Acad.Sci USA(美国国家科学院院报)8910915-10919(1992))也由算法使用。
优选的用于多肽序列对比的参数包括以下这些算法Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)48443-453(1970)对比矩阵BLOSUM 62，来自Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院报)8910915-10919(1992)裂隙损失12裂隙长度损失4相似性阈值0GAP程序与上述参数一起使用。上述参数是使用GAP算法进行多肽对比的默认参数(再加上末端裂隙没有损失)。
优选的用于核酸分子序列对比的参数包括以下这些算法Needleman和Wunsch，J.Mol Biol.(分子生物学杂志)48443-453(1970)对比矩阵匹配＝+10，不匹配＝0裂隙损失50裂隙长度损失3GAP程序也与上述参数一起使用。上述参数是用于核酸分子对比的默认参数。
本领域技术人员也可以使用其他例举性的算法、裂隙缺口损失、裂隙伸展损失、对比矩阵、相似性阈值等，包括Program Manual(程序手册)，Wisconsin Package，第9版，1997年9月中列出的那些。要作出的特定选择将取决于要进行的具体对比，诸如DNA与DNA、蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA；以及此外，该对比是否是序列对之间的(在这种情况下GAP或BestFit一般是优选的)或者是一个序列与一个大序列资料库之间的(在这种情况下FASTA或BLASTA是优选的)。
至少约70％相同的多肽与野生型CRP1或B7RP1多肽相比一般将有一个或多个氨基酸置换、缺失和/或增加。在优选实施方案中，多肽将与CRP1或B7RP1多肽有约75％、80％、85％、90％或95％相同。通常，天然残基的代替物将是丙氨酸或保守氨基酸，以便对该多肽的总净电荷、极性或疏水性影响较小或没有影响。保守代替物列在下表I中。
表I保守氨基酸代替物碱性精氨酸赖氨酸组氨酸酸性谷氨酸天门冬氨酸无荷极性谷氨酰胺天门冬酰胺丝氨酸苏氨酸酪氨酸非极性 苯丙氨酸色氨酸半胱氨酸甘氨酸丙氨酸缬氨酸脯氨酸甲硫氨酸亮氨酸正亮氨酸异亮氨酸本发明提供了CRP1或B7RP1多肽衍生物。在一个实施方案中，其中CRP1或B7RP1多肽与聚合物相连的化学修饰的CRP1或B7RP1多肽组合物包括在本发明的范围内。所选的聚合物一般是水溶性的，以便其附着的蛋白质不会在含水环境诸如生理环境中沉淀。所选聚合物通常经修饰具有单一活性基，诸如用于酰化的活性酯或用于烷基化的醛，以便聚合程度在本发明方法中可以加以控制。聚合物可以是任何分子量的，并且可以是支链或无支链的。本发明范围内包括聚合物的混合物。优选地，为了最终产物制剂的治疗应用，聚合物将是药学上可接受的。
水溶性聚合物或其混合物可以从下列成员中选择，例如聚乙二醇(PEG)，一甲氧基-聚乙二醇，葡聚糖，纤维素，或其他糖基聚合物，聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙基化多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇。
对于酰化反应，所选聚合物应当具有单一活性酯基。对于还原烷基化，所选聚合物应当具有单一活性醛基。优选的活性醛是聚乙二醇丙醛，它是水稳定的，或者是其一C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(参见美国专利No.5,252,714)。
CRP1或B7RP1多肽的聚乙二醇化(pegylation)可以利用本领域中已知的任何一种聚乙二醇化反应进行，例如在下列参考文献中描述的那些Focus on Growth Factors(生长因子聚焦)34-10(1992)；EP0154316；和EP0401384。优选地，聚乙二醇化经由与如下所述的活性聚乙二醇分子(或类似活性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行。
特别优选用于此处的水溶性聚合物是聚乙二醇，简写为PEG。如本文中所用，聚乙二醇的意思包括已用于衍生其他蛋白质的任何形式的PEG，诸如一(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇。
一般说来，化学衍生化可以在用于使生物活性物质与活性聚合物分子反应的任何适宜条件下进行。制备聚乙二醇化CRP1和B7RP1多肽的方法通常将包括以下步骤(a)、让多肽与聚乙二醇(诸如PEG的活性酯或醛衍生物)在使CRP1或B7RP1多肽附着上一个或多个PEG基的条件下进行反应，和(b)、得到反应产物。一般，用于酰化反应的最佳反应条件将在已知参数和所需结果的基础上决定。例如，PEG蛋白质的比值越大，聚乙二醇化产物的百分数就越大。
通常，可以通过给药CRP1或B7RP1聚合物缀合物得到减轻或调制的病况包括本文中有关非缀合CRP1或B7RP1多肽描述的那些。但是，此处公开的缀合物与非衍生分子相比可以有另外的活性、生物活性增强或降低、或其他特性诸如半衰期增加或减小。
CRP1或B7RP1多肽、片段、变体、和衍生物可以单独使用、一起使用或者与其他药物组合物联合使用。如果对所治疗的适应症合适，CRP1或B7RP1多肽、片段、变体和衍生物可以与细胞因子、生长因子、抗生素、抗炎药和/或化疗剂联合用药。
本发明提供了CRP1或B7RP1的选择结合剂。选择结合剂是指对CRP1或B7RP1具有特异性的分子，可包括蛋白质、肽、核酸、糖类、脂质或小分子量化合物。选择结合剂与CRP1或B7RP1相互作用并依次调节CRP1与B7RP1的结合。在一个实施方案中，选择结合剂部分或完全阻断CRP1对B7RP1的结合并部分或完全抑制CRP-1或B7RP-1的至少一个生物活性，诸如免疫共同刺激活性。在另一个实施方案中，选择结合剂是抗体。该抗体可以是具有与CRP1或B7RP1的免疫反应性的，并优选具有与B7RP1的免疫反应性。在本发明的又一个实施方案中，与B7RP1反应的抗体结合到B7RP1上的表位上，使得与CRP1的结合被部分或完全阻断，且B7RP1的至少一个生物活性诸如免疫共同刺激活性被部分或完全抑制。术语完全抑制意味着没有出现进一步的抑制增加。
CRP1或B7RP1多肽、片段、变体和/或衍生物可以使用本领域中的已知方法用于制备抗体。因此，与CRP1或B7RP1多肽反应的抗体以及这类抗体的活性片段也包括在本发明的范围内。抗体可以是多克隆的、单克隆的、重组的、嵌合的、单链和/或双特异性的。一般，抗体或其片段将是人类来源的，或者将是“人源化”的，即，对其进行制备使对患者给药时防止或最小化对抗体的免疫反应。抗体片段可以是与本发明的CRP1和B7RP1多肽反应的任何片段，诸如Fab、Fab’，等。本发明还提供了杂交瘤，它是通过下列步骤产生的将任何CRP1或B7RP1多肽或其片段作为抗原呈递给选出的哺乳动物，接着将该哺乳动物的细胞(例如脾细胞)与某种癌细胞融合，以通过已知技术制造无限增殖化细胞系。用于产生这类细胞系和指向本发明的人CRP1或B7RP1多肽的所有或部分的抗体的方法也包括在本发明内。
本发明的单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中一部分重链和/或轻链与从特定物种得到的或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或类似，而该链的剩余部分与从另一个物种得到的或属于另一个抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或类似，以及这类抗体的片段，只要它们显示出所需的生物活性(美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.(国家科学院院报)81，6851-6855(1985))。
在一个优选的实施方案中，嵌合抗-CRP1或B7RP1抗体是“人源化”抗体。用于人源化非人抗体的方法是本领域中众所周知的。通常，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入其中的氨基酸残基。人源化可以按照本领域中的已知方法(Jones等，Nature(自然)321，522-525(1986)；Riechmann等，Nature(自然)332，323-327(1988)；Verhoeyen等，Science(科学)239，1534-1536(1988))，通过用人抗体的相应区取代啮齿动物的互补性决定区(CDRs)来完成。
本发明也包括完全人抗-CRP1或抗-B7RP1抗体。这类抗体可以通过免疫接种能在没有内源性免疫球蛋白产生的条件下产生人抗体的所有组成成分的转基因动物(例如小鼠)的CRP1或B7RP1抗原而生成。参见，例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.(国家科学院院报)90，2551-2555(1993)；Jakobovits等，Nature(自然)362，255-258(1993)。人抗体也可以在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)227，381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.222，581(1991)。
本发明的选择结合剂可以用于调节CRP1对B7RP1的结合，并调节由CRP1和B7RP1介导的至少一种生物活性诸如免疫共同刺激。这类选择结合剂的例子是与CRP1或B7RP1有免疫反应性的抗体。这些抗体可以用于医疗，诸如用于抑制CRP1和B7RP1多肽对其结合配偶体的结合。这些抗体还可用于体内和体外诊断目的，诸如以标记形式用于检测体液或细胞样本中CRP1和B7RP1多肽的存在。
药物组合物和给药本发明的范围内包括CRP1或B7RP1多肽的药物组合物。这类组合物可包含与药学上可接受的载体混合的治疗有效量的多肽或片段、变体或衍生物。在优选的实施方案中，药物组合物包含可溶形式的CRP1或B7RP1多肽，它们包括CRP1或B7RP1的部分或全部胞外域。一般说来，CRP1和B7RP1多肽治疗化合物将以包含纯多肽、片段、变体或衍生物连同一种或多种生理上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合物形式给药。载体物质可以是注射用水，优选添加对哺乳动物给药的溶液中常用的其他物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是例举性的适宜载体。优选地，使用合适的赋形剂(例如蔗糖)将产物配制成冻干物。根据需要也可包括其他标准载体、稀释剂和赋形剂。其他例举性组合物包含约pH7.0-8.5的Tris缓冲剂，或约pH4.0-5.5的乙酸盐缓冲剂，它们还可包括山梨糖醇或其合适的取代物。
CRP1或B7RP1药物组合物可以肠胃外给药。另一方面，该组合物可以静脉注射或皮下注射给药。当系统给药时，用于本发明的治疗组合物可以是无热原的、胃肠外可接受的水溶液形式。这类药学上可接受的蛋白质溶液制剂，适当地考虑到pH、等渗性、稳定性等等，在本领域的技术范围内。
用于实施本发明的CRP1和B7RP1多肽组合物的治疗制剂可以通过将具有所需纯度的选定组合物与可选的生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington药物科学，第18版，A.R.Gennaro编辑，MackPublishing Company(1990))混合制备成冻干药饼或水溶液形式储存备用。可接受的载体、赋形剂或稳定剂对接受者来说是无毒的，优选在所用的剂量和浓度下是惰性的，并且包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸；抗氧剂诸如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖醇诸如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子诸如钠；和/或非离子表面活性剂诸如吐温、pluronics或聚乙二醇(PEG)。
要用于医疗的CRP1或B7RP1多肽组合物的有效量将取决于例如治疗目的，诸如使用CRP1和B7RP1多肽所针对的适应症，给药途径，和患者的病情。因此，对于治疗学家来说将需要根据需要来调整剂量和变更给药途径，以获得最佳治疗效果。典型的每日剂量范围可以是从约0.1μg/kg至最多100mg/kg或更高，这取决于上面提到的各种因素。一般，临床医师将给药该组合物直至达到了所需效果时的剂量。因此组合物可以作为单剂给药，或者作为两剂或多剂(可以含有或不含相同量的CRP1或B7RP1多肽)在一定时间内给药，或者作为连续输液剂经植入装置或导管给药。
进行了进一步的研究后，将形成关于治疗不同患者的不同病情时的适宜剂量水平的信息，并且普通技术人员在考虑了治疗内容、所治疗的疾病类型、受治疗者的年龄和健康状况后将能够确定合适的给药剂量。
要用于体内给药的CRP1或B7RP1多肽组合物必须是无菌的。通过无菌滤膜过滤就可容易地实现这一点。当组合物被冷冻干燥时，使用这些方法灭菌即可以在冷冻干燥和重新构成之前进行，也可以在之后进行。用于肠胃外给药的组合物一般将以冻干形式或溶液形式储存。
治疗组合物一般放置到具有无菌进入孔的容器中，例如，静脉内溶液袋或带有可通过皮下注射针刺入的塞子的小瓶。
组合物的给药途径符合已知方法，例如口服、注射或静脉滴注、腹膜内注射、大脑内(实质内)注射、脑室内注射、肌内注射、眼内给药、动脉内给药或损害内给药途径，或者通过缓释系统或可以可选地涉及使用导管的植入装置给药。需要时，组合物可以通过输液、浓注或通过植入装置连续给药。
另一方面或另外，组合物可以通过植入到膜、海绵、或CRP1和B7RP1多肽已被吸收到其上的其他适宜物质的受影响区域中而局部给药。
当使用植入装置时，该装置可以植入到任何适宜的组织或器官中，CRP1或B7RP1多肽可以直接通过该装置经由药团、或经由连续给药、或经由导管利用连续输液而释放。CRP1或B7RP1多肽可以以缓释制剂给药。合适的缓释制剂的例子包括成型颗粒形式的半透聚合物基质，例如薄膜或微胶囊。缓释基质包括聚酯、水凝胶、聚交酯(U.S.3,773,919，EP 58,481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸脂的共聚物(Sidman等，Biopolymers(生物高分子)22547-556(1983))、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.，15167-277(1981)和Langer，Chem.Tech.，1298-105(1982))、乙烯基乙酸乙烯酯(Langer等，同上)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。缓释组合物还可包括脂质体，它可以用本领域中已知的若干方法中的任何一种方法制备(例如，Eppstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院报)823688-3692(1985)；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949)。
在有些情况下，希望以来自体内方式使用CRP1或B7RP1多肽组合物。此时，令已从患者体内取出的细胞、组织或器官接触CRP1或B7RP1多肽组合物，之后再将该细胞、组织和/或器官植回到患者体内。
在另外一些情况下，CRP1或B7RP1多肽可以通过下列方法释放向患者体内植入某些已使用诸如本文中描述的那些方法进行了基因工程改造的细胞，以表达和分泌多肽、片段、变体或衍生物。这类细胞可以是动物或人细胞，并且可以是从患者自己的组织或从另外的人或非人来源得到的。可选地，这些细胞可以是无限增殖化的。但是，为了减少发生免疫反应的可能性，优选将这些细胞包胶囊，以避免周围组织的浸润。胶囊化材料一般是生物相容的、半渗透性的聚合外壳或膜，以允许蛋白质产物释放但阻止细胞通过患者的免疫系统或通过来自周围组织的其他有害因素遭到破坏。
用于细胞的膜胶囊化的方法是熟练技术人员熟知的，且胶囊化细胞的制备和它们向患者体内的植入可以不经不适当的实验就可完成，参见，例如美国专利4,892,538；5,011,472和5,106,627。用于胶囊化活细胞的系统描述于PCT WO91/10425(Aebischer等)。用于配制各种其他缓释或控释装置诸如脂质体载体、生物腐蚀颗粒或珠粒的技术也是本领域技术人员已知的，且描述于例如美国专利No.5,653,975。胶囊化或未胶囊化的细胞可以植入到患者的合适的身体组织或器官中。
如上所讨论，希望用一个或多个CRP1或B7RP1多肽、变体、衍生物和/或片段处理细胞制剂。这可以通过使包括T细胞的细胞诸如骨髓细胞与多肽、变体、衍生物或片段直接接触来完成，其中这些多肽、变体、衍生物或片段为可渗透细胞膜的形式。例如，包括T细胞的细胞可以与B7RP1多肽接触以激活T细胞功能，并将如此处理过的细胞植入到患者体内。
另一方面，可以采用基因治疗。其中可以应用基因治疗的一种方式是使用可以是与组成型或诱导型启动子可操作地相连的CRP1或B7RP1基因(编码CRP1或B7RP1多肽的基因组DNA、cDNA和/或合成DNA，或其片段、变体或衍生物)来形成“基因治疗DNA构成物”。启动子可以是与内源CRP1或B7RP1基因同源或异源的，只要它在将要向其中插入构成物的细胞或组织类型中是活性的。该基因治疗DNA构成物的其他组分可以根据需要可选地包括计划用于位点特异性整合的DNA分子(例如用于同源重组的内源侧翼序列)、组织特异性启动子、增强子或沉默子、能给母细胞提供选择性优点的DNA分子、用作标记来鉴别转化细胞的DNA分子、负选择系统、细胞特异性结合剂(例如用于细胞导向的)、细胞特异性内化因子、和增强通过载体的表达的转录因子以及使得载体能够制造的因子。
该基因治疗DNA构成物然后可引入到患者的细胞中(来自体内或体内的)。用于引入基因治疗DNA构成物的一种方法是通过病毒载体。通常在基因治疗中用于释放基因治疗DNA构成物的合适的病毒载体包括但不限于腺病毒、腺伴随病毒、单纯性疱疹病毒、慢病毒、乳头状瘤病毒、和逆转录病毒载体。这些载体中的一些，诸如逆转录病毒载体，将把基因治疗DNA构成物释放到患者细胞的染色体DNA中，且该基因治疗DNA构成物可以整合到该染色体DNA中；其他载体将起游离基因的作用，而该基因治疗DNA构成物将保留在细胞质中。基因治疗载体的使用描述于例如美国专利5,672,344、5,399,346。
不使用病毒载体而将基因治疗DNA构成物释放到患者细胞中的其他方法包括但不限于脂质体介导的转移，裸DNA的直接注射，受体介导的转移(配体-DNA复合物)，电穿孔，磷酸钙沉淀，和微粒轰击(例如“基因枪”)。参见美国专利4,970,154，WO96/40958，5,679,559，5,676,954和5,593,875。
另一种通过基因治疗增加细胞中内源CRP1或B7RP1多肽表达的方法是将一个或多个增强子元件插入CRP1或B7RP1多肽启动子，其中该增强子元件可以用于提高CRP1或B7RP1多肽基因的转录活性。所用的增强子元件将在希望激活其中的基因的组织基础上挑选；将选择已知能在该组织中激活启动子的增强子元件。例如，如果要在T细胞中“打开”CRP1或B7RP1多肽，可以使用lck启动子增强子元件。此时，要加入的转录元件的功能部分可以使用标准克隆技术插入到含有CRP1或B7RP1多肽启动子(和可选的载体、5′和/或3′侧翼序列等)的DNA片段中。此构成物，被认为是“同源重组构成物”，然后可来自体内或体内引入到所需细胞中。
基因治疗可以用于通过修饰内源启动子的核苷酸序列而减少CRP1或B7RP1多肽表达。这种修饰一般通过同源重组方法完成。例如，含有选定用于灭活的CRP1或B7RP1基因的全部或部分启动子的DNA分子可以进行改造以除去和/或替换调节转录的启动子片段。此时，启动子的转录激活物的TATA框和/或结合位点可以使用标准分子生物学技术删除；这种缺失可以抑制启动子活性，由此抑制相应CRP1或B7RP1基因的转录。启动子中TATA框或转录激活物结合位点的缺失可以通过生成包含CRP1或B7RP1多肽启动子的所有或相关部分(来自与要调节的CRP1或B7RP1基因相同或相关的物种)的DNA构成物来完成，其中一个或多个TATA框和/或转录激活物结合位点核苷酸经由置换、删除和/或插入一个或多个核苷酸而变异，使得该TATA框和/或激活物结合位点活性降低或可能完全灭活。此构成物一般还将含有与已经过修饰的启动子节段的天然(内源)5′和3′侧翼区相对应的至少约500个碱基的DNA，可以如上所述将它直接或经由病毒载体引入到合适的细胞中(来自体内或体内地)。一般，构成物向细胞的基因组DNA中的整合将经由同源重组，其中该启动子构成物中的5′和3′侧翼DNA序列可以用于帮助将修饰启动子区通过杂交整合到内源染色体DNA中。
当希望抑制一个或多个CRP1或B7RP1多肽时也可以采用其他基因治疗方法。例如，具有与选定CRP1或B7RP1多肽基因的至少一部分互补的序列的反义DNA或RNA分子可以引入细胞中。通常，每个这种反义分子将是与每个选定CRP1或B7RP1基因的起始点(5’端)互补的。当该反义分子然后杂交到相应的CRP1或B7RP1多肽mRNA中时，该mRNA的翻译被阻止。
另一方面，基因治疗可以用于制造一个或多个CRP1或B7RP1多肽的显性失活抑制剂。在这种情况下，可以制备编码每个选定CRP1或B7RP1多肽的突变全长或截短多肽的DNA并如上所述使用病毒或非病毒方法将其引入到患者的细胞中。每个这样的突变体一般计划它的生物学作用是与内源多肽竞争。
激动剂和拮抗剂本发明还提供了CRP1或B7RP1的激动剂和拮抗剂，它们调节二者之一或这两种分子的活性。激动剂和拮抗剂可以从改变B7RP1对CRP1的结合的检验分子中鉴别。
术语“检验分子”指的是正就其结合CRP1或B7RP1多肽并由此改变B7RP1对CRP1的结合的能力进行评估的分子。优选地，该检验分子将与至少约106M的亲和常数结合。
各种测定法可以用于测量B7RP1对CRP1的结合。这些测定法可以用于就其增加或减少B7RP1对CRP1的结合率或结合程度的能力对检验分子进行筛选。在一种测定类型中，CRP1多肽、优选可溶形式的CRP1诸如胞外域，通过附着到微量滴定板各孔的底部而固定。放射性标记B7RP1和检验分子然后可每次一个(无论何种顺序)或者同时加入到各孔中。温育后，各孔可以洗涤并使用闪烁计数器对放射性计数，以确定B7RP1结合到CRP1蛋白质的程度。一般，将针对一定浓度范围内的分子进行检验，并且缺乏该检验测定的一个或多个元素的一系列对照孔可以用于提高结果评估中的准确度。对此方法的一种改变涉及掉换蛋白质的“位置”，即，将B7RP1固定到微量滴定板的孔中，用检验分子和放射性标记CRP1温育，并测定CRP1结合的程度(参见，例如《分子生物学中的流行方案》第18章，Ausubel等编辑，John Wiley & Sons，NewYork，NY)。
作为进行放射性标记的另一种选择，可以将CRP1或B7RP1与生物素缀合，然后可使用与酶诸如辣根过氧化物酶[HRP]或碱性磷酸酶[AP]相连的链霉抗生物素检测生物素化蛋白质的存在，可以是进行比色测定，或者是通过链霉抗生物的荧光标记。也可以使用与生物素缀合的指向CRP1或B7RP1的抗体，并且可以在用与AP或HRP相连的酶连链霉抗生物素温育后进行检测。
CRP1和B7RP1也可以通过附着到琼脂糖珠、丙烯酸珠或其他类型的这种惰性底物上加以固定。该底物-蛋白质复合物可以置于含有互补蛋白质和检验化合物的溶液中；温育后，珠粒可以通过离心沉淀，CRP1和B7RP1之间的结合量可以使用上述方法评定。另一方面，该底物-蛋白质复合物可以固定在层析柱中，检验分子和互补蛋白质通过该柱。然后可使用上面所列出的任何一种技术，即放射性标记、抗体结合等等来评定CRP1和B7RP1之间的复合物的形成。
另外一种类型的用于鉴别能增加或减少CRP1/B7RP1复合物形成的检验分子的体外测定法是表面胞质基因共振检测器系统诸如Biacore测定系统(Pharmacia，Piscataway，NJ)。该Biacore系统可以按照制造商的方案进行操作。此测定法主要涉及CRP1或B7RP1与位于检测器中的包覆葡聚糖的传感芯片的共价结合。检验化合物和其他互补蛋白质然后可以同时或顺序注射到含有该传感芯片的室中，结合的互补蛋白质的量可以在与该传感芯片的包覆葡聚糖一侧实际相联系的分子质量变化的基础上加以评定；分子质量的变化可以通过检测器系统测量。
在有些情况下，可能希望评估一起用于增加或减少CRP1/B7RP1复合物形成的两个或多个检验化合物。在这些情况下，上述测定法可以容易地通过与第一种检验化合物同时或顺序加入这类附加检验化合物加以修正。该测定法中的其他步骤如上所述。
体外测定法诸如上述那些可以有利地用于迅速筛选大量化合物对CRP1和B7RP1的复合物形成的作用。可以使这些测定法自动化筛选在噬菌体展示、合成肽和化学合成文库中产生的化合物。
增加或减少CRP1和B7RP1的复合物形成的化合物也可以使用表达这两种多肽之一的细胞和细胞系在细胞培养物中进行筛选。细胞和细胞系可以从任何哺乳动物得到，但优选是来自人的或来自其他灵长目动物、犬或啮齿动物。B7RP1在表面上与表达CRP1的细胞的结合在存在或不存在检验分子的条件下加以评估，结合程度可以通过例如流式细胞仪使用B7RP1的生物素化抗体加以测定。细胞培养物测定法可以有利地用于进一步评估在上述蛋白质结合测定中得分为正的化合物。
治疗应用本发明的多肽、其激动剂和拮抗剂，可以用于调节T细胞的功能。激动剂和拮抗剂包括调节CRP1和/或B7RP1活性且或者增加或者减少CRP1或B7RP1蛋白质的至少一种活性诸如与T细胞功能例如T细胞活化有关的一种活性的那些分子。激动剂或拮抗剂可以是辅因子，诸如蛋白质、肽、糖类、脂质或小分子量分子，它们与CRP1或B7RP1相互作用并由此调节它们的活性。可能的多肽激动剂或拮抗剂包括与可溶形式或膜结合形式的CRP1或B7RP1反应的抗体，它们包含所述蛋白质的部分或所有胞外域。调节CRP1或B7RP1表达的分子一般包括可作为表达的反义调节物的编码CRP1或B7RP1蛋白质的核酸。
CRP1或B7RP1多肽及其激动剂和拮抗剂可以用于治疗自身免疫疾病、移植物存活、用于抑制肿瘤细胞生长的免疫细胞活化、T细胞依赖性B细胞介导疾病、和癌症的基因免疫治疗。在一个实施方案中，CRP1和/或B7RP1功能的拮抗剂或抑制剂可以有助于减轻慢性免疫细胞机能障碍性疾病中的症状。自身免疫疾病诸如系统性红斑狼、类风湿性关节炎、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)和牛皮癣可以用CRP-1/B7RP-1的拮抗剂或抑制剂进行治疗。此外，慢性炎性疾病，诸如炎性肠疾病(节段性回肠炎和溃疡性结肠炎)、突眼性甲状腺肿、慢性甲状腺炎和糖尿病，也可以用CRP1/B7RP-1的抑制剂进行治疗。如实施例18中所述，在啮齿动物类风湿性关节炎疾病模型中，CRP-1-Fc抑制而B7RP-1-Fc增强疾病的发作。在该模型中的这些相反结果证实了B7RP-1-Fc蛋白质的兴奋作用和CRP-1-Fc蛋白质的拮抗作用。结果还阐明了T细胞反应可以如何通过使用这种路径加以调节以及这种路径在类风湿性关节炎进展中的有效性。此外，如实施例19中所述，体内B7RP-1-Fc的表达刺激了转基因小鼠体内的炎性肠疾病(IBD)表型。这个实施例证实了B7RP-1/CRP-1在肠内炎症发展中的作用。因此，B7RP-1/CRP-1路径的拮抗剂可以用于治疗人IBD。
CRP1或B7RP1的拮抗剂可以作为免疫抑制剂用于骨髓和器官移植，并可以用于延长移植物的存活。这类拮抗剂可以对现有治疗提供明显的好处。骨髓和器官移植治疗必须与T细胞介导的宿主对外源细胞或组织的排斥进行抗争。目前用于抑制T细胞介导的排斥的治疗方案涉及用药物环孢菌素或FK506进行治疗。虽然药物是有效的，但患者会出现严重的副作用，包括肝细胞毒性、肾毒性和神经毒性。环孢菌素/FK506类治疗剂的目标是钙调磷酸酶，这是一种具有遍在表达的磷酸酶。由于CRP1表达限制为T细胞，因此CRP1或B7RP1的抑制剂可以没有使用现有的免疫治疗剂时所观察到的严重的副作用。
CRP1或B7RP1的拮抗剂可以作为免疫抑制剂用于自身免疫疾病，诸如类风湿性关节炎、牛皮癣、多发性硬化、糖尿病和系统性红斑狼疮。
CRP1/B7RP1介导的共同刺激路径的拮抗剂也可以用于减轻中毒性休克综合征、炎性肠疾病、因输血引起的同种致敏、T细胞依赖性B细胞介导的疾病、和移植物抗宿主疾病的治疗。
抗体、包含例如胞外域的可溶性蛋白质、和导致T细胞活化延长或增加的CRP1或B7RP1的其他调节物可以用于增加对肿瘤的免疫应答。实施例20显示B7RP-1-Fc可抑制小鼠体内肿瘤细胞的生长。类似地，人B7RP-1-Fc或B7RP-1/CRP-1路径的其他激活物可以用于增强对抗人肿瘤的免疫应答。一般认为抗肿瘤活性具有强细胞溶解性T淋巴细胞组分。事实上，B7-Fc融合蛋白的抗肿瘤作用(Sturmhoefel等，Cancer Res.(癌症研究)594964-4972，1999)是由细胞溶解性CD8+T细胞介导的。既然CRP-1也在细胞溶解性CD8+T细胞上表达(实施例9)，在实施例20中证明的抗肿瘤作用就很可能是由于CD8+细胞上B7RP-1-Fc的作用。B7RP-1/CRP-1路径也可以用于调节许多其他临床环境包括同种移植物移植、移植物抗宿主疾病和自身免疫疾病中的CTL反应。
使用本发明的B7RP1基因进行的基因治疗可以用于癌症的免疫治疗。引入到癌细胞中的B7RP1基因可以将它们转化到抗原呈递细胞中，当其被引回到动物体内后可以被免疫细胞的T细胞识别。T细胞对转染肿瘤细胞的识别导致表达或不表达B7RP1基因的两种肿瘤细胞被根除。这种免疫治疗方法可以用于各种白血病、肉瘤、黑瘤、腺癌、乳癌、前列腺肿瘤、肺癌、结肠癌和其他肿瘤。本发明包括以类似方式使用B7RP1基因来增强响应各种肿瘤的T细胞活化。
如实施例14所述，表达B7RP1的转基因小鼠的表型指示B7RP1在抗体生成的控制中是重要的。B7RP1蛋白质活性的激动剂和拮抗剂可以用于治疗要求抑制或增强抗体的产生的适应症。
例如，许多疫苗通过引起有效而特异性的抗体反应起作用。有些疫苗，尤其是针对肠微生物(例如甲型肝炎病毒和沙门氏菌)的那些，可引起短暂的抗体反应。人们希望加强和延长这种反应以提高疫苗的有效性。因此，可溶性B7RP1或CRP1的活化抗体可以用作疫苗佐剂。
抗病毒反应也可以通过B7RP-1/CRP-1路径的激活物或激动剂得到增强。实施例20中的数据显示B7RP-1-Fc增强了细胞免疫。B7RP-1-Fc或B7RP-1/CRP-1路径的其他激活物对细胞免疫功能的增强也有助于清除病毒感染细胞。以互补方式，B7RP-1-Fc对体液免疫功能具有影响，如实施例13中的观测，这可以增强抗体介导的反应，该反应可帮助从体内清除游离病毒。
相反，有许多临床疾病，通过抑制抗体的产生就可得到改善。过敏症是一种夸大或不适当的正常有益的免疫反应，它导致炎症反应和组织破坏。抗体介导的过敏反应可能对B7RP1活性抑制剂的拮抗作用特别敏感。变应性、枯草热、哮喘和急性水肿引起I型过敏反应，这些反应可以被B7RP1活性的蛋白质、抗体或小分子抑制剂抑制。
引起抗体介导的过敏反应的疾病，包括系统性红斑狼疮，关节炎(类风湿性关节炎、反应性关节炎、牛皮癣性关节炎)，肾病(肾小球性肾炎、膜性的、肾小球系膜毛细血管的、局灶性节段性的、局灶性坏死性的、新月形的、增生性管病)，皮肤疾病(天疱疮和类天疱疮、结节性红斑)，内分泌病(甲状腺炎-突眼性甲状腺肿、慢性甲状腺炎、胰岛素依赖型糖尿病)，各种肺病(尤其是外因性小泡炎)，各种血管病，腹腔疾病，伴有异常IgA生成，许多贫血症和血小板减少症，格-巴二氏综合征，和重症肌无力，都可用B7RP1拮抗剂进行治疗。
此外，淋巴增殖性疾病，诸如多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症和冷球蛋白血症，可以用B7RP1的蛋白质、抗体或小分子拮抗剂抑制。
最后，移植物抗宿主疾病-一种“人造”免疫疾病，可以受益于B7RP1拮抗剂对抗体生成的抑制。
提供下列实施例是为了更全面地阐述本发明，但不认为是对本发明范围的限制。
实施例1CRP1 cDNA和氨基酸序列将雌性C57/Black 6小鼠处死，切下小肠，并除去淋巴集结。将该小肠组织切开并洗涤，以除去粘液和其他碎屑。含有肠上皮内细胞(iIELs)的上皮层通过在添加有1mM二硫苏糖醇(DTT)的RPMI-1640中在37℃下轻微搅拌20分钟而释放。将分离细胞通过100μ滤器，用50mlRPMI-1640洗涤，混合到另外的细胞破碎凝块中，然后通过40μ过滤器得到单细胞群。这些细胞然后再次用50ml体积的RPMI-1640洗涤，以确保除去残余的DTT。该组织然后如前所述搅拌和洗涤，使剩余的iIEL聚集。从脂肪细胞分离出iIEL，大多数上皮细胞在3步Percol梯度，伴有在40％至80％界面的iIEL带。这些细胞然后用RPMI-1640洗涤两次，以去除微量的Percol，用CD103(整联蛋白αIEL)抗体进行免疫染色，并在FACs Star细胞分选仪上进行分离。这些分选后的细胞然后可用于使用Trizol(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)直接制备总RNA，或者在平板结合活性抗体上活化过夜，其与γ/δTCR、α/βTCR或CD3交联。如上所述制备RNA并汇集后用于构建EST cDNA文库。
cDNA克隆，称之为smil2-00082-al，含有与CD28同源的核苷酸序列(图1B)。序列的翻译和随后与公共资料库中已知蛋白质的对比显示与鼠CD28有19％氨基酸相同(图1B)。这种低同源性是重要的，因为鼠CD28与鼠CTLA-4仅有26％氨基酸相同。所有被认为对于CD28/CTLA-4族中的分子内和分子间半胱氨酸键合来说是决定性的推定半胱氨酸都发现被保存下来(氨基酸残基83、109和137；相对于起始甲硫氨酸)。此外，推定可读框的整个长度以及跨膜域的相对位置都与CD28和CTLA-4的类似。我们把基因CRP1称之为CD28相关蛋白质-1。
实施例2人CRP1 cDNA的克隆编码人CRP1蛋白质的核酸序列通过以下方法加以鉴别。从来自正常人类志愿者的外周人血的富集淋巴细胞制备人cDNA文库。将淋巴细胞纯化，红细胞通过淋巴细胞分离培养基(ICN Pharmaceuticals，Inc.，Costa Mesa，CA)除去。这些细胞然后在含有10ng/ml PMA、500ng/ml离子霉素和CD3的平板结合活化抗体的培养基中活化过夜。利用Trizol法(Gibco/BRL)从活化细胞制备总RNA并通过Dynal珠纯化分离聚腺苷酸化RNA。从分离的聚腺苷酸化RNA制备cDNA并按大小挑选出最大的cDNA片段。然后将该大小经过选择的cDNA连接到质粒pSPORT(Gibco/BRL)中。通过筛选该活化淋巴细胞cDNA文库利用重组噬菌体噬斑或转化细菌集落杂交方案得到编码人CRP1蛋白质的DNA(Sambrook等，同上)。该噬菌体或质粒cDNA文库使用从如实施例1和图1中描述的鼠CRP1基因克隆得到的放射性标记探针加以筛选。这些探针用于筛选从平板文库提升的尼龙过滤器。这些过滤器在42℃下在50％甲酰胺、5X SSPE、2X Denhardt溶液、0.5％SDS和100μg/ml鲑精DNA中预杂交4小时，然后在42℃下在50％甲酰胺、5X SSPE、2XDenhardt溶液、0.5％SDS、100μg/ml鲑精DNA和5ng/ml mB7RPl探针中杂交24小时。印迹在室温下用2X SSC、0.1％SDS洗涤10分钟，在50℃下用1X SSC、0.1％SDS洗涤10分钟，在50℃下用0.2X SSC、0.1％SDS洗涤10分钟，然后在50℃下用0.2X SSC再次洗涤10分钟。如实施例1中所述对从任何人CRP1克隆得到的插入片段进行测序和分析。
实施例3B7RP1 DNA和氨基酸序列cDNA克隆，称之为smill-00003-g5，含有与B7.1(CD80)和B7.2(CD86)同源的核苷酸序列。序列(图2A)的翻译和随后与公共资料库中已知蛋白质的对比显示与鼠B7.1有20％氨基酸相同(图2B)。这种低同源性是重要的，因为鼠B7.1与鼠B7.2仅有24％氨基酸相同。尽管同源性这样低，决定性的半胱氨酸残基仍被保存在该克隆和鼠B7.1和B7.2的可读框之间，位于残基62、138、185和242(相对于起始甲硫氨酸，图2B)。与B7.1和B7.2相比，在该克隆的推定ORF中，近似成熟蛋白质长度和跨膜区相对于羧基端的位置也类似。我们把基因B7RP1称之为B7相关蛋白质-1。
实施例4人B7RP1 cDNA的克隆利用Genbank胚细胞同源性调查(GCG，威斯康星大学)使用鼠B7RP1序列(参见图2)来挽回含有带有1679bp ORF的4358bp序列的克隆(AB014553)。按照此序列来设计PCR克隆引物。使用HumanLymph Node Marathon-ReadyTMcDNA(Clontech，Palo Alto，CA)按照制造商建议的步骤通过5′和3′RACE得到1313bp的DNA片段。
用于全长人B7RP1的引物2083-75 ACC ATG CGG CTG GGC AGT CCT GGA(SEQ ID NO25)
2083-76 TGG TGA CCT ACC ACA TCC CAC AG(SEQ ID NO26)2083-77 TCC GAT GTC ATT TCC TGT CTG GC(SEQ ID NO27)2083-78 GCT CTG TCT CCG GAC TCA CAG CCC(SEQ ID NO28)2113-29 GTG GCA GCA AAC TTC AGC GTG CCC GTC G(SEQ ID NO29)2113-30 CCC AAC GTG TAC TGG ATC AAT AAG ACG G(SEQ ID NO30)2113-31 GCG TGC TGA GGA TCG CAC GGA CCC CCA G(SEQ ID NO31)引物2083-75和2083-76用于使用RACE方案扩增基因的5′端。引物2083-77、2083-78、2113-29、2113-30和2113-31用于使用RACE方案扩增基因的3′端。
所得核苷酸序列含有开始于甲硫氨酸的288个氨基酸残基的ORF。预测的成熟人B7RP1氨基酸序列然后与成熟小鼠B7RP1氨基酸序列进行对比(图3B)，发现有48％氨基酸相同。这种同源性是重要的，因为各物种之间关于CD80(B7.1)基因的同源性较低，事实上，小鼠和人CD80只有41％氨基酸相同。重要的是，人B7RP1蛋白质保存了Ig环结构所需要的决定性半胱氨酸残基(氨基酸残基16、92、138、194和195，相对于成熟蛋白质，图3B)。此外，跨膜域的整个长度和位置与人B7RP1同系物一致。
实施例5B7RP1 RNA的表达使用针对B7RP1基因的RNA探针进行RNA原位杂交。成年小鼠组织用4％多聚甲醛固定，用石蜡包埋，并以5μm切片。在原位杂交之前，组织用0.2M HCL预先透化，接着用蛋白酶K消化，并用三乙醇胺和乙酸酐进行乙酰化。切片在55℃下与和小鼠B7RP1序列的核苷酸1-969相对应的969个碱基的33P标记的核糖探针杂交过夜。过量探针通过核糖核酸酶消化除去，接着用盐浓度逐渐下降的缓冲剂进行一系列洗涤，然后在55℃下用0.1X SSC进行高严格洗涤。将载物片浸入Kodak NTB2乳剂中，在4℃下接触2-3周，发育，并用苏木精和曙红复染色。切片用暗视野和透射光照明进行检验，以允许同时对组织形态学和杂交信号进行评估。
通过原位杂交对B7RP1 RNA的分析显示，B7RP1 RNA在淋巴组织成熟和淋巴细胞活化的区域内是高度表达的。B7RP1 RNA表达于胸腺、肠的淋巴集结、脾和淋巴结的淋巴组织中。在这些淋巴组织中的表达证明，B7RP1 RNA一般表达于B细胞和其他APC牵连范围内。这些区域包括胸腺的髓质区、淋巴结的初级滤泡、和淋巴集结的滤泡和圆顶区。B7RP1 RNA的表达对淋巴组织中的APC牵连区域是高度特异性的。
对若干非淋巴组织的分析也显示了B7RP1在APC牵连区域内的表达。在肺中，B7RP1表达发现于粘膜下层范围内，与在抗原加工中的功能一致。在小肠中，B7RP1 RNA发现于粘膜固有层。特别是，我们发现了一段受损的肝，这表明了与B7RP1 RNA的表达重叠的淋巴细胞浸润。B7RP1表达与为响应组织破坏而发生的淋巴细胞积聚的这种同时发生有力地显示了B7RP1与淋巴细胞活化有关。
实施例6CRP1 RNA的表达使用针对CRP1基因的RNA探针进行RNA原位杂交。如实施例5中所述制备小鼠组织。如实施例5中所述进行组织预透化、探针杂交、载物片处理和组织染色。切片在55℃下与和小鼠CRP1序列的核苷酸1-603相对应的603个碱基的33P标记的核糖探针杂交过夜。切片用暗视野和透射光照明进行检验，以允许同时对组织形态学和杂交信号进行评估。
将来自正常小鼠或用噁唑酮处理过的小鼠的淋巴结切片并用于分析CRP1 RNA表达。致敏小鼠淋巴结与正常小鼠淋巴结相比显示出更大的CRP1 RNA的表达。CRP1的表达是在副皮质中，这是T细胞活跃区域。因此，CRP1 RNA的表达与T淋巴细胞的表达一致，并随着T细胞活化上调。
实施例7CRP1-Fc和B7RP1-Fc融合蛋白的表达和纯化为了构建用于CRP1-Fc融合蛋白的DNA表达载体，将CRP1的第一氨基端147个氨基酸的编码序列与人Fc基因(同种型IgG1)的羧基端235个氨基酸的编码序列符合读框地融合并连接在pcDNA3的多接头序列中(pcDNA3/CRP1-Fc)。为了构建用于B7RP1-Fc融合蛋白的DNA表达载体，将B7RP1的第一氨基端269个氨基酸的编码序列与人Fc基因(同种型IgG1)的羧基端235个氨基酸的编码序列符合读框地融合并连接在pcDNA3的多接头序列中(pcDNA3/B7RP1-Fc)。CRP1和B7RP1的编码序列含有来自每个蛋白质N端的序列直至但不包括每个蛋白质的推定跨膜区。293T细胞利用FuGene 6转染试剂(Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)用pcDNA3/CRP1-Fc或pcDNA3/B7RP1-Fc转染。4天后，收集条件培养基，Fc融合蛋白通过分批色谱法使用A蛋白琼脂糖(Pharmacia)加以纯化。结合到层析柱上的Fc融合蛋白用3柱体积的免疫纯温和洗脱缓冲剂(Immunopure Gentle Elution Buffer)(Pierce)洗脱，然后针对150体积的20mM HEPES、100mM NaCl，pH7.5进行透析。透析蛋白质使用Macrosep离心浓缩液30kD MWCO(Pall Filtron)浓缩，并使用从每个蛋白质的氨基酸序列得到的消光系数来计算蛋白质的浓度。CRP1-Fc融合蛋白的表达显示在图4A中，B7CPR1-Fc融合蛋白的表达显示在图4B中。
实施例8作为受体-配体对的CRP1和B7RP1的鉴别为了确定新的蛋白质是否是与含有CD28、CTLA-4、B7.1和B7.2的那些相同的共同刺激路径的部分，我们采用了细胞表面展示测定。该测定使用ACAS(粘着细胞分析和分选)分析法来分析在细胞中表达的膜结合蛋白质是否与各种Fc融合蛋白相互作用。表达膜结合蛋白质的细胞(显示在图5的左侧)用Fc融合蛋白(显示在图的上部)温育。
将在带有10％FBS的DMEM培养基中生长的Cos-7细胞以500,000细胞/孔的浓度铺在24孔平板中。细胞使用FuGene 6试剂(RocheMolecular Biochemicals，Indianapolis，IN)进行转染。对于每个转染来说，将3μl FuGene 6试剂加入到47μl无血清的DMEM培养基中。在室温下温育10分钟后，将该混合物滴加到0.25μg质粒中，然后温育15分钟。上述混合物再加入到伴有含10％FBS的0.5ml DMEM的细胞中。这些细胞在37℃下在5％CO2气氛中温育。作为对照，将用含有用于人CD28的cDNA的表达质粒稳定转染的CHOD细胞也以500,000细胞/孔的浓度铺在24孔平板中。
48小时后，除去带有转染试剂的培养基，细胞用加有5％FBS的RPMI洗涤两次。将10-20ng存在于1ml培养基中的纯化Fc融合蛋白加入细胞中，其在冰上温育30分钟。细胞用加有5％FBS的RPMI洗涤三次，然后用2μl FITC缀合抗人Fc抗体(1mg/ml)再在冰上温育30分钟。用RPMI连续洗涤三次后，细胞用不含酚红的250μl RPMI培养基覆盖以用于ACAS分析。
对与不同Fc融合蛋白结合的细胞的ACAS分析证明B7RP1蛋白质结合CRP1，而不结合已知共同刺激路径中的蛋白质CD28或CTLA-4。相反，CRP1与B7RP1相互作用，但不与已知路径中的组分B7.2作用(参见图5)。这些结果有力地显示CRP1和B7RP1代表了一个新的受体-配体对，类似于CD28和B7.2。不过，由于CRP1和B7RP1不与B7.2、CTLA-4或CD28相互作用，所以它们是单独的并独立于已知的共同刺激路径。
实施例9表达B7RP1受体的细胞的鉴别利用B7RP1-Fc融合蛋白通过FACS分析来检测表达B7RP1受体并推测包括CRP1蛋白质的细胞(参见实施例6)。从雌性C57/Black 6小鼠体内取出脾，在100微米筛网过滤器上研磨以释放出淋巴细胞，通过70微米滤器，然后用50ml RPMI-1640洗涤。将它们以1500rpm颗粒化，再悬浮于新鲜的RPMI中，混合以便破碎凝集细胞，并通过40微米滤器。将要活化的T细胞种植到含有RPMI-1640、5％FBS、1X PSG、PMA、离子霉素的6孔平板中，并在37℃、5％CO2下温育过夜。12小时后通过目测观察来检查T细胞的活化情况。
用于免疫染色的活化脾细胞用PBS、0.5％BSA(Path-ocyte 4，ICNPharmaceuticals)洗涤缓冲剂洗涤，再悬浮，然后等分为100μl体积。酌情加入15μg/ml CRP1-Fc融合蛋白或B7RP1-Fc融合蛋白(1.5μg/样品)，然后该混合物在冰上温育30分钟，同时偶尔混合一下。这些细胞用5.0ml洗涤缓冲剂洗涤两次。融合蛋白的结合用用于细胞染色的100μl体积的2μg山羊抗人(GaHuFc-FITC)缀合次级抗体显现。向与PE缀合的细胞标记抗体中加入GaHUFc-FITC，并用对照同种型-PE缀合抗体进行对照显示(大鼠同种型)。样品如前所述在冰上温育并洗涤。通过FACScan分析进行显示，并控制在淋巴细胞群上。用CD4+抗体和B7RP1-Fc融合蛋白进行二重染色，结果显示细胞既表达了CD4标记也表达了B7RP1受体，推测为CRP1(图6)。与此类似，用CD8+抗体和B7RP1-Fc融合蛋白的二重染色证明，细胞既表达了CD8也表达了B7RP1受体(图6)。我们没能在灭活脾细胞制剂中可靠地检测这种二重染色细胞。既然CD4和CD8是T淋巴细胞标记，我们就可假定CRP1在活化CD4+和CD8+T细胞上表达。这些数据与来自致敏小鼠淋巴结的T细胞区域中CRP1 RNA的表达与正常小鼠相比增加这一结果一致(实施例6)。
实施例10表达CRP1配体的细胞的鉴别利用CRP1-Fc融合蛋白通过FACS分析(图7)来检测表达CRP1配体并推测包括B7RP1蛋白质的细胞(参见实施例8)。如实施例8中制备脾细胞，只是省略12小时的T细胞活化步骤，细胞直接进行分析。脾细胞用CD45R(B220)标记抗体和CRP1-Fc融合蛋白进行二重染色。检测细胞表达CD45R B细胞标记和推定CRP1配体(推测包括B7RP1(实施例8))的情况。因此，我们得出结论B7RP1在一种类型的抗原呈递细胞B细胞上表达。这些数据与B7RP1 RNA在各种淋巴组织的B细胞区域中的表达(实施例5)一致。
B7RP1在腹膜巨噬细胞上的表达的FACS分析(图8)。通过局部灌洗从正常小鼠采集腹膜细胞并洗涤后用CRP1-Fc融合蛋白或Fc蛋白质对照物温育，或者用F4/80单克隆抗体(它检测对巨噬细胞特异性的抗原)或不相关的同种型-匹配对照单克隆抗体温育。然后细胞再次洗涤并用山羊抗人Fc-FITC缀合抗体温育。再次洗涤后，细胞在FACS分析器中评定它们的光散射和荧光染色性能。腹膜细胞首先在它们的光散射性能的基础上区分为亚群(图8A)。巨噬细胞由于它们强大的向前(FSC)和向侧面(SSC)散射光的能力以及由于它们对巨噬细胞的标记-F4/80抗原的阳性染色而在5区(R5)中鉴别出来(图8B)。6区(R6)中的巨噬细胞在它们对F4/80抗原染色强度小并且发现能被CRP1-Fc融合蛋白染色的基础上挑选出来(图8C)。这些数据显示CRP1配体(有可能包括B7RP1)在专门的抗原呈递细胞-巨噬细胞上表达。这与CRP1和B7RP1在T淋巴细胞活化中的功能一致。
实施例11B7RP1-Fc融合蛋白对ConA刺激T淋巴细胞的体外抑制活性如实施例8中制备小鼠脾细胞并通过负选择富集T淋巴细胞(R andD Systems，Inc.，Minneapolis，MN))。200,000个脾细胞用于在96孔圆底平板中的T细胞增殖测定。细胞用培养基(没有添加物)、如图9中所示的融合蛋白CRP1-Fc、B7RP1-Fc或B7.2-Fc温育1小时。培养基(没有添加物)或Con A以不同浓度加入，如图9的下部所示。然后细胞在37℃和5％CO2下温育。42小时后，细胞用3H-胸苷脉冲6小时，收获并掺入预定的放射性。图9中表示了来自一式三份样品的平均CPM和标准偏差。
Fc融合蛋白本身没有示范明显的T细胞刺激或抑制活性，但是，在1μg/ml和3μg/ml Con A的存在下，B7RP1-Fc和已知的B7.2-Fc融合蛋白都显示了明显的抑制活性(图9)。在高浓度下(10μg/ml)，Con A刺激导致细胞死亡，推测是通过T细胞的过度激发。B7RP1-Fc或B7.2-Fc的加入有效地保护了细胞免受高浓度ConA的有害作用。在抑制和保护功能中，B7RP1-Fc蛋白质的作用大于B7.2-Fc蛋白质对ConA刺激细胞的作用。这些数据显示，B7RP1蛋白质有调节T细胞增殖的功能。
实施例12B7RP1-Fc融合蛋白在转基因小时体内的系统性释放实施例7中描述的B7RP1-Fc融合蛋白亚克隆到ApoE-肝特异性表达载体中(Simonet等，J.Clin.Invest.(临床研究杂志)94，1310-1319(1994)和PCT申请No.US94/11675)。编码区使用限制酶Spe I和Not I从pCEP4/B7RP1-Fc上切除，该片段亚克隆到前述ApoE-肝特异性表达载体中的相同部位。所得质粒HE-B7RP1-Fc通过其蛋白质编码区和攻击编码区侧面的序列测序，以确保它没有突变。
质粒扩增并通过两轮CsCl密度梯度离心纯化。纯化的质粒DNA用限制酶Cla I和Ase I消化，而1.5kb转基因插入物通过琼脂糖凝胶电泳纯化。该纯化片段用5mM Tris，pH7.4和0.2mM EDTA稀释成1μg/ml的储备注射溶液。来自BDF1 X BDF1-繁殖小鼠的单细胞胚胎基本上如(Brinster等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院报)82，4338(1985))所述进行注射，但注射针成斜角并在使用前硅化处理。胚胎在CO2培养箱中培养过夜，将15至20个2细胞胚胎转移到假孕CD1雌性小鼠的输卵管中。
经过定期妊娠后，从在微注射胚胎上的植入得到56个子代。子代通过基因组DNA样品中的整合转基因的PCR扩增加以筛选。用于扩增的目标区是包括在表达载体中的人Apo E内含子的369bp区。用于PCR扩增的寡核苷酸是5′-GCC TCT AGA AAG AGC TGG GAC-3′(SEQ ID NO32)5′-CGC CGT GTT CCA TTT ATG AGC-3′(SEQ ID NO33)用于PCR的条件是94℃下2分钟，1个循环；94℃下1分钟、63℃下20秒和72℃下30秒，30个循环。在56个原始子代中，有7个确定为PCR阳性转基因建立者小鼠。
在12周大时，将9个转基因建立者(1、2、4、6、8、30、32、33、40号小鼠)和5个对照(5、9、10、25、28号小鼠)处死，进行尸体剖检和病理学分析。总细胞RNA如(McDonald等，Meth.Enzymol.(酶学方法学)152，219(1987))所述从建立者小鼠和阴性对照同窝小鼠的肝脏中分离。对这些样品进行Northern印迹分析，以评定转基因表达的水平。将来自每只动物的大约10μg总RNA通过琼脂糖电泳变性凝胶分解(Ogden等，Meth.Enzymol.(酶学方法学)152，61(1987))，然后转移到HYBOND-N尼龙膜(Amersham)上，并用32P dCTP标记的mB7RP1-Fc插入物DNA进行探针探查。在63℃下在ExpressHyb溶液(Clonetech)和2-4×106CPM的标记探针/ml杂交缓冲剂中杂交1小时。杂交后，印迹用2X SSC，0.1％SDS在室温下洗涤两次，每次5分钟，然后用0.1X SSC，0.1％SDS在55℃下洗涤两次，每次15-20分钟。放射自显影法后确定转基因在建立者和对照同窝小鼠中的表达。
Northern印迹分析显示，有7个转基因建立者表达了可检测水平的转基因RNA(1、2、6、8、32、33和40号小鼠)。阴性对照小鼠和3个建立者(4、30和31号)没有表达可检测水平的RNA。既然B7RP1-Fc融合蛋白确定将要从培养物中的哺乳动物细胞分泌(图4B和实施例7)，则转基因mRNA的表达应该是系统性释放的基因产物水平的指示。
实施例13B7RP1-Fc融合蛋白的生物活性将7只转基因小鼠(1、2、6、8、32、33和40号小鼠)和5只对照同窝小鼠(5、9、10、25和28号小鼠)处死，使用下述操作进行尸体剖检和病理学分析安死术之前，检验所有动物的鉴定号，然后称重、麻醉和抽血。储存血清和全血样品，用于完全血清化学和血液学面板分析。放射照相术就在利用致死的CO2吸入最终麻醉之后和总解剖之前进行。然后将组织取出并用10％缓冲的Zn-福尔马林固定，以用于组织学检查。收集的组织包括肝、脾、胰腺、胃、十二指肠、回肠、淋巴集结、结肠、肾、生殖器官、皮肤、乳腺、骨、脑、心脏、肺、胸腺、气管、食管、甲状腺/甲状旁腺、空肠、盲肠、直肠、肾上腺、白和褐脂组织、坐骨神经、骨髓、膀胱、和骨胳肌肉。固定前，测定肝、心脏、胃、肾、肾上腺、脾和胸腺的器官总重。固定后，组织加工到石蜡块中，并得到3μm的切片。
对B淋巴细胞标记B220和T淋巴细胞标记CD3进行免疫组织化学分析。为了检测B220或CD3表达，进行福尔马林固定，石蜡包埋，将4μm切片去石蜡并水合到去离子水中。切片用3％过氧化氢淬火，用蛋白质组件(Lipshaw，Pittsburgh，PA)阻断，并在B220的大鼠单克隆抗体(Pharmingen，San Diego，CA)中温育，或者在CD3的兔多克隆抗体(Dako，Carpinteria，CA)中温育。这些抗体利用生物素化兔抗大鼠或山羊抗兔免疫球蛋白，带有DAB色原(Biotek，Santa Barbara，CA)的过氧化物酶缀合链霉抗生物素(BioGenex，San Ramon，CA)进行检测。切片用苏木精复染色。
在该研究中，在研究的生命期内报道了正常的临床征。转基因小鼠的整体放射照片比得上对照小鼠的照片。转基因小鼠的全体血液学参数比得上阴性对照小鼠的参数，尽管个别小鼠存在偶尔的变化转基因8号和40号小鼠的血清球蛋白浓度升高(血球蛋白过多)，32号和33号小鼠有在高正常范围内的球蛋白度并伴有在低正常范围内的白蛋白度，这是免疫系统的长期抗原刺激中常见的模式。其他转基因小鼠的器官重量与对照小鼠的没有明显差异。
转基因小鼠中存在下列组织病理学变化转基因B7RP1-Fc小鼠的肠系膜淋巴结与对照小鼠相比有中到重度的扩大(图10A-10D；图11A-11E)。皮质有明显的滤泡增生，看到扩大的次级滤泡(图10B-11B)并有主要含有B220+B细胞(图11D)和少量散在CD3+T细胞(图11F)的大生发中心。副皮质(CD3+T细胞)区也中度增大(图11B-11F)，髓窦有数量稍微增加的肉样巨噬细胞(窦性组织细胞增多病)。淋巴结中最显著的变化见于髓索，它在B7RP1-Fc转基因小鼠中通过大量完全分化的血浆细胞而轻度到重度膨胀(图10D)。在40号转基因小鼠中，在髓索中也发现了少量散在拉塞尔小体(即，含有免疫球蛋白的带有显著的、大的、圆的、胞质内囊泡的血浆细胞)(图10D)。有趣的是，其他内部和外周淋巴结(例如子宫颈的、腹股沟的)有暗示系统性应答的活性淋巴增生的类似形态学特征。这些发现与伴有体液免疫反应增强的长期、进行性免疫刺激一致，这导致B细胞增殖和最终分化到血浆细胞中。
与对照小鼠相比，B7RP1-Fc转基因小鼠的脾有不定扩大的白髓面积，伴有特别是与B细胞次级滤泡有关的中度反应性淋巴增生，有显著的生发中心和小动脉周T细胞鞘(图10E-10F)。在B7RP1-Fc转基因小鼠中的另一个显著发现是在围绕白髓面积的边缘区中和在相邻的红髓中有较小到轻度的浆细胞增多。6号转基因小鼠有少量散在的拉塞尔小体(图10F，插图)。红髓有轻度到中度的骨髓外血生成，这比得上在对照小鼠中看到的结果(图10E)。
B7RP1-Fc转基因小鼠的小肠淋巴集结与对照小鼠相比有中度到重度的增大(图10G)，并且有带有显著生发中心的非常大的滤泡，特别是在40号和32号转基因小鼠中(图10H)。此外，在变厚的粘膜固有层中的淋巴细胞和血浆细胞的数量有较小(32号小鼠)到轻度(8号和33号小鼠)的增加(在32号小鼠的回肠中混合有轻度嗜曙红细胞浸润)，这出现在小肠中，但更主要是在转基因小鼠的结肠中。与对照组相比，大肠淋巴样聚集物(GALT)也稍微更多地出现在一些B7RP1-Fc转基因小鼠中(特别是8号和2号小鼠)。
通常，所检查的其他组织，包括胸腺、骨髓、肝、肺、心脏、胰腺、肾、肾上腺、甲状腺、甲状旁腺、气管、生殖器官、膀胱、乳腺、皮肤、骨胳肌肉、外周神经、脑、食管、胃、小肠和大肠、骨(股骨/胫骨)、后膝关节、白和褐脂组织，看起来正常并比得上在对照小鼠中检测到的背景变化。
来自该研究的数据证明，转基因小鼠中的B7相关蛋白质Fc嵌合体(B7RP1-Fc)的过度表达导致了特征为在脾、外周和内部淋巴结以及肠伴随淋巴组织中检测到显著的反应性淋巴增生的表型，象滤泡增生、T细胞面积膨胀和在有些动物中伴发血球蛋白过多的显著浆细胞增多。浆细胞增多伴随有较高浓度的循环IgG(转基因小鼠均值±SD＝597±298mg/ml；对照同窝小鼠209±80mg/ml，n＝7，P＜0.05，t检验)，特别是IgG2a(217±100mg/ml比75±29mg/ml，n＝7，P＜0.01，t检验)。IgG2a的诱导通常与Th1细胞因子诸如IFN-g相联，因此，B7RP-1诱导B细胞和T细胞增殖，并刺激B细胞分化到血浆细胞中和产生免疫球蛋白。
这些变化与伴有在所检查的所有淋巴器官中导致B细胞刺激、增殖和分化到抗体生成血浆细胞中的免疫系统的体液臂过刺激的持续系统性免疫应答一致。
我们从在B7RP1-Fc转基因小鼠中显示的显著的淋巴增生得出结论B7RP1蛋白质具有与免疫系统刺激相关的显著体内生物活性。
实施例14人B7RP1的克隆使用淋巴细胞分离培养基(ICN Pharmaceuticals)从红细胞分离正常人循环外周淋巴细胞。然后T细胞在37℃和5％CO2下用10μg/ml平板结合抗CD3抗体(Immunotech，Westbrook，ME)、10ng/ml PMA和500ng/ml离子霉素活化过夜(16小时)。然后使用TRIzol试剂(Gibco BRL)从这些细胞制备总RNA。细胞通过离心颗粒化，每5×106个细胞的细胞颗粒再悬浮于1ml TRIzol试剂并在室温下温育5分钟。然后加入0.2ml氯仿每1ml原始TRIzol试剂。试管用手用力振摇15秒，在室温下温育3分钟，在4℃下以13,000rpm离心15分钟。离心后，收集含有RNA的澄清的上层水相，样品RNA通过加入异丙醇沉淀。然后该溶液在室温下温育10分钟，RNA颗粒化，用75％乙醇洗涤，然后在4℃下以15,000rpm离心5分钟。将颗粒空气干燥，再悬浮于没有核糖核酸酶的水中，然后等分，并在-80℃下储存直至后面的使用。
使用cDNA分析和质粒克隆用的SuperScript质粒系统(Gibco BRL)构建文库。简言之，将平均大小为2kb的cDNA插入物连接到pSport载体中的Sall/Noti克隆部位。将连接后的质粒电穿孔到Electromax转化感受态大肠杆菌(Gibco BRL)中，滴定并以每LB平板15,000克隆的浓度铺平板(氨苄青霉素100μg/ml)。将300,000克隆提升到集落/菌斑筛选杂交转移膜上(NEN Life Sciences)，在0.5N NaOH、1.5M NaCl中使其变性5分钟，然后用下列缓冲剂连续中和，每次5分钟1M Tris HCl pH8.0，0.5M Tris HCl pH8.0和1.5M NaCl和2X SSC。然后滤器通过紫外线照射交联，并在真空烤箱中在80℃下烤30分钟。滤器在42℃下用2X SSC充分预洗涤以除去碎屑，然后在42℃下在50％甲酰胺、5X SSPE、5XDenhard溶液、0.5％SDS、100μg/ml鲑精DNA中预杂交2小时。
人淋巴细胞cDNA文库用图3A中所示的具有核苷酸1-711的895bpDNA片段、图3A中的5’直接到起始甲硫氨酸密码子的167bps和图3A中的3′直接到711位的17bps加以筛选。该167个碱基对的上游5′序列通过HuB7RP1 cDNA的5′RACE得到(实施例4)并在Eco RI限制酶切位点从TOPO TA载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)释放。该插入物在0.8％琼脂糖TAE凝胶上纯化两次。DNA凝胶纯化试剂盒(Qiagen)用于从琼脂糖分离DNA插入物。
125ng DNA片段用32P dCTP(Amersham)标记，接着进行Redi-Prime2(Amersham)随机初期标记系统方案。然后使集落提升滤器在42℃下在以下缓冲剂中与探针杂交过夜50％甲酰胺、5X SSPE、2X Denhardt溶液、0.5％SDS、100mg/ml ssDNA。探针的特定活性为2.38×109cpm/μgDNA，以大约2ng标记探针每ml杂交缓冲剂的浓度。将探针除去并保存用于下一轮筛选。然后滤器在室温下用2X SSC、0.1％SDS洗涤15分钟，接着在55℃下用1X SSC、0.1％SDS洗涤15分钟，在60℃下用1X SSC、0.1％SDS洗涤10分钟。将滤器包裹在塑料中并在-80℃下接触自体放射照相术胶片过夜，有2个增强筛选。鉴别出三个独立的阳性克隆。照射与细菌平板对齐，将阳性克隆敲碎、稀释并重新铺在含有氨苄青霉素100μg/ml的LB平板上，如前所述生长过夜，如前所述将集落提升、制备和用探针探查。分离出三个独立的克隆集落，分离DNA，以一式三份测定每个克隆的DNA序列。
人B7RP1蛋白质的全长为302个氨基酸。跨膜域的多肽长度和相对位置与其他B7族成员一致。人B7RP1基因与小鼠克隆有43％氨基酸相同。这种同源性程度是显著的，因为小鼠和人CD80蛋白质只有41％相同。显著保存在小鼠和人基因之间的是在氨基酸37、113、158、215和216位的半胱氨酸残基。
实施例15人CRP1的克隆利用Genbank胚细胞同源性调查(GCG，威斯康星大学)使用鼠B7RP1序列(参见图2)来挽回含有显示出与鼠CRP1基因的高同源性的104bp序列的基因组克隆(Gen Bank Assession NO.AQ022676)。设计PCR克隆引物来重叠该序列。
5′-GCA FAT TTA TGA ATC CCA-3′(SEQ ID NO34)5′-ACT ATT AGG GTC ATG CAC-3′(SEQ ID NO35)使用上述引物，鼠CRP1的151bp DNA片段利用图1中描述的鼠CRP1质粒和实施例1模板进行PCR扩增。125ng DNA用32PdCTP(Amersham)标记后，实施Redi-Prime 2(Amersham)随机原始标记系统方案。然后让来自实施例15中描述的人外周血液文库的集落提升滤器在41℃下在下列杂交缓冲剂中与探针杂交过夜(15小时)50％甲酰胺、5X SSPE、2X Denhardt溶液、0.5％SDS、100μg/ml ssDNA。探针的特定活性为3.52X109cpm/μg DNA，1.5ng标记探针/ml杂交缓冲剂。将探针拔出并保存用于下一轮筛选。然后滤器在室温下用2X SSC、0.1％SDS洗涤10分钟，接着在37℃下用1X SSC、0.1％SDS洗涤7分钟，在40℃下洗涤7分钟，在44℃下洗涤7分钟，然后在50℃下洗涤7分钟，不断监测滤器释放标记探针的速率。将滤器用塑料包裹并在-80℃下接触胶片过夜，有2个增强筛选。该方法显示了9个可能的独立阳性克隆。照射与细菌平板对齐，将阳性克隆敲碎，沉积到200μl SOC中，进行2次1∶10连续稀释，将来自第二次稀释的70μl重新铺在含有氨苄青霉素100μg/ml的LB平板上并如前所述生长过夜。如前所述将集落提升、制备和用探针探查。分离出8个独立克隆并利用Qiagen小量制备法制备DNA。
得到含有199个氨基酸的可读框的cDNA克隆(图13A)。该cDNA克隆含有与实施例1和图1中描述的鼠CRP1克隆同源性的核苷酸和氨酸。与该人克隆的可读框相对应的核苷酸与鼠CRP1基因有77％相同。人序列的翻译和随后与鼠CRP1蛋白质的对比显示与鼠蛋白质有69％氨基酸相同(图13B)。此外，氨基酸114到119之间的基元“FDPPPF”被保存在鼠和人CRP1基因中。该基元与鼠和人CD28中对于B7蛋白质相互作用来说必要的“MYPPPY”基元相对应。此外，在氨基酸42、109和141位上的半胱氨酸也保存下来。这些半胱氨酸对应于CD28和CTLA-4中的半胱氨酸，它们与Ig环的形成和分子间二硫化物的二聚有关。与鼠CRP1的密切相似，以及与CD28同源性族的结构相似，都显示这是人CRP1同系物。
实施例16CRP-1在静息记忆T淋巴细胞上的表达为了研究CRP-1在记忆T细胞上的表达，从6-7月龄的小鼠采集脾T细胞。这些细胞使用通过FITC缀合抗人Fc抗体和CD44、CD45RB或CD69的PE缀合抗体标记的B7RP1-Fc复染色。用B7RP-1-Fc融合蛋白的染色检测CRP-1蛋白质在这些细胞上的表达。年老小鼠比年轻小鼠显示出更多的CRP-1+脾T细胞。有趣的是，有显著数量的这些细胞具有高CD44(图14a)和低CD45RB(图14b)，这是记忆T细胞的典型方式。这些CRP-1+记忆T细胞处于静息状态，因为它们没有表达活化标记CD69(图14c)。CRP-1在记忆T细胞上的表达显示CRP-1对记忆T细胞有共同刺激功能。
实施例17B7RP-1抗体对体外T细胞共同刺激的抑制为了确定B7RP-1蛋白质与T细胞是否在功能上有关联，我们在一个体外增殖测定中用B7RP-1-Fc融合蛋白和抗CD3抗体温育CD3+T细胞。然后使用兔抗小鼠B7RP1单克隆抗体或大鼠抗小鼠B7RP1单克隆抗体来特异性抑制体外B7RP1-Fc共同刺激增殖。
B7RP-1兔多克隆抗血清制备给三只新西兰白兔(5-81bs.初始重量)肌内注射鼠B7RP1蛋白质。每只白兔在第1天用在等体积Hunters Titer Max完全佐剂中乳化的150μg鼠B7RP1蛋白质免疫接种。用相同操作进行进一步的加强(第14和28天)。通过EIA监测抗体效价。第二次加强后，抗血清显示中等抗体效价。然后从每只动物获得30ml生产血液。每周重复此操作，持续6周。多克隆抗体然后用A蛋白琼脂糖色谱法纯化，接着进行负选择Fc蛋白质亲和色谱法和利用B7RP-1-Fc亲和色谱法正选择。
大鼠抗鼠B7RP1单克隆抗体制备如Practical Immunology(实用免疫学)第二版(1980；L.Hudson和F.C.Hay；Blackwell Scientific Publications；St.Louis，MO)中所述产生大鼠抗鼠B7RP1单克隆抗体。简言之，以4周的间隔给Lou大鼠(Harlan；Indianapolis，IN)腹膜内注射在弗氏佐剂中乳化的muB7RP1-Fc融合蛋白。融合前3天，大鼠用可溶性muB7RP1静脉注射进行加强。在融合的当天，将动物在二氧化碳下处死并无菌操作取出脾。使用组织细菌分离器生产单细胞悬液。脾细胞和Y3-Ag1.2.3骨髓瘤细胞(美国典型培养物保藏中心；Rockville，MD)均用无血清培养基洗涤，然后通过加入聚乙二醇(PEG 1500；Boehringer Mannheim Biochemicals；Indianapolis，IN)进行融合。细胞用清水冲洗一次，再悬浮于含有血清的培养基中，并铺到96孔组织培养板中。10到12天后，通过直接酶联免疫吸附测定(EIA)测试每个孔中培养基的B7RP1的特异性抗体。将来自各孔的显示潜在结合的细胞种植到10ml培养物中并在液氮中冷冻。来自各培养物的培养基进一步在流式细胞计量计中和功能T细胞增殖测定中进行检验。将通过这些方法确定为可能有价值的那些铺成单细胞集落，再次利用EIA进行选择，并维持最后的细胞系用于产生抗体。抗体通过A蛋白琼脂糖色谱法从细胞培养基中纯化。
T细胞制备和T细胞增殖测定来自C57B1/6小鼠(8-12周龄，雌性，Charles River Laboratories)脾脏的T细胞通过鼠T细胞富集柱(R&D Systems)利用负选择加以纯化。然后这些T细胞或者直接使用，或者如下所述利用抗体和补体裂解进一步纯化。将细胞再悬浮于(2.5×106细胞/ml)含有针对鼠CD11b(克隆M1/70)、NK-1.1(克隆PK136)、CD8a(克隆53-6.7)、I-Ab(克隆M5/114.15.2)、CD11c(克隆HL3)和B220抗原(克隆RA3-6B2)的抗体(所有抗体都是10μg/ml并购自Pharmingen)的RPMI培养基中。然后这些细胞在冰上孵化30分钟，在1200rpm下颗粒化，再悬浮于4∶1体积/体积的RPMI兔补体(Sigma，#S-7764)中并在37℃下再孵化30分钟。再次将细胞颗粒化，并重复补体处理。铺平板之前，细胞用含有10％FCS的RPMI洗涤。U形底96孔平板用抗CD3抗体(克隆145-2C11，Pharmingen，以O至1.2μg/ml范围之间的浓度)和抗人IgG Fab2(Sigma，12.5μg/ml)在4℃下包被过夜，接着在37℃下温育6-9小时。T细胞(1×105/孔)在没有或有各种Fc融合蛋白的条件下培养48小时，并在最后的18小时中用1μCi3H-胸苷进行脉冲。对照Fc蛋白质包括OPG和Fc的融合蛋白和非融合Fc蛋白片段。然后收获细胞并对掺入的放射性计数。B7RP-1-Fc以剂量依赖方式共同刺激T细胞增殖(图15a)，而抗B7RP-1-Fc抗体剂量依赖性地特异性抑制这种共同刺激(图15b)。
实施例18CRP-1/B7RP-1路径的抑制剂减少了胶原诱导的类风湿性关节炎的发作胶原诱导的关节炎(CIA)是一种与人类的类风湿性关节炎有许多类似之处的啮齿动物和灵长目动物的自身免疫性多动脉炎的动物模型。免疫接种异种II型胶原(CII)诱导导致CIA在易感小鼠品系中发育的对CII的自身免疫反应。带有H-2r和H-2q的小鼠的同类品系对CIA是高度敏感的。CIA由CII反应性T细胞和抗体的协同作用介导。将猪CII(Nabozny等《自身免疫》20，51-58(1995))以2mg/ml的浓度溶于0.01N乙酸，然后以1∶1的比例用CFA(Difco)乳化。关节炎易感性B10.RIII(H-2r)小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)在鼠尾底部皮内注射100μl溶液加以免疫。每周对小鼠的关节炎发展情况监测2-3次。关节炎严重度如下所述使用对每只鼠爪的分级系统来确定0没有关节炎；11-3个足趾发红或肿胀；2爪子严重肿胀；3关节僵硬。将每个肢体的得分加以总结，得到每只动物的从0至12范围的严重度。
小鼠用100μg(200μl)蛋白质腹膜内注射，每周两次。用猪CII免疫接种1天后开始进行治疗，免疫接种后第52天停止治疗。实验用每10只小鼠组成的治疗组进行，得分为1或1以上的动物记为阳性。结果显示于图16和表1。
表1CRP-1、B7RP-1、CTLA-4和B7.2 Fc融合蛋白对关节炎发作的作用治疗组 均值+/-标准偏差，发作的天数CTLA4-Fc60.0±0.0CRP1-Fc 48.9±13.2B7.2-Fc 28.4+14.1B7RP1-Fc33.9+16.6PBS 37.7+17.1在用CRP1-Fc融合蛋白治疗的小鼠中，关节炎症状的发作与PBS治疗小鼠相比延迟了大约10天。这证明CRP-1/B7RP-1路径的抑制可以减轻这种类风湿性关节炎小鼠模型的疾病症状。
用B7RP-1-Fc或B7.2-Fc治疗的小鼠与PBS治疗的对照小鼠相比显示出更快的疾病发作(表1和图16a)并伴有关节炎严重度升高(图16b)。这指示B7RP-1-Fc融合蛋白增强了T细胞免疫应答。这种活性可以用于在体内产生抗肿瘤免疫性。
CRP-1-Fc和B7RP-1-Fc在这种类风湿性关节炎的小鼠模型中的相反作用表明可以操作该路径来增强或抑制疾病进程。用可溶性B7RP-1-Fc对CRP1蛋白质定向增强了疾病，而可溶性CRP-1-Fc与B7RP-1的相互作用抑制了疾病症状。
实施例19B7RP-1-Fc诱导转基因小鼠的炎性肠病表型B7相关蛋白质(B7RP1-Fc)在22-25周龄转基因小鼠体内的持续过度表达(实施例12)诱导了醒目的炎性肠病(IBD)的表型，伴有小肠和大肠的明显增厚和慢性炎症(小肠结肠炎)以及有些动物的体重减轻。从组织学上看，最严重的炎症变化发现于近侧和远侧结肠，且小肠有较轻微的变化。近侧结肠显著增厚，伴有裂隙溃疡、透壁炎症和结肠粘膜肥大，而远侧结肠有弥漫性粘膜肥大(或局灶性糜烂和腺萎缩)，没有溃疡。近侧小肠有轻度到显著的粘膜肥大，并伴有较轻微的炎性变化，而远侧小肠(回肠)在有些动物体内有轻度粘膜肥大，在其他小鼠体内有萎缩。肠的变化是最严重的，在雌性B7RP-1转基因小鼠中发现的结果与此一致，但在该研究中在若干雄性转基因小鼠中也观察到了这样的结果。
有趣的是我们注意到在近侧结肠中发现的组织学特性包括裂隙溃疡和伴有多核巨细胞的透壁慢性肉芽肿性炎症更近似于在人的节段性回肠炎中而不是溃疡性结膜炎中看到的那些。从形态学上看，这种结肠炎也摹拟了在缺乏白介素-10的小鼠中描述的IBD，这导致消瘦、贫血和影响它们的整个肠道的小肠结肠炎(Kuhn等，1993年；Sartor 1995；Leach等，1999年)。正如在IL-10分离小鼠中一样，B7RP-1-Fc转基因小鼠中的最初变化由不伴有结肠上皮增生的炎性细胞在粘膜固有层中的轻度、局灶性浸润组成(实施例13)。在年老小鼠中，受影响的结肠节段因腺肥大/增生和慢性炎症而变厚。B7RP-1-Fc小鼠的近侧和远侧结肠有中度到重度的结肠炎，伴有炎性肠病(IBD)的组织学特性。近侧结肠的受影响的节段(图17B-17D)弥漫变厚，这是由于伴有粘膜腺伸长和扩张的显著的腺上皮肥大和增生引起的(图17B)，它具有数量增加的有丝分裂像和罕见的隐窝脓肿，但保留了有粘蛋白的杯状细胞(图17D)。粘膜固有层中有弥漫性慢性炎症，这在有些动物体内透壁延伸到累及肠壁的下层，包括粘膜下层、肌层、浆膜和相邻肠系膜脂组织(图17B-17C)。炎性浸润由淋巴细胞(主要是CD3+、CD44+T细胞)、浆细胞和混合有一些嗜中性白细胞和偶然多核巨细胞(图17E)的上皮样巨噬细胞(图17F)组成，这是慢性肉芽肿性炎症的特征。粘膜中也存在淋巴样聚集物(大多数是B220+细胞，混合有少量CD3+细胞)，并且包围了粘膜下层和更深的层包括肠系膜脂肪中的较小血管(图17C)。腔中含有粘液脓性或粘液性渗出物(图17D)。在这些B7RP-1-Fc转基因小鼠中发现了结肠炎的严重迹象，有粘膜的多灶性裂隙溃疡和透壁炎症(图17B-17C)。
B7RP-1-Fc转基因小鼠的远侧结肠也弥漫性变厚和增生，伴有结肠腺伸长、嗜硷细胞增多和扩张(图18B-18G)，它们中有些含有隐窝脓肿(图18D和18F)和粘液。固有层有淋巴细胞的轻度弥漫性炎性浸润(主要是CD3+、CD44+细胞，特别是在浅层粘膜中；图18E)，以及浆细胞和混合有一些嗜中性白细胞的上皮样巨噬细胞的局灶性聚集物。淋巴样聚集物(主要是B220+细胞；图18D和18F)也分散在整个粘膜中。B7RP-1-Fc转基因小鼠的小肠有更多的不定变化，包括伴有固有层中主要是淋巴浆细胞浸润的轻度到局部显著的粘膜和隐窝肥大和增生(图19B和19D有范围从1∶4到1.5∶1的隐窝/绒毛比值，与对照小鼠的1∶10对比)。粘膜增生在近侧小肠包括十二指肠(图19B)、特别是空肠(图19D)中最显著。在大多数严重受影响的小鼠体内隐窝结构是局部混乱和发育异常的(图19D)。比较起来，一些小鼠的远侧小肠(回肠)有回肠粘膜的轻度、空隙性绒毛状萎缩(图19F)，并伴有绒毛的钝化、增厚或局部损失(隐窝∶绒毛比为1∶1或更小，代替了正常的比值1∶2)，而其他小鼠有轻度回肠粘膜肥大。
B7RP-1-Fc融合蛋白发挥作用，激活了对引起与人类节段性回肠炎非常类似的表型起作用的细胞。这显示可能是引起节段性回肠炎中炎症的原因的细胞被B7RP-1-Fc融合蛋白激活了。因此B7RP-1的可溶性蛋白质、抗体或小分子抑制剂可以用于抑制IBD。
实施例20B7RP-1-Fc融合蛋白抑制小鼠体内肿瘤生长为了检验B7RP-1和CRP-1对免疫原性鼠Meth A肉瘤的生长的作用，我们研究了可溶性B7RP1-Fc是否影响Balb/c小鼠体内建立的MethA肉瘤的生长。
0天时，指数生长的Meth A肉瘤细胞通过皮内注射0.5百万细胞而植入到Balb/c小鼠的腹部。第7天，当肿瘤达到～100mm3时，小鼠在第7、10、14和17天时在颈部皮下注射载体(PBS)或B7RP-1-Fc(8mg/kg)进行治疗。利用测径器测量肿瘤的二维直径并使用公式肿瘤体积＝[{(宽)2x长}/2]估计肿瘤体积(mm3)。检测肿瘤的生长直到第28天。每组有8只小鼠。
对照肿瘤的Meth A肉瘤生长方式是二相性的缓慢的初始相后是相对迅速的指数相。在B7RP-1-Fc治疗小鼠中，在迅速的指数期中肿瘤的生长显著放慢。第28天，对照小鼠和B7RP1-Fc治疗小鼠的平均体积分别是1410mm3和580mm3(图20)。因此，在这种模型中B7RP-1-Fc治疗显著抑制了肿瘤的生长。该数据有力地提示了可溶性B7RP-1-Fc蛋白质和B7RP-1/CRP-1路径的其他激活物在免疫原性肿瘤的治疗中的有益的治疗功用。
免疫学抗肿瘤活性与细胞溶解性T淋巴细胞(CTL)功能密切相关。一致地，B7RP-1-Fc蛋白在细胞溶解性CD8+T细胞上表达(实施例9，图6)。这些数据有力地支持了B7RP-1对细胞溶解性CD8+T细胞的功能。因此，B7RP-1-Fc或B7RP-1/CRP-1路径的其他刺激物可以用于增强用于大量非癌相关适应症的细胞溶解性T细胞和细胞免疫功能。
实施例21人B7RP-1活性的体外抑制为了确定人B7RP-1是否具有正的共同刺激性能，我们在T细胞增殖测定中检验了表达人B7RP-1和人B7RP-1-Fc融合蛋白的细胞。人B7RP-1-Fc融合蛋白通过将与氨基酸1至247相对应的基因序列与部分人IgG1基因序列融合来构建(实施例14)。人CRP-1-Fc融合蛋白通过将与氨基酸1至146相对应的基因序列与部分人IgG1基因序列融合来构建(实施例2)。这两种融合蛋白的构建、表达和纯化方法如实施例7中所述进行。B7RP-1-Fc示范了依赖于抗CD3刺激的共同刺激活性(图21a)。另外，这种活性可以特异性地被可溶性CRP-1-Fc蛋白抑制(图21b)。使用含有整个编码序列的表达膜结合人B7RP-1的CHO细胞得到了类似的共同刺激效果(图21c)。
在上述体外增殖条件下测定人T细胞产生细胞因子的情况。已受激48和72小时的来自T细胞培养物的上清液按照制造商的说明书(BioSource Intemational)利用ELISA分析其IL-2、IL-10和IFN-γ。IFN-γ和IL-10浓度显著升高；但是，与用CD28共同刺激的情况不同，IL-2没有显著的诱导出(图21d)。如实施例13中所述，升高浓度的IFN-γ-一种Th1细胞因子，与B7RP-1增加IgG2a的功能相关。
体外T细胞共同刺激测定如下进行。高度纯化的人T细胞(＞98％CD3+)使用mAb标记磁珠(Miltenyi Biotec)通过新鲜或融化的粘着除尽的PBMC的负选择加以分离。T细胞(1×105细胞/孔)以一式三份在96孔平板中在200μl/孔RPMI+10％FCS中培养。为了评估B7RP-1-Fc共同刺激，将存在于100μl 1X PBS中的不同浓度的抗CD3(Pharmingen)和10μg/ml抗人IgG Fc(Sigma)通过在4℃下孵化过夜而预先涂敷到U形底的平板上。将未结合的抗CD3和抗人IgG Fc除去，细胞在有或没有各种浓度的B7RP-1-Fc、OPG-Fc对照或抗CD28(Pharmingen)的条件下进行培养。对于B7RP-1-Fc共同刺激的CRP-1-Fc抑制，T细胞在预先涂敷了0.33μg/ml抗CD3和10μg/ml抗人IgG Fc的孔中、在从10μg/ml开始的连续稀释的CRP-1-Fc或OPG-Fc的存在下用0.5μg/ml B7RP-1-Fc培养。为了评估由表达B7RP-1的CHO细胞产生的共同刺激，T细胞在平底平板中、在有或没有不同量的丝裂霉素C处理过的CHO B7RP-1细胞或CHO载体细胞的条件下、用不同浓度的可溶性抗CD3培养。为了检验T细胞增殖情况，在72小时培养物的最后18个小时中，培养物用1μCi/孔[3H]TdR进行脉冲。T细胞增殖通过掺入的[3H]TdR来测定。来自三个随机供体的一个代表性实验结果表示为掺入的平均CPM+/-SD。对于细胞因子产生的分析，将细胞培养48和72小时，收集上清液用于ELISA。
这些实验表明，人B7RP-1的胞外部分，如实施例14中所述，当与人Fc片段融合时，可以在体外共同刺激T细胞。这种共同刺激受到CRP-1-Fc的抑制，并因此证明了人B7RP-1的可溶性抑制剂可以怎样起作用。体外测定，诸如此处描述的使用人B7RP-1和CRP-1进行的，可以用于筛选B7RP-1/CRP-1活性的抗体、可溶性蛋白、多肽或小分子抑制剂。
***尽管本发明已根据优选的实施方案进行了描述，但应当理解本领域技术人员将可以进行变化和修改。因此，我们的打算是所附的权利要求书覆盖所有在所请求保护的本发明范围内出现的这类等价变化。
序列表<110>Amgen Inc.<120>与免疫应答有关的新颖多肽<130>A-579-A<140>09/264，527<141>1999-03-08<160>35<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>600<212>DNA<213>小鼠<220><221>CDS<222>互补物((1)..(600))<400> 1atg aag ccg tac ttc tgc cgt gtc ttt gtc ttc tgc ttc cta atc aga48Met Lys Pro Tyr Phe Cys Arg Val Phe Val Phe Cys Phe Leu Ile Arg1 5 10 15ctt tta aca gga gaa atc aat ggc tcg gcc gat cat agg atg ttt tca96Leu Leu Thr Gly Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asp His Arg Met Phe Ser20 25 30ttt cac aat gga ggt gta cag att tct tgt aaa tac cct gag act gtc144Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile Ser Cys Lys Tyr Pro Glu Thr Val35 40 45cag cag tta aaa atg cga ttg ttc aga gag aga gaa gtc ctc tgc gaa192Gln Gln Leu Lys Met Arg Leu Phe Arg Glu Arg Glu Val Leu Cys Glu50 55 60ctc acc aag acc aag gga agc gga aat gcg gtg tcc atc aag aat cca240Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Ala Val Ser Ile Lys Asn Pro65 70 75 80atg ctc tgt cta tat cat ctg tca aac aac agc gtc tct ttt ttc cta288Met Leu Cys Leu Tyr His Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu85 90 95aac aac cca gac agc tcc cag gga agc tat tac ttc tgc agc ctg tcc336Asn Asn Pro Asp Ser Ser Gln Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ser Leu Ser100 105 110att ttt gac cca cct cct ttt caa gaa agg aac ctt agt gga gga tat384Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gln Glu Arg Asn Leu Ser Gly Gly Tyr115 120 125ttg cat att tat gaa tcc cag ctc tgc tgc cag ctg aag ctc tgg cta 432Leu His Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys Leu Trp Leu130 135 140ccc gta ggg tgt gca gct ttc gtt gtg gta ctc ctt ttt gga tgc ata 480Pro Val Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Leu Leu Phe Gly Cys Ile145 150 155 160ctt atc atc tgg ttt tca aaa aag aaa tac gga tcc agt gtg cat gac 528Leu Ile Ile Trp Phe Ser Lys Lys Lys Tyr Gly Ser Ser Val His Asp165 170 175cct aat agt gaa tac atg ttc atg gcg gca gtc aac aca aac aaa aag 576Pro Asn Ser Glu Tyr Met Phe Met Ala Ala Val Asn Thr Asn Lys Lys180 185 190tct aga ctt gca ggt gtg acc tca 600Ser Arg Leu Ala Gly Val Thr Ser195 200<210>2<211>200<212>PRT<213>小鼠<400>2Met Lys Pro Tyr Phe Cys Arg Val Phe Val Phe Cys Phe Leu Ile Arg1 5 10 15Leu Leu Thr Gly Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asp His Arg Met Phe Ser20 25 30Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile Ser Cys Lys Tyr Pro Glu Thr Val35 40 45Gln Gln Leu Lys Met Arg Leu Phe Arg Glu Arg Glu Val Leu Cys Glu50 55 60Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Ala Val Ser Ile Lys Asn Pro65 70 75 80Met Leu Cys Leu Tyr His Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu85 90 95Asn Asn Pro Asp Ser Ser Gln Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ser Leu Ser100 105 110Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gln Glu Arg Asn Leu Ser Gly Gly Tyr
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权利要求
1.包含选自下列成员的核苷酸序列的分离核酸分子a)、图1A中显示的核苷酸序列(SEQ ID NO1)；b)、编码图1A中显示的残基1-200或21-200的多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO1)；c)、编码与图1A中显示的多肽至少约70％相同的多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO1)；d)、(a)、(b)或(c)任一个的天然产等位变体或可变剪接变体；e)、与(a)、(b)或(c)任一个互补的核苷酸序列；f)、编码至少约25、50、75、100或大于100个氨基酸残基的多肽片段的(b)、(c)或(d)的核苷酸序列；g)、包含至少约10、15、20、25、50、75、100或大于100个核苷酸的片段的(a)、(b)或(c)的核苷酸序列；和h)、在严格条件下与(a)-(g)任何之一杂交的核苷酸序列。
2.包含选自下列成员的核苷酸序列的分离核酸分子a)、图2A(SEQ ID NO11)或图3A(SEQ ID NO6)或图12A(SEQ IDNO16)中显示的核苷酸序列；b)、编码图2A(SEQ ID NO6)中显示的残基1-322或残基47-322的多肽或者图3A(SEQ ID NO11)中显示的残基1-288或残基19-288、20-288、21-288、22-288、24-288或28-288的多肽或者图12A中显示的残基1-302或残基19-302、20-302、21-302、22-302、24-302或28-302的多肽的核苷酸序列；c)、编码与图2A(SEQ ID NO6)或图3A(SEQ ID NO11)或图12A(SEQ ID NO16)中显示的多肽至少约70％相同的多肽的核苷酸序列；d)、(a)、(b)或(c)任一个的天然产等位变体或可变剪接变体；e)、与(a)、(b)或(c)任一个互补的核苷酸序列；f)、编码至少约25、50、75、100或大于100个氨基酸残基的多肽片段的(b)、(c)或(d)的核苷酸序列；g)、包含至少约10、15、20、25、50、75、100或大于100个核苷酸的片段的(a)、(b)或(c)的核苷酸序列；和h)、在严格条件下与(a)-(g)任何之一杂交的核苷酸序列。
3.权利要求1或2的核酸分子，其中核苷酸序列是与表达控制序列可操作地相连的。
4.一种宿主细胞，它包含权利要求2的核酸分子。
5.权利要求3的宿主细胞，它是真核细胞。
6.权利要求3的宿主细胞，它是原核细胞。
7.一种生产多肽的方法，它包括使权利要求3的宿主细胞的培养物在合适的培养基中生长和从该培养物分离多肽。
8.用权利要求7的方法生产的多肽。
9.由权利要求1的核酸分子编码的多肽。
10.由权利要求2的核酸分子编码的多肽。
11.包含选自下列成员的氨基酸序列的分离多肽a)、图1A中显示的氨基酸序列(SEQ ID NO2)；b)、图1A(SEQ ID NO2)中显示的包含位于残基21上的成熟氨基端的成熟氨基酸序列；c)、图1A(SEQ ID NO2)中显示的包含至少约25、50、75、100或大于100个氨基酸残基的氨基酸序列的片段；d)、(a)、(b)或(c)的直向同源物；和e)、(a)、(b)、(c)或(d)的等位变体或可变剪接变体。
12.包含选自下列成员的氨基酸序列的分离多肽a)、图2A(SEQ ID NO7)或图3A(SEQ ID NO12)或图12A(SEQ IDNO17)中显示的氨基酸序列；b)、图2A(SEQ ID NO7)中显示的包含位于残基47上的成熟氨基端的成熟氨基酸序列，或图3A(SEQ ID NO12)中显示的包含位于残基19、20、21、22、24或28任何之一上的成熟氨基端的成熟氨基酸序列，或图12A(SEQ ID NO17)中显示的包含位于残基19、20、21、22、24或28任何之一上的成熟氨基端的成熟氨基酸序列；c)、图2A(SEQ ID NO7)或图3A(SEQ ID NO12)或图12A(SEQID NO17)中显示的包含至少约25、50、75、100或大于100个氨基酸残基的氨基酸序列的片段；d)、(a)、(b)或(c)的直向同源物；和e)、(a)、(b)、(c)或(d)的等位变体或可变剪接变体。
13.与权利要求9、10、11或12的多肽特异性结合的抗体或其片段。
14.权利要求11的抗体，它是单克隆抗体。
15.权利要求13的抗体，它是人抗体。
16.权利要求13的抗体，它是人源化或CDR嫁接抗体。
17.权利要求13的抗体或其片段，它结合B7RP1或B7RP1胞外域。
18.权利要求13的抗体或其片段，它抑制B7RP1与CRP1的结合。
19.一种组合物，它包含权利要求9、10、11或12的多肽和药学上可接受的载体、佐剂、加溶剂、稳定剂或抗氧剂。
20.一种多肽，它包含权利要求9、10、11或12的多肽的衍生物。
21.权利要求20的多肽，它是用水溶性聚合物共价修饰的。
22.一种融合多肽，它包含与异源氨基酸序列融合的权利要求9、10、11或12的多肽。
23.权利要求22的融合多肽，其中异源氨基酸序列是IgG恒定结构域或其片段。
24.一种治疗、预防或改善T细胞介导疾病的方法，它包括对动物给药权利要求9、10、11或12的多肽。
25.一种诊断动物的T细胞介导疾病或对T细胞介导疾病的敏感性的方法，它包括a)测定权利要求9、10、11或12的多肽的表达的存在或量；和b)基于多肽表达的存在或量来诊断T细胞介导疾病或对T细胞介导疾病的敏感性。
26.一种鉴别与多肽结合的检验分子的方法，它包括a)使权利要求9、10、11或12的多肽与检验分子接触；和b)测定多肽与检验分子的结合程度。
27.权利要求26的方法，它进一步包括当多肽与化合物结合时测定其活性。
28.调节动物体内T细胞活化或增殖的方法，包括对动物给药权利要求1、2或3的核酸分子。
29.一种转基因非人哺乳动物，它包含权利要求3的核酸分子。
30.抑制动物体内免疫应答的方法，包括对动物给药CRP-1或B7RP-1的拮抗剂。
31.权利要求30的方法，其中拮抗剂是结合B7RP-1的抗体。
全文摘要
本发明公开了与T细胞活化有关的包含受体－配体对的新颖多肽。还公开了编码所述多肽的核酸分子,以及用于表达其的载体和宿主细胞。这些多肽或其激动剂和拮抗剂用于治疗T细胞介导的疾病。
文档编号A61P3/00GK1346370SQ00805783
公开日2002年4月24日 申请日期2000年1月27日 优先权日1999年2月3日
发明者S·K·约施纳加 申请人:安姆根有限公司