专利名称：混合使用含有中链脂肪酸和外源脂肪分解酶的甘油三酸酯作为饲料添加剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有中链脂肪酸(MCFA；C4至C12)的甘油三酸酯(TG)与外源脂肪分解酶相混合作为用于动物的饲料添加剂的用途，所述动物尤其是早期断奶猪，以防止和/或减轻在这时经常遇到的问题。在不使用经典但有争议的饲料添加剂的情况下，这导致了明显的生长性能的改进。
背景技术：
为增加生产率和保持利益率，在养猪体系中仔猪的早期断奶(3至4周龄)已成为一般性的作法。但早期断奶却给仔猪带来了许多应激反应负担，主要是环境、营养和免疫方面的，伴之有或多或少的饲料摄入量的明显降低和身体储备的动用。消化不良和吸收不良时常使这种情况加剧，由于细菌的过度生长和/或病毒感染导致消化不良。这些现象极大地影响了企业的利益率。有众多的文献涉及到这些问题(例如VAN DER PEET，1992；PARTRIDGE，1993)。
处理这些问题目前所采用的方法其目的在于使饲料适应仔猪的消化能力，和/或通过使用特殊的组分(例如奶粉和衍生物，如乳清和乳糖、干燥血清、调味剂)来改进饲料的可接受性。尤其通过加入易于消化或代谢的脂肪可获得能量含量的增加。对于新生(ODLE，1999)和断奶仔猪(CERA等，1989)均有文献记载在这种背景下中链甘油三酸酯(MCTG)的效用。MCTG有效性的原因是它们的特别的消化和代谢性(fate)，这由BACH & BABAYAN.(1982)进行了综述。
通过在饲料中添加杀菌药物(抗生素、化学疗法，还称为抗生素)可防止和/或处理消化不良。上述干预的结合效应大多导致生长性能有明显改进(也称为“促进生长”)。根据具体情况，这种促进生长主要得力于改进的饲料摄入量与更佳的饲料转化率(＝kg饲料/kg增重)之间的结合。但在动物生产体系中对使用抗素素来促进生长的担忧日益增加。尤其是深切恐惧出现对在人类药物中使用的某些做为最后手段的抗生素产生交叉抗药性的危险(CORPET，1996；WEGENER等，1998)。因而在欧盟这些抗生素(所谓的生长促进剂)多数均已被禁止或不久将被禁止，从而提出了对替代品的紧急需求。
因为一般认为在早期断奶猪中消化病变主要由Gram细菌(尤其是大肠杆菌(E.coli)引起，而Gram+乳酸菌(双歧杆菌、乳杆菌)对它们具有防护和/或拮抗作用，目前提出的替代品根据它们的抗大肠杆菌活性来选择例如铜和锌化合物，选择的有机酸(短链脂肪酸(SCFA，甲酸、乙酸、丙酸)乳酸、富马酸、柠檬酸、苹果酸、山梨酸)，probiotics(主要为乳酸菌)和/或prebiotics(主要为双歧因子(bifidogenic)低聚糖，所谓的NDO`S)。Cu和/或Zn化合物是有效的，但却因其对环境的影响(污染)而是不可接受的。由pro-和/或prebiotics所得到原结果是不可预料的，一般来说是失望的(CHESSON，1994)。
在其它动物类及其它年龄组的动物中存在相似的问题。
目前而言，仅有SCFA和“传统的”有机酸是最有希望的替代品(ROTH等，1998)。但需要相当高的剂量，因而由于其高的费用、腐蚀性和大大干扰仔猪饲料摄入量的不适口味而使它们的有效性受到限制。
脂肪酸(FA)总体及其盐(肥皂)的抗菌作用已公知有数十年了。在KABARA(1978)中综述中给出了对所选择的FA(和衍生物)的抗菌作用的重新评价。其对月桂酸(C12，MCFA族成员)和衍生物给予了特别的关注。
其它的文献数据涉及MCFA在某些动物类(如兔、山羊、马)的奶的类脂物中的相对重要作用，而在其它种类中所述浓度是低的或甚至如在母猪奶中是不存在的(DIERICK，1998，文献汇编，个人通信)。在多数哺乳动物中存在源于舌或胃分泌的明显程度或多或少的前十二指肠(preduodenal)(＝非胰腺来源)脂肪分解活性。这些脂肪酶的活性与共脂肪酶和胆汁酸的存在无关，在宽的pH值范围内具有活性且保持稳定，并对乳脂中的MCFA具有优先性(preference)。在反刍前小牛和兔中前十二指肠脂肪酶活性高，在仔猪中有中等活性，而在家禽中不存在该活性(MOREAU等，1988)。过量的MCFA可具有重要的副作用确实，有数据表明，在新生猪中它们可为催眠性的(ODLE，1999)，并是CCK的强刺激物，所述CCK是一种可干扰饲料摄入量的具有明显饱腹活性的肠内激素(LEPINE等，1989)。较低的饲料摄入量还可为游离MCFA的强烈(似山羊的)气味和不良口味所致，但这方面的数据不足，是非结论性的。
发明简述本发明的目的在于提供用于动物饲料的新的饲料添加剂，特别是用于早期断奶的猪，所述添加剂可取代通用的(且有争议的)抗生素和其它促生物剂。
本发明涉及饲料添加剂或饲料组合物，所述饲料添加剂是饲料添加剂(尤其是维生素、矿物质、抗生素)与载体的预混物，用作全价饲料的部分(通常1至5％)，而饲料组合物是全价饲料中所用不同饲料组分的全部系列常用的另一名称是“饲料配方”。
本发明提供了含有中链脂肪酸(MCFAC4至C12)的至少一种甘油三酸酯(TG)与至少一种外源脂肪分解酶(酯酶或脂肪酶)相结合用作动物饲料的饲料添加剂的用途，特别是用于早期断奶的猪，以防止和/或减轻在这种情况下时常遇到的喂养问题。在饲料中添加TG与外源脂肪分解酶的这种组合物意外地导致可调节和稳定胃肠微生物群落的胃中生理环境。这种作用加之以提供了易消化和代谢的能量源的事实，意外地导致明显改进了生长，其与通用抗生素和其它促生长剂所得到的促生长作用相当，而对动物、饲料工业和消费者无负面的副作用。
附图简要说明
图1涉及的是由实施例1得到的结果，对不同检测的TG`s(图1.a.椰子油，图1.b.MCTG1，图1.c.MCTG2，图1.d.乳脂)和所选择的酶表示了离体释出的MCFA(以g/100gTG来表示)。对于TG基物使用了剂量为10000ppm的编号为L1至L6的酶。在pH为2、3、4和5的缓冲介质中对释出的FA进行了研究，所述pH值为在胃中活体内常见的pH条件的代表。
图2涉及的是在实施例2中得到的结果，并表示了在插入了导管的猪的胃内容物中的总体和所选择的细菌计数(以log10菌落形成单位、每g新鲜内容物中CFU来表示)。图2.a，2.b.和2.c.给出了分别含有5％椰子油、MCTG1和乳脂的饲料的结果。在各图中的第一组分表示无脂肪分解酶所得到的结果，第二和第三组为分别添加L2和L5(以饲料计1000ppm)的结果。第一柱为总计数，接着的柱是乳酸菌、链球菌和大肠杆菌的菌数。该结果表明，对于各种TG，所述酶引起了总计数和乳酸菌菌数的下降。
图3涉及的是在实施例2中所用的插入了导管的猪的胃内容物中脂肪份数的分析。针对不含酶(V1椰子油，V4MCTG1；V7乳脂)或添加了L2或L5(以饲料计1000ppm)的使用不同TG`s的饲料，给出了游离FA与FA总量的比值。不含酶所释出的游离FA由内生的前十二指肠脂肪酶的活性所导致。该结果表明，所使用的脂肪分解酶大大增加了由各种测试TG释出的游离FA。
发明的详细说明本发明涉及含有中链脂肪酸(MCFA)的至少一种甘油三酸酯(TG)与至少一种外生脂肪分解酶(酯酶或脂肪酶)相结合用作动物饲料的饲料添加剂的用途，以防止和/或减轻在这种情况下时常遇到的问题。
因而本发明还涉及一种饲料添加剂组合物，它包括含有中链脂肪酸(MCFA)的至少一种甘油三酸酯(TG)和至少一种外生脂肪分解酶(酯酶或脂肪酶)。
本发明的中链脂肪酸包括偶数和奇数的脂肪酸，如含C4(丁酸)、C5(戊酸)、C6(己酸)、C7(庚酸)、C8(辛酸)、C9(壬酸)、C10(癸酸)、C11(十一烷酸)或C12(月桂酸、十二烷酸)的脂肪酸。本发明的MCFA甘油三酸酯组分可为天然存在的含有甘油三酸酯的组合物，如乳脂和椰子油。所述甘油三酸酯另外也可包含一或多种工业制备的甘油三酸酯或天然存在的和工业制备的甘油三酸酯的混合物。所述甘油三酸酯可通过C4至C12链脂肪酸的酯交换来制备。
富含含有甘油三酸酯的中链脂肪酸的天然存在的物质的实例包括但非仅限于得自植物种子的椰子油、棕榈仁油、巴巴苏油、羽叶棕榈油(cohune oil)、tacum oil、cuphea oil，哺乳动物类的奶，如马、鼠、山羊和兔的奶，或乳脂。
化学合成构成或特制的含有中链脂肪酸的甘油三酸酯的市售来源的实例包括但非仅限于表10中所给出的那些或在实施例的材料一节中所列举的那些。
本发明的脂肪分解酶组分可包括脂肪酶或酯酶、脂肪酶混合物或酯酶混合物或脂肪酶与酯酶的混合物。所述脂肪酶或酯酶可是天然存在的或工业制备的。所述脂肪分解酶可是微生物、哺乳动物或植物来源的。
市售植物脂肪酶的实例包括但非仅限于来自小麦、蓖麻子、油菜、芥子(mustard)和羽扇豆的脂肪酶。
市售微生物脂肪酶的实施例包括但非仅限于在表11中所给出的脂肪酶或在实施例的材料一节中所列举的那些。
市售酯酶的实例包括但非仅限于来自小牛、小山羊和羔羊舌下组织的前胃(pregastric)酯酶(PGE)、来自小牛、小山羊和羔羊的充血皱胃的凝乳酶膏(rennet paste)、来自兔肝或猪肝的酯酶。
优选以上定义的本发明所述甘油三酸酯组分在饲料中以约0.25％至约10％的浓度添加。
优选所述脂肪分解酶组分在饲料中以约100至约10000ppm的浓度添加。
本发明饲料添加剂组合物的用途优选用作动物饲料的饲料添加剂，特别是用于早期断奶的猪。本发明饲料添加剂组合物的用途不排除这种组合物作为其它年龄组的猪的饲料添加剂或作为其它类型动物的饲料添加剂的用途。
本发明还涉及本发明的至少一种MCFA TG和至少一种脂肪分解酶的组合物用于制备优选用于早期断奶仔猪的饲料添加剂的用途。
本发明还涉及制备本发明饲料添加剂的方法，包括将对应于本发明的不同MCFA TG与脂肪分解酶组分进行混合的步骤。
在文献中详细记载了SCFA、MCFA和其它有机酸产生抗菌剂活性的机理。目前认为，未离解的(RCOOH＝非离子化的)酸在脂类中有渗透性，以这种途径，它可穿过微生物细胞膜并在微生物的碱性更大的内部解离()。这导致细胞内pH酸化降至低于存活可渗透的水平。换言之，有机酸起到protonophores的作用，这增加了H+向内的渗漏，使得流出不能达到使细胞质重新碱化的那样快速。有机酸的物化特性大大影响了它们作为protonophores的能力(分子量、pKa(离解常数)、溶解度)。它们所处的生理环境(尤其是胃肠道不同部位的pH)也是很重要的因素。另外，微生物包膜(envelope)的类型(在Gram+中主要为肽聚糖，在Gram-细菌中为脂多糖)大大影响酸经过膜的穿透。
首先，在初步(preliminary)体外实验中，其中对宽范围的有机酸(SCFA，MCFA和其它在饲料和食品工业中通用的有机酸)测试其对小肠微生物群落的优势菌的抗菌活性，本发明人意外发现，SCFA和通用的有机酸仅在较高浓度下(0.02至0.04M)对Gram-菌丛(flora)(和较低程度上对链球菌)有抑菌作用。但对于MCFA发现了其对Gram+和Gram-细菌的意外的高的抑菌和杀菌活性。所述抗菌活性与pH有关，在较低pH、即当较高比例的FA呈未解离形态时该活性最大。在同一实验中，提出的试验性最小杀菌浓度为0.005至0.01M。
另外意外的是，通过使用MCFA的组合物，可完全模仿在集约化动物生产中使用的抗菌促生长剂的抗菌谱。
文献详细记载了MCTG作为易得能量源的特别特性。它们的作用可概括如下(BACH & BABAYAN，1982)-MCTG呈无序状态快速消化、吸收和传送，其中消化和吸收并非最佳。在新断奶的仔猪中时常观察到消化不良和吸收不良，这归因于大多数消化酶的活性的急剧下降。在断奶后不久脂肪分解酶的缺乏很明显。
-MCTG在有机体中快速氧化，并是丰富和快速易得的能量源。但MCTG是生酮的(ketogenic)，其在给出高剂量时可具有麻醉剂的副作用。这种副作用在仔猪中当然是不希望的。
再有，通过CCK激活的对饲料主动摄入的抑制作用也是不需要的。另外，还对(生产者和/或动物)有害的是较易蒸发的MCFA的强烈的不适气味。
为获得积极的效果并避免MCFA的负面特性，本发明人的原始想法是使用含有足够MCFA的TG与脂肪分解酶的组合物来作为饲料添加剂，目的在于在胃中应释出足够的MCFA以具有灭菌作用，导致在小肠中的较小的细菌接种量(bacterial load)并防止消化不良。这种作用结合以MCFA的额外的易得能量，以及由外生脂肪分解酶在胃和肠顶部(upper intestine)中添加的天然脂肪酶活性，意外导致促生长作用，使得无必要来使用抗生素。游离MCFA的预期的缓释和吸收意外地避免了副作用。
简要来说，本发明叙述了用于动物的自然促生长饲料添加剂的组合物。
如下实施例和附图仅用来说明本发明而不是要以任何方式对其限制。
实施例材料作为实例选择如下脂肪来说明本发明乳脂，椰子油，及MCTG的两种市售来源MCTG1(Aldo MCT Kosher Fosher Food Grade)和MCTG2(Stabiox-860)，分别由LONZA Inc.(FairLawn，NJ070410，USA)和LODERS-CROKAAAN BV(NL-1521 AZWormerveer)出售。作为实例选择如下脂肪分解酶来说明本发明L1Lipozyme 10.000L，NOVO Nordisk A/S，2880 Bagsvaerd，Denmark；L2Lipase 10.000P，Biocatalysts Ltd.，CF37 5UT Pontypridd，Wales，UK；L3TP 516P，Biocatalysts Ltd.，CF37 5UT Pontypridd，Wales，UK；L4LIPOMOD 224P，Biocatalysts Ltd.，CF37 5UTPontypridd，Wales，UK；L5Lipase SAIKEN，NAGASE & Co，Chuo-ku，103 Tokyo，Japan；L6Lipase ITALASE C，SBI，Systems Bio-Industries，Inc.，WI 53187-1609 Waukesha，USA。编码L1至L6后面还将使用。在这些实施例中叙述的TG和脂肪分解酶的选择不排除可能应用其它TG和脂肪分解酶及其组合来用于说明本发明。
萃取方法和不同脂类化合物的分析采用使用己烷/异丙醇(3/2，v/v)的脂类萃取步骤，避免任何溶剂蒸发步骤，从而防止由于其巨大挥发性而造成的MCFA的任何损失。
使用在相同萃取介质中的FA的酸(H2SO4)催化酯化，生成异丙酯(FAIPE)，不损失较短的酯或改变有多个不饱和度的较高级的FA。FAIPE出现在顶部己烷相中。
为计算浓度，采用使用两种内标物(C9用于C4至C12酸，C17用于C14至C183酸)的各种FAIPE的定量毛细管柱(DB-225，30m，ID0,25mm，膜0,25μm)GLC色谱法。对响应因子的变化系数对C9达0.94％，对C17达2.51％。
在同一介质中进行酯化之前用强阴离子交换树脂Amberlyst 26从脂类萃取物中萃取出各种游离FA，并通过添加游离FA达101.9％的毛细GLC平均回收进行分析。
实施例1在不同pH下含有TG`s和脂肪分解酶的MCFA用于脂解的体外筛选(模拟胃中条件)基于其在市场环境下的商业可得性和可行价格来选择所要测试的脂肪分解酶，编码为L1至L6。基于如表1所标出的其在脂肪中的具体MCFA含量来选择含MCFA的TG`s。
表1.在所选择的TG`s中MCFA的浓度(g/100gFA)C4 C6 C8 C10C12乳脂3.42.11.22.63.0椰子油 0 0.78.56.248.8MCTG1 0 2.869.1 27.7 0.4MCTG2 0 0.257.5 42.3 0.0在不同pH下在缓冲环境下进行体外培养；在pH2和pH3下使用氨基乙酸进行培养；在pH4和pH5下使用乙酸盐进行培养。在摇动水浴中在37℃下进行180分钟的培养。对培养所用参数进行选择以尽可能接近地模拟在胃内容物中活体内条件。培养所用介质由如下组分组成0.250g所选择的TG+2.250g合成饲料(其中淀粉、右旋糖、酪蛋白和维生素-矿物质预混物)+10ml缓冲溶液+0.5ml胃液素溶液(在100ml aqua deste中50mg)+10000mg/kg所选择的市售脂肪分解酶制剂的脂肪(＝ppm)。如必要，将脂肪熔化，否则没有脂肪的特殊制剂(分散液或emulgation)。
在图1a至1d中给出了培养结果，其中示出了对于所检测的不同TG`s所释出的MCFA，以g/100g TG计。对于各种酶，在pH3至5时水解活性最高，这正与在猪的胃中活体通常的pH相吻合。释出的游离MCFA的数量看起来与在TG的原始来源中存在的数量无关。对椰子油所释出的MCFA的数量为±3.5％，对两种MCTG`s为10-15％，对乳脂为±0.5％。
实施例2
用胃中插入导管的猪进行活体内实验以研究通过内生和外生脂肪分解酶所致的MCFA的现场释出使用DECUYPERE等人的技术用胃套管来对初始重量为±8.5kg的三头猪进行制备。将所述套管置于主要在底区的弯曲部的中间位置。
选择三种TG`s(各为椰子油、MCTG1和乳脂)和2种脂肪酶(L2和L5)来进行本实验。
使用95％的市售仔猪饲料及5％的所选择的(最终熔融)TG`s来制备九种饲料，并有部分添加了所选择的酶(参见表2随后还使用的编码)。将脂肪简单地倾倒在粉状物上并在水平混合器中彻底混合。在饲料中脂肪酶的浓度为1000ppm市售制剂。
表2.在实验中使用的饲料椰子油V195％仔猪饲料+5％椰子油V2同上+1000ppm L2V3同上+1000ppm L5MCTG1V495％仔猪饲料+5％MCTG1V5同上+1000ppm L2V6同上+1000ppm L5乳脂V795％仔猪饲料+5％乳脂V8同上+1000ppm L2V9同上+1000ppm L5仔猪饲料组合物是基于玉米、大麦、干燥酸乳清、木薯(cassave)、鲱鱼粉、大豆油，并添加有维生素-矿物质预混物。所述饲料不含促生长添加剂。以％给出的饲料的近似分析如下DM90.6，90.7和90.8；总灰分7.8，7.9和8.5；粗蛋白15.1，15.4和14.8；粗脂肪8.5，8.3和8.3。
分三等餐(9、13和17小时)呈干燥物给予所述饲料，以相当重量的猪的随意摄取量的85％来给予。
所述实验按3×3拉丁方设计。
所述实验过程是成功的。没有健康问题也没有饲料拒食。使用ANOVA(1997)来进行统计，差异为P＜0.01至P＜0.05(**)或P＜0.1(*)。
在连续2天中、每天2次、在9小时和13小时进食30分钟后对胃内容物进行采样以进行化学分析。直接测量pH值，随后将试样在-20℃下贮存直到进行进一步的分析。
在1天中在9小时和13小时进食90分钟后对胃内容物进行采样以进行细菌学分析。使用VAN DER HEYDE等人的技术(1964)进行细菌计数。所使用的介质(均来自OXOID UK)为RCM琼脂+血晶质用于总计数(48小时，厌氧)，Rogosa琼脂用于乳酸菌(48小时，厌氧)，Slanetz & Bartley琼脂用于粪链球菌(24小时，厌氧)，EMB琼脂用于大肠杆菌(24小时，厌氧)。所有培养均在37℃下进行。结果以log10CFU/g新鲜含量(菌落形成单元)表示。
所述结果可总结如下在饲喂后30和90分钟后测量的胃内容物的pH值在所述处置(饲料)之间没有区别，其范围为4.2至5.01。这一范围处于L2和L5的脂肪分解活性的最佳范围内，与第一实验中所见相同。
细菌学计数示于表3和图2中。
表3.在饲喂日粮1至9的仔猪的胃内容物中的细菌学计数(log10CFU/g新鲜内容物平均值±s.d) (n＝6).
乳酸菌链球菌 大肠杆菌椰子油V1 6.4±0.8 6.0±0.8 4.3±1.0 2.3±1.2V2 5.2±0.3**5.0±0.3**4.1±0.6 2.4±1.4V3 5.3±0.6**4.9±0.7**2.7±1.6*2.6±2.1MCTG1V4 6.1±0.2 5.7±0.5 5.2±0.4 2.9±1.6V5 4.2±0.5**3.7±0.5**0.0**1.0±1.5**V6 3.4±1.7**2.7±1.4**0.5±1.2** 0.5±1.2**乳脂V7 6.4±0.4 5.7±0.8 5.0±0.6 4.1±0.5V8 5.6±0.9* 5.5±0.3 4.0±0.7*3.4±0.1*V9 5.7±0.5* 5.5±0.5 4.0±0.7*4.5±1.4*，**栏内每个TG的差异最重要的结果是-对于椰子油，L2和L5均使总计数和乳酸菌数降低了10倍对于MCTG1，两种酶均具有很明显的(大多p＜0.001)效果，并使总计数和乳酸菌以100和1000因子降低；链球菌和大肠杆菌多数降至不可检测出的水平-对于乳脂，总计数和链球菌数有10倍的降低。
所述结果得出的结论是，在饲料中含有MCFA的TG与脂肪分解酶的结合能够抑制总菌数和占多数的菌落。这一效果很可能是由所使用的TG`s释出的游离MCFA所导致。
这一结论由在本实验过程中收集的胃内容物中的不同脂肪组分的化学分析克确认。所述分析结果在图3中给出，其中示出了每100g新鲜胃内容物的总数和游离FA。
在表4中给出了以每100g在胃内容物中的总FA的游离FA的g数来表示的所述结果，或换言之，TG的水解度(％)。
表4.由L2或L5所影响的在本实验中使用的不同TG`s的水解度(g游离FA/100g在新鲜胃内容物中的总FA)对照 +L2+L5椰子油 V1 V2 V316.5 43.2 44.8MCTG1V4 V5 V618.9 58.5 60.9乳脂 V7 V8 V916.8 46.8 45.8对于单独FA的结果(这里未示出)表明，没有特别FA的优先释出；换言之，单独的FA的释出与其在使用的TG中的含量约成比例。由图3和表1所示结果可得出结论，在仔猪的胃中的内生脂肪分解活性水解了±16-19％的TG。添加外生脂肪分解酶使水解增加了三倍。
令人吃惊和意外的是，MCFA的释出与在胃中的细菌量的抑制程度平行MCTG1+L5的结合观察到最有效的抑制，其使在胃中的TG水解60.9％(与±1％游离FA和0.6％MCFA的浓度相对应)，随后是椰子油+L5(0.8％FA酸和0.3MCFA)和乳脂+L5(0.8％FA酸和0.06MCFA)。
实施例3在市场环境中的畜牧学实验生长性能与对胃内容物的ex vivo观察相结合本实验的目的是验证以上所述的概念是否可应用及适用于市场环境，并验证当得到促生长作用时，其是否与用具有已证实效果的抗生素或有机酸组合物在早期断奶的仔猪的中得到的促生长作用相当。
在这一实验中，将244头新断奶的仔猪(Seghers Hybrid F1，初始重量±6.5kg)按照窝别(litter)、性别和体重分为4组A68；B＝61；C＝60和D＝55头仔猪。在控温设施中在市场环境下进行实验。
所使用的饲料组合物是基于大麦、小麦、玉米片、挤压过的玉米、挤压过的大豆、大豆粉、鲱鱼粉、2.5％的TG、和用于早期断奶的仔猪的市售预混物(主要基于奶产物、维生素+矿物质)(12.5％)。各处置组(A至D)所使用的TG`s和所使用的添加剂不同(见表5)。所述饲料不含促生长的抗生素。饲料A是阴性对照物，饲料D是含有通用的有机酸混合物的阳性对照物。所使用的饲料的计算近似分析进行均衡(equalized)。配方含量为(％新鲜)DM90.0à88.8，粗蛋白18.7à18.9，粗脂肪6.9，总灰分5.1-5.3。能量含量为(Nef97)2463-2475kcal/kg，理想消化氨基酸设置为Lys1.07％，Met+Cys0.65，Thre0.66，Try 0.19。
表5.在畜牧学实验中所使用的处置处置组 A B CDTG(2.5％) 大豆油MCTG2*MCTG2大豆油脂肪酶(L5) - - 1000ppm**-添加的有机酸***- - -1.5％*MCTG2根据市场易得性来选择**基于新鲜饲料***0.25％柠檬酸+0.75％富马酸，0.5％甲酸钠(如饲料制造者所标示)
所述饲料由商业饲料公司使用脂肪和其它液体添加剂喷雾设备来制备。所述饲料呈干燥物形态来提供，随意食用；经喷嘴使水可连续供给。
该实验持续3周。仔猪分别在开始实验和之后每周称重；每日记录每两栏饲料摄取量(每栏±15头仔猪的两栏共用饲料给料斗)。因而仅可对重量进行统计。每日检测每栏猪的外观健康状况，并按级别0(极坏)至10(极好)来编码。每周的畜牧学结果示于表6中。
表6.由所述处置影响的仔猪的畜牧学性能(平均值±s.d.)处置类别 1周2周3周 1至3周％对照饲料摄取量(g/d)饲料A156365472 331100饲料B191376536 368111饲料C180391533 361110饲料D189355469 338102每日增长(g/d)饲料A127±57127±57300±133 185±81100饲料B164±73** 160±70** 301±144 208±95* 112饲料C165±90** 161±88** 297±173 207±116* 111饲料D141±81** 123±73280±111 181±7198饲料转化率(kg饲料/kg增长)饲料A1.23 2.88 1.57 1.79 100饲料B1.16 2.35 1.78 1.77 99饲料C1.09 2.43 1.79 1.74 97饲料D1.34 2.89 1.68 1.87 104外观健康分组(未详细给出)对处置组A为4至9；对其它处置组为8à9，无明显差异。
在处置组A和D之间及B和C之间每日增长无差异。在断奶后的头两周获得了最明显的差，其间由处置组B和C得到了最佳的生长性能(在对照组的±30％以上)。由饲料B和C得到的较好结果(MCTG2，无或含脂肪酶)是由于饲料摄取量增加所致。但由含MCTG2+脂肪酶的饲料获得了最佳的饲料转化率。使用MCFA TG(MCTG2)和脂肪酶的组合物所获得的生长的改进与由喹啉(同时Gram+和Gram-谱的添加剂)所得到的范围(Decuypere，文献数据的meta分析，未出版的结果)相同。
在断奶两周后，对各实验组中的5只去势公猪进行无痛致死。由于所述猪随意饲喂，没有饲料摄取量的对照。在胃肠道解剖后，从胃、和顶部(十二指肠)小肠中采取试样。以在先前实验中所述的相同方式对所述试样进行化学和细菌学分析。这里仅列出了总的厌氧计数。
在十二指肠中内容物的pH为±3.5、和±5.7；所述处置组之间没有差异。总的厌氧计数示出表7中。
表7.在断奶两周后受不同处置(n＝5)影响的在仔猪的胃和顶部小肠中的总的厌氧计数(log10CFU/g新鲜内容物，±s.d.)。
处置组 胃 十二指肠A 7.0±0.2 6.4±0.5B 7.0±0.2 6.1±0.8C 5.9±0.5** 5.6±0.5**D 6.9±0.2 5.9±0.4该结果表明，具有MCFA TG(MCTG2)和脂肪酶(L5)的组合物的饲料在胃和顶部肠中均产生显著的±10倍的细菌量的降低。该效果略低于先前的胃插导管猪的实验，可能是由在本实验中所使用的MCTG的较低数量(2.5％相对于5％)和/或不同喂养和采样步骤所致。尽管如此，本实验确证了在实施例3中提及的插入导管的猪得到的结果。对于在胃内容物中的脂肪(g/100g新鲜内容物)与水解度(g游离FA/100g总FA)的不同比例的分析结果也是同样，所述分析结果示于表8中。
表8.在断奶两周后受所述处置影响的猪(n＝5)的胃内容物中游离FA和总FA的浓度(g/100g新鲜内容物，平均±s.d.)和水解度(游离FA/总FA，以％计)处置组 A B C D游离FA 0.28±0.060.44±0.100.95±0.220.31±0.09总FA1.05±0.081.25±0.221.35±0.281.07±0.17％水解 26.7 35.2 70.4 28.9
由所述％水解结果可分别计算出，对于饲料B(MCTG2)和C(MCTG2+L5)，在胃中存在的游离MCFA为0.3和0.4％。在插入导管的猪的实验中，由MCTG1+L5和椰子油+L5得到了分别为0.06和0.30％的最高的游离MCFA浓度(和最强的细菌量抑制，±100倍)。
实验2和3的组合结果清楚表明，释出的游离MCFA的数量与胃菌落抑制效果相关。
实验4不同MCTG浓度与不同剂量的所选择的脂肪分解酶的最佳组合的活体外评价由于促进生长与在小肠中总菌数的抑制成比例是我们的见解，所以进行了如下的活体外实验，其中确定含有TG(MCTG1，MCTG2和椰子油)的MCFA的含量与证实的有效脂肪酶(L5)的最佳组合。
使用了四种TG浓度0、2.5、5和10％；对于各种TG浓度，脂肪酶的添加量为10.000、1000或100ppm。每个培养瓶中的所述介质还含有2.5g的与实验1中相同的合成饲料(基于淀粉、右旋糖、酪蛋白和维生素-矿物质预混物)。但在本实验中，在添加到介质中之前，对所述TG进行分散(使用阿拉伯树胶和黄蓍树胶)。使用知当的乙酸盐缓冲剂在pH5下进行培养。最后，将所述介质(15ml)接种来自用不含促生长添加剂的饮食饲喂的插入导管的两头猪的回肠内容物的菌的悬浮液1ml。在摇动水浴中在37℃下培养180分钟。所述培养均是双重的。
脂肪分析方法和细菌计数方法均与前述实验所用相同。这里仅列出了总的厌氧菌计数。由于需要得到FA的抗菌活性与分子量之间的相关性，还以摩尔计来表示了游离脂肪酸的结果。所述结果示出表9中。
表9.活体外释出的游离脂肪酸(在介质中的g％或摩尔)和总的厌氧菌计数(log10CFU/ml介质)与不同TG`s(MCTG1，MCTG2和椰子油)及不同剂量(10.000、1000和100ppm)脂肪分解酶(L5)之间的相关性游离FA游离FA 总计数g％M log10CFU/mlMCTG1起始 0 0 6.2180分钟，对照 0 0 6.8180分钟，10.000ppm L52.5％MCTG10.17 0.012 5.95％MCTG1 0.34 0.024 ＜110％MCTG1 0.63 0.044 ＜1180分钟，1000ppm L52.5％MCTG10.11 0.008 6.15％MCTG1 0.20 0.014 4.810％MCTG1 0.39 0.027 3.8180分钟，100ppm L52.5％MCTG10.09 0.006 6.55％MCTG1 0.13 0.009 6.510％MCTG1 0.22 0.015 6.2MCTG2起始 0 0 6.3180分钟，对照 0 0 7.0180分钟，10.000ppm L52.5％MCTG20.17 0.012 5.55％MCTG2 0.30 0.021 3.410％MCTG2 0.58 0.040 1.8180分钟，1000ppm L52.5％MCTG20.13 0.009 6.35％MCTG2 0.21 0.015 6.310％MCTG20.36 0.025 5.6180分钟，100ppm L52.5％MCTG2 0.11 0.008 6.55％MCTG2 0.16 0.011 6.610％MCTG20.23 0.016 6.7椰子油起始 00 6.3180分钟，对照00 7.1180分钟，10.000ppm L52.5％椰子油 0.10 0.007 7.25％椰子油0.16 0.011 6.210％椰子油 0.36 0.025 6.2180分钟，1000ppm L52.5％椰子油 0.07 0.005 6.45％椰子油0.13 0.009 6.510％椰子油 0.22 0.015 6.4180分钟，100ppm L52.5％椰子油 0.05 0.003 6.95％椰子油0.08 0.006 7.010％椰子油 0.13 0.009 7.0所述结果可总结如下-释出的FA的数量明显与TG浓度成比例，当使用的脂肪分解酶的剂量增加10倍时仅使游离FA浓度达到双倍。对于TG％与给定ppm的脂肪分解酶的各种组合，释出的FA的次序如下MCTG1＞MCTG2＞椰子油。
-游离FA浓度越高，菌数的抑制越明显。对于明显抑制菌落来说，看起来介质中±0.35％的最小FA浓度是必需的；这对应于0.025M/升。MCTG1＞MCTG2＞椰子油的次序对应于在TG中数量最重要的MCFA的分子量的增加MCTG1＝C8，MCTG2＝C10，椰子油＝C12。
-所使用的活体外规程提供了对于含有TG`s的MCFA与适用脂肪分解酶的众多组合的极好的筛选工具，以确定其作为对胃肠微生物菌落具有稳定或抑制作用的饲料添加剂适用性。这种作用一般认为是获得促生长的基础。
表10.化学合成结构的脂类的商业来源的实例(1)产品 组成 公司Aldo MCT C8，C10 Lonza Inc.，Fair Lawn，USAStabilox-860 C8，C10 Loders-Croklaan BV，NLWormerveerCapreni C60，C80，C220 Proctor & Gamble，Cincinatti，OHSalatrim C30，C40，C180 Nabisco Foods Group，EastHanover，NJCaptex C80，C100，C182Abitec，Columbus，OHCaptex 300 C8，C10 Capital City Products，OHColumbusCaptex 810B C8，C18 Capital City Products，OHColumbusTripelargonate C9 Capital City Products，OHColumbusMixed odd chain C7，C9 Abbott Laboratories，Chicago，IL NorthNeobee C80，C100，LCFA Stepan Co，Maywood，NjNeobee M5C80，C100Stepan Co，Maywood，NjNeobee 1095 C100 Stepan Co，Maywood，NjCoconado C80Kao Co，Wakayama，JapanCoconado-RK C8，C10，C12 Kao Co，Wakayama，JapanMCTG C4，C5，C6，C7，C8，C10 Karlshamns LipidSpecialtiesColumbus，OHMCTG C8，C10 Mead Johnson & Co，
EvansvilleIN(1)来源试验产品+文献汇编表11.实验或市售微生物脂肪酶实例(1)来源生物体 公司酵母假丝酵母类(Candida sp.)Candida rugosa* Amano，Biocatalysts，Boehringer MannheimFluka，Genzyme，Sigma，Meito SankyoCandida antartica A/B Boehringer MannheimNovo Nordisk念珠菌属(Candida lipolytica)Candida paralipolyticaSaccharomyces lipolytica真菌Thermocyces lanuginosus** Novo Nordisk，Boehringer Mannheim，AmanoRhizomucor Miehei Novo Nordisk，Biocatalysts，Amano根霉属菌类(Rhizopus sp.)Nagase，Tokyo，JapanRhizopus delemarRhizopus oryzaeRhizopus niveus Alltech，Rhizopus arrhizus SigmaRhizopus javanicusAmano曲霉属类(Aspergillus sp.)Aspergillus niger FinnfeedsInternational，AmanoAspergillus usamii
Aspergillus oryzae Novo Nordisk毛霉菌类(Mucor sp.)Mucor javanicusMucor lipolyticus青霉菌类(Penicillium sp.)Penicillium roquefortiiAmanoPenicillium cyclopium AmanoPenicillium simplissimumPenicillium camembertiiGeotrichum candidumAmanoNeurospora crassaUstilago maydisFusarium solani细菌 洋葱伯克氏菌(BurkholderiaAmano，Fluks，cepacia***) Boehringer Mannheim假单胞菌(Pseudomonas sp.)产碱假单胞菌(Pseudomonas Genencoralcaligenes)门多萨假单胞菌 Genencor(Pseudomonas mendocina)荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)铜绿假单胞菌(Pseudomonas Amanoaeroginosa)Pseudomonas spp. FinnfeedsInternational；Karlan，CA，USA粘稠色杆菌(Chromobacterium Asahi，Tokyo，Japan；viscosum****)Biocatalysts；KarlanCA，USA；Toyo JozoShizuoka，Japan葡萄状球菌类(Staphylococcus
sp.)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)猪葡萄球菌(Staphylococcushyicus)溶脂无色杆菌(Achromobacterlipolyticum)不动杆菌(Acinetobacter)疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)杆状菌类(Bacillus sp.)*先前称为Candida cylindracea**先前称为Humicola lanuginosus***先前称为Pseudomas cepacia****C.viscosum与Burkholderia glumae相同(1)来源试验产品+文献汇编参考文献Bach，A.C.& Babayan，V.K.，1982，Medium-chain Trigfyceridesan Update，TheAmerican Journal of Clinical Nutrition，36950-962Cera，K.R.et al.，1989，Postweaning Swine Performance and Serum Profile Responsesto Supplemented Medium-chain Free Fatty Acids and Tallow，Journal of AnimalScience，67，2048-2055Chesson，A.，1994，Probiotics and other Intestinal Mediators，InPrinciples of PigScience，D.J.A.Cole，J.Wiseman & M.A.Varley，Editors，Nottingham University Press，UK，pp.197-214Corpet，D.E.，1996，Microbial Hazards for Humans of Antimicrobial Growth PromotorUse in Animal Production，Revue Médicine Vétérinaire，147851-862Decuypere，J.A.et al.，1977，Gastro-intestinal Cannulation in Pigsa Simple Techniqueallowing multiple Replacements，Journal of Animal Science，46，463-468Kabara，J.J.，1978，Fatty Acids and Derivates as Antimicrobial Agents-a Review，InThe Pharmacological Effects of Lipids，J.J.Kabara，Editor，The American Oil ChemistsAssociation，Champaign，II，USA，pp.1-14Odle，J.，1999，Medium-chain Triglyceridesa Unique Energy Source for Neonatal Pigs，Pig News and Information，2025N-32NLepine，A.J.et al.，1989，Effect of Colostrum or Medium-chain TriglycerideSupplementation on the Pattem of Plasma Glucose，Non-esterified Fatty Acids andSurvival of Neonatal Pigs，Journal of Animal Science，67，983-990Moreau，H.et al.，1988，Screening of Preduodenal Lipases in several Mammals，Biochemica Et Biophysica Acta，959，247-252Partridge，G.G.，1993，New Approaches with Pig Weaner Diets，InRecent Advances inAnimal Nutrition，P.C.Gansworthy & Cole，.J.A.，Editors.，Nottingham University Press，UK，pp.221-248Roth，F.X.& Kirchgessner，1998，Organic Acids as Feed Additives for young PigsNutritional and Gastrointestinal Effects，Journal of Animal and Feed Sciences，723-33SPSS for WINDOWS，1997，User’s Guide(Release 7.5)，SPSS Inc.，Chocogo，IL60611Van der Heyde，H.& Henderickx，H.，1963，Zur Vereinfachung der quantitativen undqualitativen Bestimmung der Bakterien unter Verwendung von＂Ringplatten＂，Zentralblatt Für Bakteriologie，I Orig.，189，224-228Van der Peet，G.F.V.，1992，Voeding van jonge Biggen，CVB-Documentatierapport N°5Wegener，H.C.et al.，1998，The Association between the Use of Antimicrobial GrowthPromoters and Development of Resistance in Pathogenic Bacteria towards GrowthPromoting and Therapeutic Antimicrobials，Journal of Animal and Feed Science，77-1权利要求
1.饲料添加剂或饲料组合物，含有至少一种含中链脂肪酸的甘油三酸酯和至少一种脂肪分解酶。
2.如权利要求1的饲料添加剂或饲料组合物，其中所述甘油三酸酯含有C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11和/或C12中链脂肪酸。
3.如权利要求1或2的饲料添加剂或饲料组合物，其中所述甘油三酸酯是天然存在的甘油三酸酯，如乳脂和椰子油。
4.如权利要求1或2的饲料添加剂或饲料组合物，其中所述甘油三酸酯是制备的甘油三酸酯组合物。
5.如权利要求1或2的饲料添加剂或饲料组合物，其中所述甘油三酸酯是由C4至C12链脂肪酸进行酯交换而制备的。
6.如权利要求1或2的饲料添加剂或饲料组合物，其中所述脂肪分解酶是脂肪酶。
7.如权利要求1或2的饲料添加剂或饲料组合物，其中所述脂肪分解酶是酯酶。
8.如权利要求1至7任一项的饲料添加剂或饲料组合物，其中所述甘油三酸酯呈天然或制备的含中链脂肪酸的甘油三酸酯组合物形态存在，所述脂肪分解酶呈市售脂肪分解酶组合物形态存在。
9.如权利要求1至8任一项的饲料添加剂或饲料组合物，其中所述甘油三酸酯组分的添加浓度为所述饲料的约0.05约20％，优选为约0.25％至10％，所述脂肪分解酶组分的添加浓度为所述饲料的约5至10000ppm，优选约100至10000ppm。
10.如权利要求1至9任一项的饲料添加剂或饲料组合物用作药物。
11.如权利要求1至9任一项的饲料添加剂或饲料组合物用作杀菌剂。
12.如权利要求1至9任一项的饲料添加剂或饲料组合物用作促生长剂。
13.如权利要求1至12任一项的动物饲料添加剂或饲料组合物用于在胃肠道控制脂解以便稳定、选择性活化和/或抑制胃肠微生物菌落。
14.如权利要求1至13任一项的用于动物生产和成双的饲料添加剂或饲料组合物，其中所述动物是早期断奶的仔猪。
15.如权利要求14的用途，其中所述生产的动物是早期断奶的仔猪。
全文摘要
本发明涉及含有中链脂肪酸(C4至C12)的甘油三酸酯(TG)与外源脂肪分解酶(酯酶或脂肪酶)相混合作为用于动物的饲料添加剂的用途,以防止和/或减轻在这时经常遇到的问题。在不使用经典但有争议的饲料添加剂的情况下,这导致了明显的生长性能的改进。
文档编号A61K31/215GK1367653SQ00811148
公开日2002年9月4日 申请日期2000年6月6日 优先权日1999年6月7日
发明者J·德库伊佩雷, N·迪里克 申请人:阿维夫有限公司, 维塔美克斯有限公司