专利名称：大环内酯类化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及大环内酯类化合物，特别是大环内酰胺大环内酯类化合物。本发明涉及游离形式以及当存在盐形式时，盐形式的式I化合物 其中R1是呈β-构型的羟基；且R2是甲基，且R3和R4当中有一个基团是乙基，另一个是甲基；或者R1是呈α-构型的氯；且R2、R3和R4当中有一个基团是乙基，其它基团是甲基；该化合物在下文中简称为“本发明化合物”。
当式I中的R1呈α-构型时，其在纸平面的上方，当R1呈β-构型时，其在纸平面的下方。R1优选是呈α-构型的氯。R3或R4，特别是R3优选为乙基。
在下文中，本发明化合物简称为如下所述的名称-当R1是羟基，且R3是乙基时21-乙基-子囊霉素；或R4是乙基时27-乙基-子囊霉素；-当R1是氯，且R2是乙基时19-乙基-ASM；或R3是乙基时21-乙基-ASM；或R4是乙基时27-乙基-ASM；即，它们分别是(1R，9S，12S，13R，14S，17R，18E，21S，23S，24R，25S，27R)-12-[(1E-2-[(1R，3R，4R)-4-羟基-3-甲氧基环己基[-1-甲基乙烯基]-17，21-二乙基-1，14-二羟基-23，25-二甲氧基-13，19，27-三甲基-11，28-二氧杂-4-氮杂三环-[22.3.1.04，9]二十八碳-18-烯-2，3，10，16-四酮；(1R，9S，12S，13R，14S，17R，18E，21S，23S，24R，25S，27R)-12-[(1E-2-[(1R，3R，4R)-4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙烯基]-17，27-二乙基-1，14-二羟基-23，25-二甲氧基-13，19，21-三甲基-11，28-二氧杂-4-氮杂三环-[22.3.1.04，9]二十八碳-18-烯-2，3，10，16-四酮；(1R，9S，12S，13R，14S，17R，18E，21S，23S，24R，25S，27R)-12-[(1E-2-[(1R，3R，4S)-4-氯-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙烯基]-17，19-二乙基-1，14-二羟基-23，25-二甲氧基-13，21，27-三甲基-11，28-二氧杂-4-氮杂三环-[22.3.1.04，9]二十八碳-18-烯-2，3，10，16-四酮；(1R，9S，12S，13R，14S，17R，18E，21S，23S，24R，25S，27R)-12-[(1E-2-[(1R，3R，4S)-4-氯-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙烯基]-17，21-二乙基-1，14-二羟基-23，25-二甲氧基-13，19，27-三甲基-11，28-二氧杂-4-氮杂三环-[22.3.1.04，9]二十八碳-18-烯-2，3，10，16-四酮；和(1R，9S，12S，13R，14S，17R，18E，21S，23S，24R，25S，27R)-12-[(1E-2-[(1R，3R，4S)-4-氯-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙烯基]-17，27-二乙基-1，14-二羟基-23，25-二甲氧基-13，19，21-三甲基-11，28-二氧杂-4-氮杂三环-[22.3.1.04，9]二十八碳-18-烯-2，3，10，1 6-四酮。
21-乙基-子囊霉素和27-乙基-子囊霉素是子囊霉素的高级同系物。19-乙基-ASM、21-乙基-ASM和27-乙基-ASM是pimecrolimus(ASM)(33-表氯-33-去氧-子囊霉素)的高级同系物。
本发明化合物可通过下述方法制得a)为了制备其中R1是呈β-构型的羟基的以上所定义的式I化合物，培养适当的微生物，并从所得培养基中分离出其中R1是呈β-构型的羟基的相应式I化合物；或者b)为了制备其中R1是呈α-构型的氯的以上所定义的式I化合物，在差向异构化作用下用氯置换其中R1是呈β-构型的羟基的相应式I化合物中的羟基，并收集游离形式以及，当存在盐形式时，盐形式的所得化合物。
本发明方法是以常规方式进行的。
在方法a)中，可使用能产生子囊霉素高级同系物，例如作为杂质产生子囊霉素高级同系物的任何产生子囊霉素的微生物株，优选吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)菌株。这样的菌株是已知的，并可得自公共保藏机构。优选使用能产生大量子囊霉素高级同系物的菌株，或者选择能以提高的产量制得子囊霉素高级同系物的培养条件。这样的菌株是已知的，并易于获得，例如吸水链霉菌子囊霉素亚种(Streptomyces hygroscopicussubsp.ascomyceticus)(例如ATCC 14891、ATCC 53855、ATCC 55087、ATCC 55276、ATCC 55558、DSM 5085)、Streptomyces tsukubaensis No.9993(FERM BP-927)、Streptomyces hygroscopicus subsp.yakushimaensisNo.7238(FERM BP-928，NRRL 18488)；或其天然或人工突变株，并且以提高的产量制备高级同系物的培养条件也是已知的，或者可方便地以其常规方式确定。方便起见，可产生或以常规方法选择表现出提高的高级同系物产量的适当突变菌株，或者可在改进的条件下进行培养，例如在培养基中使用高浓度的C4前体丁酸钠。
方法b)是在同时或伴随的差向异构化作用下的取代反应。其是按照例如EP 427680中描述的方法进行的。其优选在惰性溶剂例如四氢呋喃或甲苯中进行。优选地，使用四氯甲烷或N-氯琥珀酰亚胺，在三苯基膦存在下，方便起见在碱性介质例如可力丁中进行该反应。
可依据已知方法将所得本发明化合物从培养物或反应混合物中分离出来并纯化。然而，已经惊奇地发现，在色谱纯化期间使用手性固定相例如Kromasil，可大大促进特别是其中R1是氯的本发明化合物的分离。
原料和中间体化合物是已知的，或者可依据已知方法或与已知方法类似的方法或类似于实施例所述的方法制得。
下列实施例举例说明了本发明。这些实施例是非限定性的。所有温度都是以摄氏度为单位。除非另有说明，否则化合物都是游离形式的。使用下列缩写HPLC高效液相色谱法I.D.内径THF 四氢呋喃tlc 薄层色谱法％ 百分比w/w实施例121-乙基-子囊霉素和27-乙基-子囊霉素[方法a)]a)按照EP 184162实施例4中描述的方法，通过用链霉菌菌株(ATCC14891)发酵以半工业(kg)规模制得子囊霉素粗产物，并通过逆流萃取进行部分纯化(Res.Discl.402[1997年8月]725-726)。获得了粗产物，其中含有35％子囊霉素、15％21-乙基-子囊霉素和10％27-乙基-子囊霉素。在硅胶过滤步骤中进一步纯化该物质，使用乙酸异丙酯/正庚烷7/3(v/v)作为洗脱剂，以除去子囊霉素。所获得的粗产物含有约25％21-乙基-子囊霉素和15％27-乙基-子囊霉素。b)将1g得自以上步骤a)的21-乙基-子囊霉素粗产物溶解在3.5ml乙酸异丙酯/庚烷7/3(v/v)中，并将该进料溶液注射到含有300g硅胶[Kromasil100-5 SIL(Eka Nobel)]作为固定相的制备柱(36cm×5cm I.D.)上。在室温使用乙酸异丙酯/庚烷7/3(v/v)作为流动相洗脱该混合物，流速为100ml/分钟。在245nm进行UV检测，子囊霉素衍生物在34.5分钟后洗脱，以1.1分钟的间隔收集级分。21-乙基-子囊霉素收集在级分13-28中。收集合并的级分，并在40℃真空蒸发至干。进行13次制备色谱运行得到1g以上的本标题化合物21-乙基-子囊霉素FAB-MS以降序排列的碎片812 [M+Li]-，602，794，425；2D-1H-NMR21-乙基＝1.21ppm，1.50ppm(亚甲基)和0.87ppm(甲基)。c)按照以上步骤b)所述处理1g得自以上步骤a)的27-乙基-子囊霉素粗产物，所不同的是收集共洗脱级分1-7。收集合并的级分并在40℃真空蒸发至干。将379mg所得残余物溶解在30ml正己烷/乙醇/甲醇90/5/5(v/v)中，并将该进料溶液注射到含有2.0kg直链淀粉三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(包衣在硅胶上)(Chiralpak-AD)的制备柱(40cm×10cm I.D.)上。在室温使用正己烷/乙醇/甲醇90/5/5(v/v)作为流动相进行洗脱，流速为150ml/分钟。在210nM进行UV检测。27-乙基-子囊霉素在60-80分钟之间洗脱下来。收集含有27-乙基-子囊霉素的级分，并在40℃真空蒸发至干得到120mg本标题化合物27-乙基-子囊霉素FAB-MS以降序排列的碎片828.6[M+Na]+，508.3，423.0，563.6；2D-1H-NMR27-乙基＝1.59ppm，1.19ppm(亚甲基)和0.92ppm(甲基)。
本发明化合物最初分别是在子囊霉素和ASM的大批量制备期间作为杂质检测出来的。对其进行了鉴定和特征确定后出乎意料地发现，它们具有显著的、强度令人惊奇的药理活性。因此这意味着它们可用作药物。具体地讲，它们具有免疫抑制和抗过度增殖以及抗炎活性。
抗炎活性可例如依据下述测试方法确定噁唑酮引起的过敏性接触性皮炎(小鼠)[F.M.Dietrich和R.Hess，Int.Arch.Allergy 38(1970)246-259]以0.1mM溶液单次局部施用后，本发明化合物使炎性肿胀抑制了约10％-约50％，以1mM溶液单次局部施用后，抑制了约40％-约60％。
免疫抑制和抗过度增殖活性可例如依据下述测试方法确定树状细胞对辅助T细胞克隆的变应原介导的刺激[Br.J.Dermatol.141(1999)264-273]本发明化合物以下列剂量抑制刺激(IC50)对于子囊霉素同系物，以约0.1nM-约10nM、特别是约0.1nM-约1nM的剂量，对于ASM类似物，以约1nM-约10nM的剂量。
在用上述辅助T细胞克隆和单核细胞衍生的树状细胞进行的另外的测试中进一步证实了该活性CD4+抗原特异性人辅助T细胞克隆(TCC)是通过有限稀释培养建立的(Van Reijsen T.C.等人，J.Allergy Clin.Immunol.90184-193)。TCC识别源自室内尘螨欧洲家刺皮螨(Dermatophagoides pteronyssinus)(Dpt)的主要变应原Der p1、与MHC II类限制分子HLA-DPw4有关的肽(Baselmanns P.J.等人，Human Immunol.61789-798)。为了获得足够数量的用于测定的细胞，通过用固定的抗-CD3单克隆抗体(Leu-4，BectonDickinson，San Jose，CA，USA)激活并在补充rIL-2和rhIL-4(均为50U/ml)的完全培养基中培养来在体外扩增TCC(Van Reijsen等人，上文)。
人单核细胞衍生的树状细胞(M-DC)是通过在RPMI 1640培养基中以7×105个细胞/ml的细胞密度培养而由纯化的单核细胞产生的。给培养基补充15％FCS和rh-GM-CSF(300U/ml)以及rh-IL-4(100U/ml)。在培养的第7天，90-95％的细胞表达M-DC表型(通过流式细胞计量术证实)，并使用它们进行TCC的抗原特异性刺激，所述TCC在最后一次用抗原或抗-CD3 mAb攻击至少14天后使用，以确保细胞的静息状态。为了进行抗原特异性刺激，将M-DC在含有50μg/ml Dpt提取物(ARTU Biologicals NV，Lelystad，The Netherlands)的培养基中培养过夜(至少12小时)。所用的主要抗原Der p1的含量为约18.5μg/mg Dpt提取物。将M-DC洗涤2次，并将50μl最终数目的M-DC的等分试样加到在100μl培养基中含有5×104个T细胞的各孔中，达到M-DC/T细胞的比例为1/50。之后立即加入50μl4倍终浓度的测试化合物的等分试样。每份样本以一式四份的方式进行测试。将测试化合物溶解在乙醇中以提供1mM的贮备液并在完全培养基中进行1/1000的稀释，该培养基也用于制备最终的测试化合物的稀释液。在4天培养期的最后16个小时期间，通过用1μCi/20μl/孔的(甲基-)3H-胸苷(Amersham，U.K.)产生脉冲来测定T细胞增殖。
获得了如下IC50值表化合物 IC50(nM)21-乙基-子囊霉素 0.3327-乙基-子囊霉素 0.8819-乙基-ASM 6.821-乙基-ASM 1.627-乙基-ASM 4.6因此，游离形式以及当存在时可药用盐形式的本发明化合物可作为抗炎剂以及免疫抑制剂和抗增殖剂，用于预防和治疗炎性病症以及需要免疫抑制的病症，例如a)用于治疗炎性和过度增殖性皮肤病，例如牛皮癣、特应性皮炎、接触性皮炎和其它湿疹性皮肤病、皮脂溢性皮炎、扁平苔癣、天疱疮、大疱性类天疱疮、大疱性表皮松解、血管炎、红斑、皮肤嗜酸粒细胞增多、红斑狼疮和痤疮；b)用于预防和治疗过敏性疾病例如外因性哮喘、鼻炎、结膜炎、特应性湿疹、荨麻疹/血管性水肿、食物/药物过敏和过敏性反应；c)用于预防和治疗-在器官或组织移植例如心脏、肾、肝脏、骨髓和皮肤移植情境中的排斥反应，-移植物抗宿主病，例如骨髓移植后的移植物抗宿主病，-自身免疫性疾病例如类风湿性关节炎、系流性红斑狼疮、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、多发性硬化、重症肌无力、I型糖尿病和眼色素层炎，-免疫学介导的病症的皮肤症状；-肠疾病；和d)斑形脱发。
本发明化合物可系统给药或局部给药。对于上述适应征，合适的剂量当然将根据例如宿主、给药方式以及所治疗的病症的性质和严重程度而改变。然而，一般情况下，以约0.15mg/kg-约1.5mg/kg动物体重的日剂量进行系统给药可获得满意结果。在较大的哺乳动物中，合适的日剂量为约0.01mg-约100mg，通常分成每天最多4次进行给药或者以延迟释放的形式给药。对于局部应用，以约1％-约3％重量活性物质的浓度局部施用、每天施用数次例如2-5次可获得满意结果。合适的盖仑剂型的实例有洗剂、凝胶剂、霜剂、喷雾剂和溶液。
本发明化合物可通过任何常规途径给药，特别是肠道给药，例如口服给药，如以片剂或胶囊的形式口服给药，或局部给药，例如以洗剂、凝胶剂、霜剂、喷雾剂、眼用或鼻用溶液或气雾剂的形式局部给药以局部治疗皮肤和粘膜例如眼睛、呼吸道、阴道、口腔和鼻腔。
包含游离形式或当盐形式存在时的可药用盐形式的本发明化合物和至少一种可药用载体或稀释剂的药物组合物例如局部给药用药物组合物可通过与可药用载体或稀释剂混合而以常规方法制得。单位剂型包含例如约0.0025mg-约50mg活性物质。
局部给药是例如对皮肤给药。另一局部给药形式是对眼睛给药，例如用于预防或治疗免疫学介导的眼睛病症，例如自身免疫性疾病，例如眼色素层炎、角膜成形术和慢性角膜炎；过敏性病症，例如春季结膜炎；炎性病症和角膜移植；和青光眼；这样的给药是通过将在可药用眼科载体中的游离形式或当盐形式存在时的可药用盐形式的本发明化合物局部施用到眼睛表面上来进行的。
眼科载体是这样的，其可使化合物保持与眼睛表面接触足够长时间，以使得化合物穿透眼睛的角膜和内部区域例如前房、后房、玻璃体、水状液、玻璃体液、角膜、虹膜/睫状体、晶状体、脉络膜/视网膜和巩膜。可药用眼科载体可以是例如软膏、植物油或包封材料。
虽然抗炎和免疫抑制以及抗增殖活性是本发明化合物的主要活性，但是它们还具有一定程度的在下述方面的活性提高对化疗药物治疗的敏感性或者提高化疗药物治疗的效力。该活性可例如依据EP 360760中描述的测试方法来确定。
因此，本发明化合物可用于逆转不同类型的化疗药物抗性，例如获得性或先天性化疗药物抗性，或者提高对给药治疗的敏感性，例如在抗肿瘤或细胞抑制药物治疗中用作降低常规化疗剂量水平的手段，用作降低整个药物毒性的手段，以及尤其是用作逆转或减轻对化疗的抗性—包括固有的和获得性抗性的手段。
本发明还涉及游离形式或当盐形式存在时可药用盐形式的本发明化合物作为药物的应用；用作药物的本发明化合物；本发明化合物在制备用于预防或治疗炎性病症或需要免疫抑制的病症的药物中的应用；制备药物组合物的方法，包括将本发明化合物与至少一种可药用载体或稀释剂混合；和预防或治疗炎性病症或需要免疫抑制的病症的方法，包括给需要这样的治疗的个体施用治疗有效量的本发明化合物。
本发明化合物可以作为单独的活性剂给药，或者与一种或多种其它相容的药物活性剂例如大环内酰胺大环内酯，优选子囊霉素衍生物例如子囊霉素本身或ASM联合或组合施用。
本发明还涉及药物组合物，其中含有游离形式或当盐形式存在时可药用盐形式的本发明化合物和至少一种可药用载体或稀释剂，其中本发明化合物选择性地与一种或多种其它相容的药物活性剂例如大环内酰胺大环内酯，优选子囊霉素衍生物例如子囊霉素本身或ASM联合或组合在一起。本发明化合物一般可以以不同的量存在于这样的联合或组合中，例如其量为约99％-约1％，或约90％-约10％，或者当与大环内酰胺大环内酯，优选子囊霉素衍生物，尤其是子囊霉素本身或ASM，特别是ASM联合或组合使用时，由于具有类似的药理学作用，其量为约99.99％-约0.01％，例如约99.9％-约0.1％，或约95％-约5％，其中所述百分比是各活性剂的重量百分比。
适宜的子囊霉素衍生物描述在例如EP 184162、EP 315978、EP323042、EP 423714、EP 427680、EP 465426、EP 474126、WO 91/13889、WO 91/19495、EP 484936、EP 523088、EP 532089、EP 569337、EP 626385、WO 93/5059和WO 97/8182中；特别是-子囊霉素本身；-它克莫司(FK506；PrograR)；-咪唑基甲氧基子囊霉素(WO 97/8182，在实施例1中，并作为式I化合物描述)；-32-O-(1-羟基乙基吲哚-5-基)子囊霉素(L-732531)(Transplantation 6510-18，18-26，笫11页，
图1)；和-(32-去氧，32-表-N1-四唑基)子囊霉素(ABT-281)(J.Invest.Dermatol.12729-738，第730页，图1)；优选{1R，5Z，9S，12S-[1E-(1R，3R，4R)]，13R，14S，17R，18E，21S，23S，24R，25S，27R}-17-乙基-1，14-二羟基-12-[2-(4-羟基-3-甲氧基环己基)-1-甲基乙烯基]-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧杂-4-氮杂三环[22.3.1.04，9]二十八碳-5，18-二烯-2，3，10，16-四酮(EP 626385中的实施例8)；{1E-(1R，3R，4R)] 1R，4S，5R，6S，9R，10E，13S，15S，16R，17S，19S，20S}-9-乙基-6，16，20-三羟基-4-[2-(4-羟基-3-甲氧基环己基)-1-甲基乙烯基]-15，17-二甲氧基-5，11，13，19-四甲基-3-氧杂-22-氮杂三环[18.6.1.01，22]二十七碳-10-烯-2，8，21，27-四酮(EP 569337中的实施例6d和7l)；尤其是pimecrolimus(ASM)(EP 427680中的实施例66a中；33-表氯，33-去氧子囊霉素)。
权利要求
1.游离形式或当存在盐形式时，盐形式的式I化合物 其中R1是呈β-构型的羟基；且R2是甲基，且R3和R4当中有一个基团是乙基，另一个是甲基；或者R1是呈α-构型的氯；且R2、R3和R4当中有一个基团是乙基，其它基团是甲基。
2.制备权利要求1所述化合物的方法，包括a)为了制备其中R1是呈β-构型的羟基的权利要求1所定义的式I化合物，培养适当的微生物，并从所得培养基中分离出其中R1是呈β-构型的羟基的相应式I化合物；或者b)为了制备其中R1是呈α-构型的氯的权利要求1所定义的式I化合物，在差向异构化作用下用氯置换其中R1是呈β-构型的羟基的相应式I化合物中的羟基，并收集游离形式或当存在盐形式时的盐形式的所得化合物。
3.包含游离形式或当存在盐形式时的可药用盐形式的权利要求1所定义的化合物和至少一种可药用载体或稀释剂的药物组合物。
4.权利要求3所述的组合物，其中所述化合物与其它相容的药物活性剂联合或组合在一起。
5.权利要求4所述的组合物，其中所述化合物与ASM联合或组合在一起。
6.制备权利要求3所述药物组合物方法，包括将所述化合物与至少一种可药用载体或稀释剂混合。
7.用作药物的游离形式或当存在盐形式时可药用盐形式的权利要求1所定义的化合物。
8.用于预防或治疗炎性病症或需要免疫抑制的病症的游离形式或当存在盐形式时可药用盐形式的权利要求所定义1的化合物。
9.游离形式或当存在盐形式时可药用盐形式的权利要求所定义1的化合物在制备用于预防或治疗炎性病症或需要免疫抑制的病症的药物中的应用。
10.预防或治疗炎性病症或需要免疫抑制的病症的方法，包括给需要这样的治疗的个体施用治疗有效量的游离形式或当存在盐形式时可药用盐形式的权利要求1所定义的化合物。
全文摘要
式(I)化合物，其中的取代基具有不同的含义，由此R
文档编号A61P25/28GK1430620SQ01809832
公开日2003年7月16日 申请日期2001年5月21日 优先权日2000年5月22日
发明者G·弗莱斯纳, H·黑克尔, E·屈斯特斯, G·佩恩 申请人:诺瓦提斯公司